基因工程實(shí)驗指導(dǎo)書

1、實(shí)驗項目 重組質(zhì)粒DNA的提取、酶切及瓊脂糖凝膠電泳檢測實(shí)驗項目類型：綜合性所屬課程名稱：基因工程實(shí)驗計劃學(xué)時：8學(xué)時一、實(shí)驗?zāi)康膶W(xué)會最常用的小量制備質(zhì)粒DNA的堿裂解方法。學(xué)會用酶切法篩選重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功的克隆菌。二、實(shí)驗原理1、提取質(zhì)粒原理 根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離。在pH12.012.5這個狹窄的范圍內(nèi)，線性DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性。盡管在這項的條件下共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA也會變性，但兩條互補(bǔ)鏈彼此互相盤繞，仍會緊密結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液使pH恢復(fù)中性時，共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA復(fù)性快，而線性的染色體DNA復(fù)性緩慢，經(jīng)過離心與

2、蛋白質(zhì)和大分子RNA一起沉淀下去。2、質(zhì)粒DNA的酶切鑒定原理利用轉(zhuǎn)化后宿主菌所獲得的抗菌素抗性性狀篩選出獲得質(zhì)粒的菌落克隆。再從這些菌落中鑒定出質(zhì)粒上帶有外源基因插入片斷的克隆菌落。三、實(shí)驗材料與儀器1、儀器 超凈工作臺，接種環(huán)，酒精燈，臺式離心機(jī)，旋渦混合器，微量移液取樣器，1.5ml微量離心管，恒溫?fù)u床，搖菌試管，雙面微量離心管架，試管架，標(biāo)簽紙，磁力攪拌機(jī)。2、試劑 pGEM-T-AT8載體菌，LB培養(yǎng)基1000ml（含100ug/ml氨芐青霉素），葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液 I），NaOH/SDS溶液(溶液 II)，KAc溶液（pH4.8）(溶液 III)，RNa

3、se A，95%乙醇，70%乙醇，TE buffer（pH8.0）。EcoR I，Xba I， Sac I ，Xho I，內(nèi)切酶緩沖液（10），10電泳加樣緩沖四、操作步驟1、實(shí)驗準(zhǔn)備 氨芐青霉素儲存液（無菌水配制5mg/ml，分裝后-20C保存），配制LB培養(yǎng)基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加200mL dd water 攪拌完全溶解，用約200mL 5N NaOH調(diào)pH至7.0，加dd water至1L，121C 20min滅菌）；溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）；溶液II（0.2

4、mol/L NaOH，1% SDS）；溶液III（60mL 5mol/L Kac，加冰乙酸調(diào)pH4.8，補(bǔ)dd water至100ml），70%乙醇（-20C保存），TE buffer（10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0）；10mg /mL RNase A（RNA酶A溶于10mmol/L Tris HCl pH7.5，15mmol/L NaCl中）；搖菌試管洗凈并蓋上棉花塞、1.5ml離心管裝入鋁制飯盒、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒，一起高壓滅菌（121C 30min）。2、操作步驟1）制備質(zhì)粒DNA（1）在超凈工作臺中取5ml LB（Amp+）

5、，加入滅菌的搖菌管中。（2）從超低溫冰箱中取出保存pET-his載體的菌種和pGEM-T-AT8載體菌種（挑白色克?。。?，在超凈工作臺上用燒紅的接種環(huán)刮一下，再把接種環(huán)于無菌LB培養(yǎng)液（含100ug/ml氨芐青霉素）中攪拌一下，37C搖床中搖20h。（3） 取1.5ml的菌液于1.5ml離心管中，15000rpm離心1min，棄上清液（盡量棄干凈），留沉淀備用。（4）在沉淀中加入預(yù)冷的100ml 溶液I，蓋上蓋后立即在渦旋混合器上混勻，室溫下靜置5min。（等待的同時，取一個塑料盒，裝上適量的冰塊備用。）（5）加入200ml 溶液II，蓋上蓋后上下顛倒幾次混勻，插入冰中，放置5min。（6）加

6、入150ml 預(yù)冷的溶液III，蓋上蓋后上下顛倒幾次混勻，插入冰中，放置5min。（7）15000rpm離心5min，小心吸取400ml 上清液于另一個干凈的1.5ml離心管中，（不要將白色沉淀物帶入！），加入800ml 95% 乙醇，蓋上蓋后立即在渦旋混合器上混勻，室溫下靜置5min。（8）15000rpm離心10 min，小心棄掉上清液，加入500ml 70% 乙醇，蓋上蓋后立即在渦旋混合器上混勻。15000rpm離心10 min，小心棄掉上清液，盡量倒置棄干凈（9）再加入500ml 70% 乙醇，蓋上蓋后立即在渦旋混合器上混勻。15000rpm離心10 min，小心棄掉上清液，盡量倒置棄

7、干凈（10）離心管倒置于37C培養(yǎng)箱中（或室溫）空氣干燥。（管底的沉淀質(zhì)粒DNA用肉眼幾乎看不見?。?。（11）加入30ml 無菌蒸餾水或TE緩沖液； 3管pET-his質(zhì)粒中每管加入10ml蒸餾水混勻后收集到一個管中，渦旋混合器上混勻，在離心機(jī)中瞬時轉(zhuǎn)一下，使溶液集中在管底。待電泳確認(rèn)（見實(shí)驗二）后再在pET-his質(zhì)粒中加入1ml RNaes A。用記號筆標(biāo)記后放入冰箱中備用。（12）電泳檢測2）酶切（1）混合下列溶液于一個無菌的1.5ml微量離心管中：pGEM-T-AT8（質(zhì)粒DNA） 6 L10酶切緩沖液（用EcoRI的緩沖液） 2 Ldd water 30 LEcoRI 1LBamHI

8、 1L總體積 40L（2）先準(zhǔn)備一個冰盒并放入一定量的冰塊。從-20冰柜中取出限制性內(nèi)切酶，立即插入冰塊中。（3）用一只手的手指捏在盛放酶的微量離心管的上部（以免手指的給酶液加溫），另一只手持微量移液器，小心翼翼地吸取1 L限制性內(nèi)切酶。（4）在酶切樣品混合液中加入限制性內(nèi)切酶后（立即把內(nèi)切酶原液送回冰柜?。?，輕輕震動微量離心管使管中的溶液混勻。再在離心機(jī)中1000rpm離心10秒。取出后插到水漂的孔中，在推薦的最適酶切溫度水浴中溫育1-3 h（一般是 37）。（5）酶切后取少量酶切產(chǎn)物與合適的已知分子量的DNA（如先前的PCR產(chǎn)物）對比電泳，以確認(rèn)切下的片斷是否為自己想要的片斷。（6）酶切后

9、的質(zhì)?？梢曰厥諅溆?。（7）清理桌面垃圾，清洗實(shí)驗儀器。撰寫實(shí)驗報告。五、實(shí)驗報告 六、思考題泳道中的質(zhì)粒DNA有幾條帶？為什么？實(shí)驗項目 -半乳糖苷酶基因（lac Z）的定點(diǎn)突變實(shí)驗項目類型：基礎(chǔ)性所屬課程名稱：基因工程實(shí)驗計劃學(xué)時：6學(xué)時一、實(shí)驗?zāi)康?1. 學(xué)習(xí)并掌握利用PCR進(jìn)行基因缺失和插入定點(diǎn)突變的基本原理和實(shí)驗方法。 2. 復(fù)習(xí)堿法小量制備質(zhì)粒DNA的原理和方法。 二、PCR介導(dǎo)的基因定點(diǎn)突變的基本原理 載體pSV-半乳糖甘酶大小是6820bp（圖實(shí)驗1-1），其上帶有完整的lacZ基因，其中l(wèi)acZ基EDTA因的起始位點(diǎn)是710bp，終止位點(diǎn)（TAA）是3755bp.通過改變5端引

10、物或（和）3引物中的核苷酸序列或數(shù)目，可 利用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）進(jìn)行基因的定點(diǎn)突變。本實(shí)驗的 定點(diǎn)突變均設(shè)計在5端引物上，而3端引物上（4279-4302bp）無突變。其中一條突變的5端引物上插入了TCC3個核苷酸，這條引物位于3880-3901bp,PCR擴(kuò)增后得到的，插入突變DNA片段長度是425bp。另一條突變的5端引物上缺失了TAC3個核苷酸，這條引物位于3874-3901bp，PCR擴(kuò)增后得到的缺失突變DNA片段長度也是425bp.pSV-半乳糖甘酶質(zhì)粒插入突變的5端引物（下劃線是插入的核苷酸）：P5c：5 A GCC TAC TCC TTC CCG TTT TTC CCG 3

11、 缺失突變的5端引物（虛線是刪除的3個核苷酸）：P5q：5 C ATG GGA GCC- TTC CCG TTT TTC CCG 3 3端引物：P3：5GTG CGG GCC TCT TCG CTA TTA CGC 3TCC3851 TTCTTTTTCT TTTACTTTTT TATCATGGGA GCC TTCC CGTTTTTCCC3901 GATTTGGCTA CATGACATCA ACCATATCAG CAAAAGTGAT ACGGGTATTA3951 TTTTTGCCGC TATTTCTCTG TTCTCGCTAT TATTCCAACC GCTGTTTGGT4001 CTGCTTTC

12、TG ACAAACTCGG AACTTGTTTA TTGCAGCTTA TAATGGTTAC4051 AAATAAAGCA ATAGCATCAC AAATTTCACA AATAAAGCAT TTTTTTCACT4101 GCATTCTAGT TGTGGTTTGT CCAAACTCAT CAATGTATCT TATCATGTCT4151 GGATCCTCTA GAGTCGACCT GCAGGCATGC AAGCTGGCAC TGGCCGTCGT4201 TTTACAACGT CGTGACTGGG AAAACCCTGG CGTTACCCAA CTTAATCGCC4251 TTGCAGCACA TC

13、CCCCTTTC GCCAGCTGGC GTAATAGCGA AGAGGCCCGC4301 ACCGATCGCC CTTCCCAACA GTTGCGCAGC CTGAATGGCG AATGGCGCCT lacY 3809-4011突變的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA序列圖5引物5引物3引物3引物PCR介導(dǎo)的插入突變和缺失突變示意圖三、實(shí)驗材料與儀器1、質(zhì)粒：pSV- -半乳糖苷酶；菌株：大腸桿菌JM109菌株。2、溶液或試劑：LB液體培養(yǎng)基，溶液I， 0.4N NaOH，2%SDS，溶液III，無水乙醇，70%乙醇，氯仿，Tris-HCl飽和酚，TE緩沖液，TAE緩沖液。瓊脂糖等。3、儀器或其他用具：

14、恒溫振蕩培養(yǎng)箱，恒溫培養(yǎng)箱，制冰機(jī)，臺式離心機(jī)，超凈工作臺，PCR儀，電泳系統(tǒng)，凝膠成像系統(tǒng)，微量移液器，吸頭等。四、操作步驟 1、菌體的培養(yǎng) 挑取含有pSV- -半乳糖苷酶質(zhì)粒的大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過夜。2、 質(zhì)粒DNA的提取 從平皿上挑取單克隆接入2ml含Amp的LB（100g /ml）培養(yǎng)液中37過夜振蕩培養(yǎng)。 轉(zhuǎn)移約1.2ml過夜培養(yǎng)物到1.5ml離心管中，10，000rpm離心1min，棄上清后，再離心5s，吸去剩余上清。 每個離心管中加入預(yù)冷的溶液100L，在混合器上振蕩使菌體充分懸浮、分散、混勻。 每管加200L新配制的溶液，緩慢倒轉(zhuǎn)幾次混勻，冰上放置5min

15、，使細(xì)胞膜完全裂解。 每管各加150L預(yù)冷的溶液 ，倒轉(zhuǎn)幾次混勻混勻，冰上放置10min,此時酸堿中和，質(zhì)粒DNA復(fù)性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不溶性復(fù)合物，同時鉀鹽使游離的SDS沉淀。 12，000rpm離心10min，沉淀染色體DNA及不溶的變性蛋白，取上清。 上清液用等體積的Tris-HCl飽和酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）抽提一次。 上清液用等體積的氯仿：異戊醇（24：1）抽提一次。 上清液用2倍體積的無水乙醇沉淀30min以上。 12，000rpm離心10min 去上清，用1ml70%乙醇洗滌沉淀一次，離心去上清后空氣晾干。 每管加20L含RNase（20g /ml）的TE

16、緩沖液溶解后，37消化30min以水解RNA。 取2ul電泳檢測提取的量。其余的20保存?zhèn)溆?、PCR擴(kuò)增前的準(zhǔn)備在兩個PCR管中，分別加入以下組分：載體pSV-半乳糖甘酶（2.5ng/L） 1L10PCR反應(yīng)液 2.5LMgCl2 (25mmol/L) 1.5LdNTPs各（2.5 mmol/L） 2L3末端引物（20mol/L） 1L插入突變（或缺失突變）5端引物（20mol/L） 1LTaqDNA聚合酶（1U/L） 1L重蒸餾水 15L總體積 25L混勻后放入PCR循環(huán)儀。（添加一個試劑時，要使用新的無菌吸頭，不要污染無菌貯液。）4、PCR循環(huán)按下列.PCR反應(yīng)程序進(jìn)行PCR循環(huán)94.

17、3min94. 30S55 30S 循環(huán)30次72 30S72 10 min 4保存。5、瓊脂糖凝膠電泳（1）瓊脂糖凝膠制備：配制1.0%的瓊脂糖凝膠。（2）上樣：取5L擴(kuò)增產(chǎn)物加入1L6上樣緩沖液，將6L樣品加入樣品槽中。（3）電泳：恒壓80，待染料遷移到前沿時停止電泳。（4）染色和電泳結(jié)果的觀察：將凝膠在EB染色液染色15分鐘后在紫外透射儀中觀察染色的條帶（若條帶不清楚，可在EB染色液繼續(xù)染色）。（其余的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物保存在-20，等待電泳結(jié)果，再做下一步實(shí)驗，見實(shí)驗二）五、實(shí)驗報告 分別繪出你所提取的質(zhì)粒DNA的電泳圖譜和PCR產(chǎn)物的電泳圖譜。 六、思考題 1、 你的PCR產(chǎn)物是否與預(yù)期

18、的大小一致？為什么有的電泳圖片上除了目的基因的特異性條帶外，還有其他的條帶出現(xiàn)？實(shí)驗項目 外源目的基因片段與載體的體外連接實(shí)驗項目類型：基礎(chǔ)性所屬課程名稱：基因工程實(shí)驗計劃學(xué)時：6學(xué)時一、實(shí)驗?zāi)康?通過本實(shí)驗掌握利用T載體克隆PCR產(chǎn)物原理和方法，掌握重組DNA分子的構(gòu)建方法。二、PCR產(chǎn)物克隆的基本原理 利用Taq DNA 聚合酶催化的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物兩端帶有非特異性延伸的腺苷酸A，將PCR擴(kuò)增獲得的-半乳糖苷酶（lacZ）基因定點(diǎn)突變片段與pGEM-T載體兩端突出的T接頭，在T4 DNA 連接酶作用下環(huán)化，載體分子的粘性末端與外源DNA的相同粘性末端聯(lián)接成重組DNA分子。三、實(shí)驗材料與儀器

19、1、克隆載體pGEM-T Easy；菌株：大腸桿菌JM109菌株；突變的lac Z 基因片段；X-gal，IPTG，氨芐青霉素（Amp）等。2、溶液或試劑：LB液體培養(yǎng)基，0.1MCaCl2，20mg/ml X-gal，200mg/ml IPTG，100mg/ml Amp溶液。3、儀器或其他用具：恒溫振蕩培養(yǎng)箱，恒溫培養(yǎng)箱，制冰機(jī)，臺式離心機(jī)，超凈工作臺，微量移液器，吸頭，平皿，涂布器等。四、操作步驟 PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體直接連接： （1） 事先將干式恒溫儀（或冰盒里的水）溫度設(shè)定在1416C。（2） 取一個滅菌的1.5ml微量離心管，加入：4ml PCR 產(chǎn)物混合液1ml pGEM-

20、T載體 0.5ml T4 DNA連接酶（TAKARA, 350U/ul）1ml 連接酶緩沖液3.5 ml dd Water總量 10ml 體系（3）上述混合液輕輕震蕩后再短暫離心，然后置于16C金屬浴水中連接3個小時。（4） 連接后的產(chǎn)物可以立即用來轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞或置4C冰箱備用。五、實(shí)驗報告六、思考題 連接酶的最適溫度室多少？實(shí)驗項目 感受態(tài)菌的制備實(shí)驗項目類型：基礎(chǔ)性所屬課程名稱：基因工程實(shí)驗計劃學(xué)時：6學(xué)時一、實(shí)驗?zāi)康膶W(xué)會CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。二、實(shí)驗原理 細(xì)菌在0C CaCl2低滲溶液中脹成球形，丟失部分膜蛋白，成為容易吸收外源DNA的狀態(tài)。三、實(shí)驗材料與儀器1、儀器 旋

21、渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，50ml 微量離心管，1.5ml 微量離心管，雙面微量離心管架，臺式冷凍離心機(jī)，制冰機(jī)，恒溫?fù)u床，分光光度計，超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，搖菌試管，三角燒瓶，接種環(huán)。2、試劑 E. coli JM109，LB培養(yǎng)基，0.1 mol/L CaCl2溶液，無菌dd Water四、操作步驟 1、實(shí)驗準(zhǔn)備1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌）；平板培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基（滅菌），冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液（滅菌），冰冷的0.1 mol/L MgCl2溶液（滅菌），無菌dd Water，搖菌試管（滅菌），三角燒瓶（滅菌）。2、

22、操作步驟 （1）取一支無菌的搖菌試管，在超凈工作臺中加入2ml LB（不含抗菌素?。┡囵B(yǎng)基。（2）從超低溫冰柜中取出DH5a菌種，放置在冰上。在超凈工作臺中用燒紅的接種環(huán)插入凍結(jié)的菌中，然后接入含2ml LB培養(yǎng)基的試管中，37搖床培養(yǎng)過夜。（3）取0.5ml上述菌液轉(zhuǎn)接到含有50mL LB培養(yǎng)基的三角燒瓶中，37下250r/min搖床培養(yǎng)23h，測定OD590為0.375（0.40.6，細(xì)胞數(shù)108/mL，此為關(guān)鍵參數(shù)?。?。以下操作除離心外，都在超凈工作臺中進(jìn)行。（4）將菌液分裝到1.5mL預(yù)冷無菌的聚丙烯離心管中，于冰上放置10min，然后于4，5000rpm離心10min。（5）將離心管

23、倒置以倒盡上清液，加入1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，立即在渦旋混合器上混勻，插入冰中放置20min。（6）4，5000rpm離心10min，棄上清液后，用1mL 冰冷的0.1 mol/L MgCl2溶液垂懸，插入冰中放置20min。（7）4，5000rpm離心10min，棄上清液后，用200L 冰冷的0.1 mol/L MgCl2溶液垂懸，超凈工作臺中按每管100mL分裝到1.5mL離心管中?？梢灾苯佑米鬓D(zhuǎn)化實(shí)驗，或立即放入-80超低溫冰柜中保藏（可存放數(shù)月）。（8）在被細(xì)菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫實(shí)驗報告。五、實(shí)驗報告六、思考CaCl2溶液的作用是什么？實(shí)

24、驗項目 重組DNA分子轉(zhuǎn)化及克隆菌落的篩選與鑒定實(shí)驗項目類型：基礎(chǔ)性所屬課程名稱：基因工程實(shí)驗計劃學(xué)時：6學(xué)時一、實(shí)驗?zāi)康?掌握藍(lán)白斑篩選的原理和實(shí)驗方法二、實(shí)驗原理 DNA粘附在細(xì)菌細(xì)胞表面，經(jīng)過42C短時間的熱擊處理，促進(jìn)吸收DNA。轉(zhuǎn)化受體菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，于LB/Amp/X-gal/IPTG平板上培養(yǎng)，用藍(lán)/白斑實(shí)驗初步篩選重組轉(zhuǎn)化體。如果外源片段插入lacZ引起插入失活，則產(chǎn)生無活性的-半乳糖苷酶，不能利用X-gal，形成白色菌落，如果載體自連，則產(chǎn)生有活性的-半乳糖苷酶，分解X-gal形成藍(lán)色的菌落，從而一次篩選出含有重組子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。三、實(shí)驗材料與儀器1、儀器 旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml 微量離心管，雙面微量離心管架，干式恒溫氣浴（或恒溫水浴鍋），制冰機(jī)，恒溫