微生物檢驗學之衣原體及檢驗

衣原體及檢驗一、概述（一）概念 衣原體是一群體積較小，能通過細菌濾器，細胞內(nèi)專性寄生，并有獨特發(fā)育周期的原核細胞型微生物。由于它具有一些與細菌類似的生物學特性，現(xiàn)歸屬于廣義的細菌范疇。（二）分類與命名1.傳統(tǒng)分類法 按第九版Bergey細菌學分類手冊，衣原體屬于衣原體目、衣原體科、衣原體屬。根據(jù)衣原體的抗原構(gòu)造和DNA同源性的特點，將衣原體屬分為四個種，包括沙眼衣原體、肺炎衣原體、鸚鵡熱衣原體和家畜衣原體。能引起人類致病的主要是前三種。沙眼衣原體可分三個生物亞種，即沙眼生物亞種、性病淋巴肉芽腫生物亞種（LGV）及鼠生物亞種。其中沙眼亞種又分AK14個血清型；LGV生物亞種又分4個血清型L1、L2、L2a和L3。前兩個亞種對人類有致病性，鼠亞種則不侵犯人類。肺炎衣原體是衣原體屬中的一個新種。只有一個血清型，即TWAR組。2.分子生物學特性分類法 該法主要是從衣原體種系發(fā)生上分析和評價傳統(tǒng)分類法。二、生物學性狀1.發(fā)育繁殖周期與形態(tài)染色 衣原體在宿主細胞內(nèi)生長繁殖有獨特的發(fā)育周期，可見到兩種形態(tài)結(jié)構(gòu)不同的顆粒。（1）原體：呈球形或橢圓形，直徑約0.3m，外有胞壁，內(nèi)含致密的核質(zhì)，為成熟的衣原體。吉姆薩染色呈紫色，Macchiavello染色呈紅色。在細胞外較為穩(wěn)定，無繁殖能力，但有高度的感染性。（2）網(wǎng)狀體又稱始體：呈球形或橢圓形，直徑0.51m，無胞壁，胞漿內(nèi)無致密的核質(zhì)，而有纖細的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。吉姆薩染色和Macchiavello染色均呈藍色。為衣原體發(fā)育周期中的繁殖型，代謝活潑，不能自胞外存活，無感染性。衣原體的發(fā)育周期：原體當與易感細胞表面的特異受體吸附后，通過細胞的吞飲作用進入細胞，形成吞噬小泡。原體在泡內(nèi)變軟，增大為網(wǎng)狀體。約8小時后，網(wǎng)狀體在空泡內(nèi)以二分裂方式繁殖、聚集，構(gòu)成各種形狀的包涵體。感染1824小時后，網(wǎng)狀體濃縮形成具有堅韌細胞壁的原體，最后隨宿主細胞破裂而釋出，再感染新的易感細胞，開始新的發(fā)育周期。每個發(fā)育周期約需4072小時。2.抗原成分 衣原體的抗原性相當復雜，有屬、種、型等特異性抗原。（1）屬特異性抗原：衣原體細胞壁LPS為屬特異性補體結(jié)合抗原。其與革蘭陰性菌LPS結(jié)構(gòu)不同，缺乏O-多糖和部分核心多糖，無典型內(nèi)毒素生物學活性。長期應用于衣原體血清學診斷。（2）種特異性抗原：主要位于外膜蛋白（MOMP）上。（3）型特異性抗原：也位于MOMP上，用單克隆抗體作微量免疫熒光試驗可識別衣原體各血清型。3.分離培養(yǎng)特性 衣原體專性細胞內(nèi)寄生。絕大多數(shù)能在68日齡雞胚卵黃囊中生長繁殖，并可在卵黃囊膜中找到包涵體、原體和始體顆粒，也可在傳代細胞（如HeLa-299和Mc-Coy等細胞株）中培養(yǎng)。4.抵抗力 衣原體抵抗力弱，沙眼衣原體感染材料在3537條件下，經(jīng)48小時左右即失去活性。不耐熱，加熱50經(jīng)30分鐘或5660 510分鐘可殺死，但耐寒，在冰凍條件下可存活數(shù)年。鸚鵡熱衣原體比沙眼衣原體穩(wěn)定。對四環(huán)素、青霉素、紅霉素、螺旋霉素、利福平較敏感。三、臨床意義人類衣原體病主要包括：（一）沙眼衣原體1.沙眼 由沙眼生物亞種A、B、Ba和C四個血清型引起。主要通過眼-眼或眼-手-眼（常通過公用毛巾等媒介）的途徑進行直接或間接接觸傳播。2.包涵體結(jié)膜炎 由沙眼生物亞種B、Ba、D、Da、E、F、G、H、I、Ia、J、K血清型引起。包括嬰兒及成人兩類。嬰兒經(jīng)產(chǎn)道時該亞種可致包涵體結(jié)膜炎和嬰幼兒肺炎。3.泌尿生殖道感染 主要由沙眼生物亞種D-K血清型引起，是經(jīng)性接觸傳播引起的非淋菌性泌尿生殖道感染的主要病原。衣原體感染是男性尿道炎最常見的病因之一。未經(jīng)治療者多數(shù)轉(zhuǎn)為慢性，周期性加重，或可合并附睪炎、前列腺炎等。在女性可引起尿道炎、宮頸炎、陰道炎、盆腔炎，也可與婦女不孕癥有關。衣原體常與淋病奈瑟菌混合感染，淋病奈瑟菌對衣原體的繁殖起激活和促進作用。4.性病淋巴肉芽腫 由沙眼衣原體LGV生物亞種（L1、L2、L2a、L3）血清型引起，主要通過性接觸傳播。引起以化膿性腹股溝淋巴結(jié)炎為特征的性病，又稱第四性病。主要侵犯淋巴組織，女性以累及會陰、肛門、直腸及盆腔淋巴結(jié)多見，男性以累及腹股溝淋巴結(jié)為常見，發(fā)生化膿性炎癥和慢性肉芽腫，有些可形成瘺管。（二）鸚鵡熱衣原體 主要引起鳥類或家禽感染，由感染該衣原體的鳥類等動物的糞便污染環(huán)境，以氣溶膠形式傳給人類。使人類發(fā)生上呼吸道感染、肺炎和毒血癥。典型臨床表現(xiàn)為非典型肺炎。也有引起心內(nèi)膜炎的報道。（三）肺炎衣原體 其傳播方式主要是人與人之間經(jīng)飛沫或呼吸道分泌物傳播。引起青少年急性呼吸道感染，以肺炎為主，?？沙实胤叫?、散發(fā)性流行，也可引起支氣管炎、咽炎等。該衣原體也可引起慢性感染，其與急性心肌梗死和慢性冠心病的關系越來越引起注意。四、微生物檢驗1.標本采集與處理（1）沙眼衣原體：沙眼和包涵體結(jié)膜炎的患者，取眼穹隆部及瞼結(jié)膜病灶作刮片。子宮頸炎取子宮頸刮片上皮細胞或分泌物作涂片。標本置于運送培養(yǎng)基中送檢，常用的運送培養(yǎng)基為2SP培養(yǎng)基。性病淋巴肉芽腫患者可取腹股溝淋巴結(jié)膿液，也可取直腸拭子或活檢材料送檢。（2）鸚鵡熱衣原體：采取患者血液、痰液或咽喉含漱液，痰標本用約210倍的滅菌肉湯或組織培養(yǎng)液洗脫附著在標本上的病原體，用力振搖，制成懸液，置室溫12小時后，低速離心取上清液接種。尸檢材料取肝、脾、肺等組織，也可采腹腔和心包滲出液。（3）肺炎衣原體：一般利用拭子經(jīng)鼻前庭插入鼻咽部，旋轉(zhuǎn)后取出，利用轉(zhuǎn)運培養(yǎng)基，冷藏送檢。也可采集氣管內(nèi)痰液或肺泡灌洗液。要求24小時內(nèi)接種或置-70保存。2.直接顯微鏡檢查 染色鏡檢，尋找上皮細胞細胞質(zhì)內(nèi)的包涵體。包涵體即指在易感細胞內(nèi)含增殖的始體和子代原體的空泡。根據(jù)包涵體的形態(tài)、在細胞內(nèi)的位置及染色性等特性，對鑒別衣原體有意義。（1）吉姆薩（Giemsa）染色：原體呈紫紅色，始體呈藍色，包涵體呈深紫色。沙眼衣原體包涵體密度低，呈空泡形。鸚鵡熱衣原體和肺炎衣原體包涵體呈深密度的卵圓形，肺炎衣原體在HeLa細胞中的包涵體形態(tài)與鸚鵡熱衣原體十分相似，但不像鸚鵡熱衣原體具有多形性。（2）碘液染色：標本經(jīng)甲醛固定后，用Lugol碘液染10分鐘，水洗后鏡檢。因包涵體的基質(zhì)含有豐富的糖原，可被碘液染成深褐色，而細胞的其他部分呈黃色。沙眼衣原體含糖原，碘液染色陽性。鸚鵡熱衣原體和肺炎衣原體碘液染色陰性。（3）可利用抗LPS單抗進行直接法熒光抗體染色檢測上皮細胞內(nèi)的衣原體抗原。3.酶免法檢測抗原 可檢測臨床標本中的可溶性抗原。4.核酸檢測 按MOPO基因序列或其他具有種、型特異性的核酸片段，構(gòu)建特異性引物或探針，利用PCR、核酸探針技術進行檢測。按16SrRNA基因序列設計引物一般具有屬特異性。5.分離培養(yǎng) 各種衣原體均可在雞胚卵黃囊和組織細胞內(nèi)生長繁殖，鸚鵡熱衣原體常用小鼠分離。（1）雞胚卵黃囊接種：將檢查標本加適當抗生素（如鏈霉素等）處理后接種于雞胚卵黃囊分離培養(yǎng)。（2）細胞培養(yǎng)：目前常用的細胞有兩種：即經(jīng)X線照射的McCoy細胞和HeLa細胞。不同種的衣原體有各自最適合的培養(yǎng)細胞系。沙眼衣原體多用McCoy細胞，鸚鵡熱衣原體適合用Hela 229細胞系進行培養(yǎng)。肺炎衣原體適合用HEP-2和HL細胞系進行培養(yǎng)。為了達到較好的培養(yǎng)效果，可對細胞系進行一定處理，可以用DEAE葡聚糖預處理，以便增加分離率，也可以用細胞生長抑制劑，抑制宿主細胞生長，以利于衣原體的分離培養(yǎng)。（3）小白鼠接種：小白鼠對不同種衣原體的敏感性不同，對沙眼衣原體不敏感，主要用于鸚鵡熱衣原體的分離。用小鼠腹腔、顱內(nèi)或滴鼻接種。6.檢測抗體 用補體結(jié)合試驗、微量免疫熒光法、酶免法檢測抗體。五、治療原則 四環(huán)素類及大環(huán)內(nèi)酯類對衣原體有較高的活性，青霉素類、磺胺、氧氟沙星以及利福平等也有一定的活性，磺胺對肺炎衣原體無效。孕婦、哺乳期婦女以及兒童禁用四環(huán)素而首選紅霉素?！纠}】下列何種微生物能通過濾器A.軍團菌B.分枝結(jié)核桿菌C.衣原體D.肺炎克雷伯桿菌E.流感嗜血桿菌正確答案C答案解析衣原體是一群體積較小，能通過細菌濾器，細胞內(nèi)專性寄生，并有獨特發(fā)育周期的原核細胞型微生物?！纠}】下列說法正確的是A.衣原體與病毒結(jié)構(gòu)相似B.衣原體可引起非典型肺炎C.衣原體對抗生素不敏感D.衣原體無自己的酶系統(tǒng)E.衣原體不能通過濾器正確答案B答案解析人類衣原體病主要包括沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體和肺炎衣原體。其中，鸚鵡熱衣原體主要引起鳥類或家禽感染，由感染該衣原體的鳥類等動物的糞便污染環(huán)境，以氣溶膠形式傳給人。使人發(fā)生上呼吸道感染、肺炎和毒血癥。典型臨