病毒鑒定的方法有哪些

1、.病毒鑒定的方法有哪些？從培養(yǎng)的細(xì)胞中分離病毒，然后采用免疫熒光和分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行病毒核酸檢測已被成功地用于病毒的鑒定。目前最常用的病毒定量檢測方法有以下三大類：用于病毒感染力檢測的技術(shù)，如病毒空斑形成試驗，半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量TCID50測定和免疫熒光等；病毒核酸和病毒蛋白檢測技術(shù)，如實時定量多聚酶鏈反應(yīng)（qPCR），免疫印跡，免疫沉淀，酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）和血凝試驗等；還有就是那些直接對病毒顆粒進(jìn)行計數(shù)的方法，如流式細(xì)胞分析或透射電鏡技術(shù)。病毒檢測方法的局限性病毒鑒定方法1. 培養(yǎng)細(xì)胞的顯微學(xué)觀察材料和儀器細(xì)胞生長培養(yǎng)基：含10% FBS(胎牛血清), 4-6 mM Gluta

2、mine（谷氨酰胺）的高葡萄糖DMEM，若有需要可加入青霉素，鏈霉素，慶大霉素，兩性霉素等維持培養(yǎng)基：上述新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基，但血清FBS濃度減少至為2%宿主細(xì)胞：鋪滿單層細(xì)胞的8孔培養(yǎng)腔室玻片（chamber slides）PBS磷酸緩沖液Bouins固定液吉姆薩（Giemsa）緩沖液吉姆薩（Giemsa）染色液丙酮，丙酮：二甲苯（2:1），丙酮：二甲苯（1:2），二甲苯中性樹膠移液槍頭 (10 到100 微升)移液管生物安全柜（超凈臺）二氧化碳培養(yǎng)箱倒置顯微鏡實驗方案接種宿主細(xì)胞至Chamber Slides：選擇合適的細(xì)胞接種密度（比如8-孔Chamber Slides，接種30,000細(xì)

3、胞/孔），培養(yǎng)基為細(xì)胞生長培養(yǎng)基（10%FBS-DMEM）。輕輕地前后左右搖晃chamber slides使細(xì)胞分布均勻。將細(xì)胞置培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，第二天，顯微鏡下觀察細(xì)胞確認(rèn)細(xì)胞是否分布均勻并達(dá)到80%以上的融合度。制備不同稀釋度的病毒液：標(biāo)記6支無菌離心管，第1管加入990 l細(xì)胞生長培養(yǎng)基，剩下5管加入900l細(xì)胞生長培養(yǎng)基。按以下方法進(jìn)行梯度稀釋：在第1管中加入10 l病毒原液（稀釋度1:100）充分混勻，然后從第1管吸100 l至第2管中混勻，依次類推，進(jìn)行10倍梯度稀釋。管1至管6的稀釋度分別為 10-3 到 10-7。感染細(xì)胞：吸去培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，每孔加入0.5 mL維持培養(yǎng)液（

4、2%FBS-DMEM），再加入100 l不同稀釋度（10-2 至 10-7稀釋）的病毒液至其中一孔，留一孔不加作為空白對照。將細(xì)胞置二氧化碳培養(yǎng)箱37oC 或 34oC 培養(yǎng)1-4周，追蹤觀察致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）發(fā)生情況。吉姆薩染色：一旦觀察到細(xì)胞病變效應(yīng)，輕輕地用PBS將細(xì)胞洗3次，每次5min，然后加入Bouins固定液固定10 min。用吉姆薩緩沖液洗3次，然和加入Giemsa染液染色1 h，再用吉姆薩緩沖液清洗后依次用丙酮處理15s，2:1的丙酮-二甲苯處理30s，1:2的丙酮-二甲苯處理30s，最后用二甲苯處理10 min緊接著用中性樹膠封片。顯微鏡下觀察CPE，包涵體，細(xì)胞融合

5、及病毒空泡形成情況。病毒感染細(xì)胞后形成的CPE圖片范例可以在很多圖譜，網(wǎng)站和博客上找到，例如ASM Microbe Library2.免疫熒光(IF)檢測方法材料和儀器細(xì)胞生長培養(yǎng)基：含10%FBS(胎牛血清), 4-6mM Glutamine（谷氨酰胺）的高葡萄糖DMEM，若有需要可加入青霉素，鏈霉素，慶大霉素，兩性霉素等宿主細(xì)胞：鋪滿單層細(xì)胞的8孔培養(yǎng)腔室玻片（chamber slides）PBS磷酸緩沖液一抗FITC標(biāo)記的二抗細(xì)胞核染料DAPI5-4 %多聚甲醛（PFA，pH7.4），或者甲醇移液槍頭 (10 到100 微升)離心管生物安全柜（超凈臺）二氧化碳培養(yǎng)箱熒光顯微鏡實驗方案接種

6、宿主細(xì)胞至Chamber Slides：選擇合適的細(xì)胞接種密度（比如8-孔Chamber Slides，接種30,000細(xì)胞/孔），培養(yǎng)基為細(xì)胞生長培養(yǎng)基（10%FBS-DMEM）。輕輕地前后左右搖晃chamber slides使細(xì)胞分布均勻。將細(xì)胞置培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，第二天，顯微鏡下觀察細(xì)胞確認(rèn)細(xì)胞是否分布均勻并達(dá)到80%以上的融合度。病毒感染：每孔細(xì)胞加0.1 mL病毒儲存液，留一孔不加作為陰性對照。將細(xì)胞放回CO2 培養(yǎng)箱，37C 或 34C 培養(yǎng)48h。免疫熒光染色觀察：病毒感染48h后，吸去培養(yǎng)液，將細(xì)胞用預(yù)冷的甲醇固定5min（也可用新鮮制備的4%多聚甲醛固定）后，用含0.2% tr

7、iton X的PBS室溫破膜5min。將細(xì)胞用PBS清洗后，加入推薦濃度的一抗孵育2h，PBS清洗5遍，然后再加入熒光（Alexa fluor 488 或FITC）標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育，PBS清洗5遍，加入DAPI染細(xì)胞核，在相差及熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。3.分子學(xué)方法用實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（Real-time RT-PCR）來檢測流感病毒比終點檢測方法更為快捷，且敏感度跟細(xì)胞培養(yǎng)法相當(dāng)甚至更佳用分子技術(shù)從臨床樣本中直接對病毒基因組進(jìn)行鑒定是21世紀(jì)的重大發(fā)現(xiàn)之一。核酸擴(kuò)增技術(shù)包括PCR、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)和勞倫斯利弗莫爾微生物檢測陣列(LMDA)等都無疑是快速檢測和鑒定大多數(shù)已知人類病毒的領(lǐng)先技術(shù)。PCR可以在 體外 將DNA序列的一段特定區(qū)域擴(kuò)增 106倍，因此是一種極其敏感的檢測手段。PCR還可以用于病毒RNA的鑒定，只需先將RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA，然后再進(jìn)行PCR分析，這一方法被稱之為逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）。采用特異性的引物鑒定甲型流感病毒。M：Marker，陽性對照（