高效液相色譜法原理與應用(詳細版)ppt課件

1、1,高效液相色譜法原理與應用,參考書 高效液相色譜及其應用 液相色譜檢測方法 實用高效液相色譜法的建立,2,第1章 色譜基本原理,一、色譜法概述 色譜法的定義與特點 色譜法的分離原理 色譜法的特點 色譜法的分類,3,1.色譜法的定義,茨維特的實驗,4,色譜分離效果圖,5,因此 色譜法是一種分離方法。 它的特點是：有兩相，一是固定相，一是流動相，兩相作相向運動。 Chromatography 將色譜法用于分析中，則稱為色譜分析。 色譜分析是一種分離、分析法,6,2、色譜法分離原理,當流動相中所攜帶的混合物流過固定相時，就會和固定相發(fā)生作用(力的作用)。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上有差異，與固

2、定相發(fā)生作用的大小也有差異。因此在同一推動力作用下，不同組分在固定相中的滯留時間有長有短，從而按先后不同的次序從固定相中流出,7,3、色譜法的分類,按流動相狀態(tài)的不同，可分為,氣相色譜法 (GC) 液相色譜法 (LC) 超臨界流體色譜 (SFC,8,什么是氣相色譜法,以氣體為流動相的色譜法 Gas Chromatogaphy，簡稱GC 適合分離分析易汽化（在- 190-500范圍內(nèi)有0.2-10mmHg的蒸氣壓的）穩(wěn)定、不易分解、不易反應的樣品，特別適合用于同系物、同分異構(gòu)體的分離,9,應用舉例（GC,10,什么是液相色譜法,以液體為流動相的色譜法 Liquid Chromatogaphy，簡

3、稱LC 適合分離分析高沸點、熱不穩(wěn)定、離子型的樣品,11,按固定相使用的形式可液相色譜法又可分為： 柱色譜（Column Chromatography） 將固定相裝在色譜柱內(nèi) 紙色譜（Paper Chromatography） 用濾紙做固定相或固定相載體的色譜 薄層色譜（Thin Lay Chromatography） 固定相均勻涂在玻璃板或塑料板上,12,TLC的應用,1 2 3 4 5 6 7 8 9,Bands Description 1 Pseudoginsenoside F11 2 American Ginseng 3 Ginsenoside Rg1 4 Ginsenoside Rf

4、 5 Ginseng 6 Ginsenoside Rc 7 Ginsenoside Rb1 8 Notoginseng 9 Notoginsenoside R1,人參、西洋參和三七藥材的鑒別,13,丹參藥材有效成分的HPLC圖譜 1. Danshensu; 2. Protocatechuic acid; 3. Protocatechualdehyde; 4. Caffeic acid; 5. Salvianolic acid F; 6. Salvianolic acid D; 7. Salvianolic acid J / isomer; 8. Salvianolic acid E; 9. R

5、osmarinic acid; 10. Lithospermic acid; 11. Salvianolic acid B; 12. Salvianolic acid B / E /isomer ; 13. Salvianolic acid A; 14. Dihydrotanshinone I; 15. Tetrahydrotanshinone / isomer; 16. Cryptotanshinone; 17. Tanshinone I; 18. Tanshinone IIA,14,15,拖尾峰 伸舌峰 鬼峰、假峰 畸峰 峰底 基線漂移 基線噪聲 譜帶擴張,16,死時間(tM):完全不保留

6、組分流出系統(tǒng)的時間 保留時間(tR): 調(diào)整保留時間(tR): 死體積(VM): 保留體積(VR): 調(diào)整保留體積(VR,17,R: 分離度 tR: 保留時間 t0：死時間 W：峰底寬度,2. 色譜分離基本方程,18,不同R值的峰重疊情況示意圖,R1.5可以得到基線分離 分離度R反映的是相鄰兩個峰的分開程度 R太小，兩個峰無法徹底分離 R太大，分離時間過長，工作效率低下 一般要求R1.5，也可遵循行業(yè)特殊規(guī)定,19,根據(jù)該公式優(yōu)化試驗條件，提高分離度R。 從數(shù)學推導來看，分別增大n，k值，都可以提高分離度,色譜分離基本方程,20,分離選擇性（）對分離度（R）的影響,如果t0=1min,1.64

7、/1.58=1.04,=1.15/0.85=1.35,=0.95/0.63=1.50,改變分離選擇性的方法 改用不同的流動相 改變流動相的組成 并非必須大于1.5！ 改變流動相pH值 盡量優(yōu)化前幾種實驗條件提高a值， 改變柱溫 避免改變固定相（買新柱子），以便降低成本 應用特殊的化學效應 改變固定相,21,柱效（n）對分離度（R）的影響,以上兩張譜圖k，, 值完全相同，僅僅由于柱效高低不同使得它們具有不同的分離度。 直觀的看，峰的尖銳程度代表了柱效高低，峰越尖銳，其柱效越高，通常使用理論塔板數(shù)（n）的大小衡量柱效的高低,22,理論塔板數(shù)和理論塔板高度的計算方法,理論塔板數(shù) 理論塔板高度HETP

8、=L/n 理論塔板數(shù)n越大，柱效越高；理論塔板數(shù)HETP越效，柱效越高,23,容量因子（k）對分離度（R）的影響,容量因子越大，分離度越大。 k 1 3 5 7 9 11 13 k/k+1 0.50 0.75 0.83 0.88 0.90 0.92 0.93 1.00 但當容量因子大于10，k/(k+1)的改變不大，而分析時間將大大延長。因此，k的最佳范圍是1k20,改變?nèi)萘恳蜃拥姆椒ㄓ校?改變柱溫 改變柱死體積，其中死體積對k/(k+1)的影響很大。 改變流動相的配比是最簡便、最有效的方法 梯度洗提,容量因子,24,梯度洗提,梯度洗脫即程序控制流動相的組成，使在整個分離過程中，溶劑強度按照特

9、定的變化規(guī)律增加。 優(yōu)點：分離復雜混合物，使所有組分都處在最佳的k值范圍內(nèi)。 缺點：檢測器的使用受到限制，分析結(jié)果的重復性取決于流速的穩(wěn)定性。柱子需進行再生處理,25,26,裝置 低壓梯度（內(nèi)梯度）：溶劑在常壓下混合，再用高壓泵輸送至柱系統(tǒng)。簡單、經(jīng)濟，只需一個泵，所用溶劑的元數(shù)沒有限制。 高壓梯度（外梯度）：一般由兩臺高壓泵構(gòu)成，每臺泵輸送一種溶劑。溶劑在混合室混合后，在輸入柱系統(tǒng)。流量精密度高，溶劑的可壓縮性和熱力學體積的變化可能影響輸入柱子中溶劑的組成,27,低壓溶劑梯度方框圖,高壓溶劑梯度方框圖,28,實現(xiàn)方式 對于復雜樣品，線性梯度是最好的。 正相色譜中，常用二氯甲烷加入正己烷來實現(xiàn)

10、。 反相色譜中，乙腈，甲醇加入水中是最常用的,29,溫度的影響,n，k都會受到柱溫的影響 不要使用過高溫度，以保護柱子，60度算高溫 溫度對平衡常數(shù)有影響，有時會影響出峰順序，注意對化合物進行定性后再定量 升溫通?？梢约铀俜蛛x，縮短分析時間，但也不絕對,30,三、色譜定性與定量方法,31,1. 色譜定性分析,1) 純物對照定性 各物質(zhì)在一定的色譜條件下均有確定不變的保留值，因此保留值可作為定性指標,32,實現(xiàn)方法 利用保留時間和保留體積定性,33,用相對保留值定性 用已知物增加峰高法定性,34,應用范圍：適用于簡單混合物，對該樣品已有了解并具有純物質(zhì)的情況。 優(yōu)點：應用簡便，不需要其他儀器。

11、缺點：定性結(jié)果的可信度不高。 提高可信度的方法：雙柱、雙體系定性,35,2) 與其它儀器或化學方法聯(lián)合定性,離線聯(lián)用方式 化學法 儀器法 在線聯(lián)用方式 化學法 儀器法,36,離線聯(lián)用方式,收集方法：餾分收集器 應用范圍：無標準物時，可對較為復雜的混合物進行定性分析 缺點：麻煩,37,在線聯(lián)用方式,與其它儀器聯(lián)用定性 混合物經(jīng)色譜分離后，將各組分直接由接口導入其它儀器中進行定性。常用的聯(lián)用方法有：LC-FTIR、LC-MS 其它儀器相當于色譜儀的檢測器。 使用范圍：復雜樣品的定性。 優(yōu)點：不需要標準物，定性結(jié)果可信度高，操作方便。 缺點：需要特殊儀器或設備,38,2 色譜定量分析,1) 色譜定量

12、基礎 色譜定量分析是基于被測物質(zhì)的量與峰面積成正比。在一定色譜條件下有,39,2）定量要解決的問題,峰面積的測量和計算 校正因子的測量與計算 色譜定量方法及其應用,40,峰面積的測量與計算,積分儀或色譜工作站 簡便、速度快，精度高，可達0.2-2%，對小峰及不對稱峰的結(jié)果準確，是色譜發(fā)展趨勢。 手動測量與計算,41,峰高乘半峰寬法：適于對稱峰 峰高乘峰底寬度法：適于矮寬峰 峰高乘平均峰寬法：適于不對稱峰 峰高乘保留值法：適于狹窄峰，快速簡便，常用于工廠控制分析,42,重疊峰的測量,切線分峰 垂線分峰,43,連線分峰 計算機擬合分峰,44,校正因子的測量與計算,相對校正因子 由于絕對校正因子與儀

13、器的靈敏度有關(guān)，又由于靈敏度與實驗條件相關(guān)，且每一檢測器的靈敏度都是不同的，它不容易測量準確，亦無通用性，所以實際工作中使用相對校正因子,45,質(zhì)量校正因子 摩爾校正因子 相對響應值,被測組分的質(zhì)量,標準物質(zhì)量,分子量,46,定量方法,校正歸一化法 含歸一化 內(nèi)標法 含內(nèi)標標準曲線法 外標法 含單點校正,47,校正歸一化法,推導,48,應用范圍：當試樣中各組分都能流出色譜柱，且在檢測器上均有響應，各組分峰沒有重疊時，可用此法。 優(yōu)點：簡便、準確，當操作條件如進樣量等變化時，對定量結(jié)果影響很小，該法適合于常量物質(zhì)的定量。 缺點：對該法的苛刻要求限制了它的使用,49,面積歸一化法,若各組分的定量校

14、正因子相近或相同，則上式可簡化為,50,內(nèi)標法,推導 將一定量的純物質(zhì)作為內(nèi)標物，加入到準確稱量的試樣中,單點校正,51,適用范圍：當只需測定試樣中某幾個組分，且試樣中所有組分不能全部出峰時可用。 優(yōu)點：受操作條件的影響較小，定量結(jié)果較準確，使用上不象歸一化法那樣受到限制，此法適合于微量物質(zhì)的分析。 缺點：每次分析必須準確稱量被測物和內(nèi)標物，不適合于快速分析,52,內(nèi)標標準曲線法（多點校正內(nèi)標法,fi,sms/m為常數(shù)K，此時Ci%=K(Ai/As)，以Ci%對Ai/As作標準曲線。 優(yōu)點：不必測校正因子，消除了某些操作條件的影響，方法簡便，適合液體試樣的常規(guī)分析,53,外標法（標準曲線法,用

15、于常規(guī)分析 優(yōu)點：操作簡單，計算方便。 缺點：結(jié)果的準確度取決于進樣量的重現(xiàn)性和操作條件的穩(wěn)定性。該法必須定量進樣,54,單點校正,當被測試樣中各組分的濃度變化范圍不大時而用單點校正法。 即配制一個與被測組分含量十分接近的標準溶液，定量進樣，計算被測物的含量,55,3）定量中的誤差問題,樣品的代表性（樣品的前處理） 進樣系統(tǒng)的影響 柱系統(tǒng)的影響 測量誤差 定量結(jié)果的誤差分析,56,HPLC主要類型及其選擇,化學鍵合相色譜法 液固色譜法 離子對色譜法 離子色譜法 體積排阻色譜法,57,一、化學鍵合相色譜法,1.分類 正相鍵合相色譜法(Normal phase chromatography)：固定

16、相的極性大于流動相的極性，適用于分離油溶性或水溶性的極性或強極性化合物 反相鍵合相色譜法(Reversed phase chromatography)：固定相的極性大于流動相的極性，適于分離非極性、極性和離子性化合物。應用最廣泛,58,正相色譜法與反相色譜法比較表,59,2. 固定相,疏水基團 如不同鏈長的烷烴（C8和C18）和苯基等 極性基團 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等,60,常用固定相,61,62,不同廠商固定相的比較,63,3. 流動相,溶劑具有穩(wěn)定的化學性質(zhì) 溶劑的選擇與使用的檢測器要有相容性 溶劑的粘度要小 溶劑的沸點不能太低 溶劑的純度要高且價格便宜 正相：正己烷、正庚烷、乙醚、二

17、氯甲烷、氯仿等，己烷為主體，加入質(zhì)子接受體乙醚或甲基叔丁基醚，質(zhì)子給予體氯仿，偶極溶劑二氯甲烷 反相：水、甲醇、乙腈、四氫呋喃、乙醇及其混合物等，以水為主體，加入質(zhì)子接受體甲醇，質(zhì)子給予體乙腈，偶劑溶劑四氫呋喃,64,4. 影響保留值的因素,溶質(zhì)結(jié)構(gòu)對保留值的影響： 正相：溶質(zhì)極性越強，官能團越多，保留值越大 反相：溶質(zhì)極性越弱，疏水性越強，保留值越大。溶質(zhì)的保留值與其分子非極性部分的總面積有關(guān)，面積大，保留值大,65,66,烷基鍵合固定相特性對保留值的影響： 反相：鍵合相烷鏈長，k大，選擇性好,67,溶劑性質(zhì)： 正相：溶劑極性越弱，保留越大 反相：流動相表面張力大、介電常數(shù)大，則極性越強。其

18、斥力越大，溶質(zhì)與固定相鍵合越強，保留值越大,68,鹽的影響： 通常加入醋酸鹽、硼酸鹽、硫酸鹽等。無機鹽使流動相表面張力增大，對非離子性溶質(zhì)，使k增加，對離子型溶質(zhì)，k下降。對堿性有機物有改善峰形的作用。 pH值： 加入酸、堿或緩沖液，控制PH，抑制溶質(zhì)的離子化，改善峰形。用于分析弱酸、堿,69,5 應用,70,二.液固色譜法 Liquid Solid Chromatography,1. 固定相 極性：硅膠、氧化鎂、氧化鋁等 非極性：活性炭、高分子多孔微球、碳多孔微球等 2. 流動相 硅膠為固定相時：以弱極性的正構(gòu)烷烴為主體，加入二氯甲烷等中等極性溶劑調(diào)節(jié)合適的洗脫強度。 可用水對硅膠進行減活處

19、理，或加入四氫呋喃、乙腈、甲醇、異丙醇等改性劑,71,3. 影響保留值的因素,樣品分子結(jié)構(gòu) 溶質(zhì)分子的官能團極性增加，保留值增加 溶質(zhì)分子的官能團數(shù)目增加，保留值增加 保留值與溶質(zhì)的空間效應有關(guān) 保留值與吸附中心的幾何分布有關(guān) b吸附劑 吸附劑的孔徑越小，表面積越大，保留值越大 吸附劑的活性越強，保留值越大，活性由流動相中的含水量來控制 c流動相,72,4. 應用,中等分子量的油溶性樣品如油品、脂肪、芳烴等 不同極性取代基的化合物 結(jié)構(gòu)異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體混合物的分離,73,74,三、離子對色譜法 Ion-pair chromatography,1.基本原理 將一種或數(shù)種與樣品離子電荷（A+）相

20、反的離子(B-)（稱為對離子或反離子）加入到色譜系統(tǒng)流動相中，使其與樣品離子結(jié)合生成弱極性的離子對（中性締合物）的分離方法。多為反相離子對色譜,75,76,77,2. 固定相、流動相和離子對試劑,固定相多為C18,C8反相鍵合相 流動相是以水為主的緩沖液，或水-甲醇、水-乙腈等混合溶劑 離子對試劑：四丁基銨正離子、十六烷基三甲基銨正離子，ClO4-，十二烷基磺酸根等,78,3. 影響保留值的因素,pH的影響：改善分離選擇性的有效方法。 反相中，對于陰離子的分離，pH下降，k減小。 離子對試劑的性質(zhì)與濃度：反相中，離子對試劑烷基鏈越長，疏水性越大，k越大。 溶劑的極性：反相中，甲醇、乙腈等含量增

21、加，洗脫強度增大，k下降。洗脫強度與極性參數(shù)、介電常數(shù)同時相關(guān) 離子強度：反相中，離子強度增加，溶質(zhì)k下降,79,4. 應用,有機酸、有機堿特別是強酸 強堿的分析，如羧酸、磺酸、 胺類、酚類、藥物、染料等,反相離子對色譜分析有機酸 固定相：C18烷基鍵合相 流動相：0.03mol/L四丁基銨+戊醇 1. 4-氨基苯甲酸；2. 3-氨基苯甲酸；3. 4-羥基苯甲酸； 4. 3-羥基苯甲酸；5. 苯磺酸； 6. 苯甲酸； 7. 甲苯-4-磺酸,80,液相色譜常用類型總結(jié),81,第3章 高效液相色譜法的建立與應用,82,我國藥典收載高效液相色譜法項目和數(shù)量比較表,83,高效液相色譜儀的分析原理 高效

22、液相色譜儀的結(jié)構(gòu) 色譜柱在高效液相色譜儀中的作用和峰形產(chǎn)生原理,高壓泵,進樣器,檢測器,色譜工作站,色譜柱,84,HPLC有以下特點,高壓壓力可達150300 Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 Kg/cm2以上。 高速流速為0.110.0 ml/min。 高效可達10000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達100種。 高靈敏度紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少,85,HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點,速度快通常分析一個樣品在1530 min，有些樣品甚至在5 min內(nèi)即可完成。 分辨率高可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果。 靈敏度高紫外檢測器可達0.01ng，熒光和電

23、化學檢測器可達0.1pg。 柱子可反復使用用一根色譜柱可分離不同的化合物。 樣品量少，容易回收樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備,86,In which materials ? In what concentration ? Which sample ? With which technique ,一.高效液相色譜法的建立,1.了解樣品,87,What is the sample ? Concentration of the interested component Contaminant Characteristics of the sample Structure Mole

24、cular weight pKa Solubility,88,溶于水排阻色譜，水為流動相 相對分子質(zhì)量 2000 不溶于水排阻色譜，非水流動相 同系物分配色譜 不溶于水 異構(gòu)體吸附色譜 樣品 分子大小差異排阻色譜 反相液一液色譜 相對分子質(zhì)量 溶于水，不離解 2000 排阻色譜，水為流動相 堿陽離子交換色譜 溶于水，可離解 酸陰離子交換色譜 溶于水， 離子與非離子反相離子對色譜,89,2. 選擇合適的分析方法,Analytical technique Column Mobile phase Detector Sample preparation,90,3.分析條件的優(yōu)化,流動相種類與配比 梯度

25、 溫度 流速 檢測波長 進樣量,91,二、高效液相色譜法的應用,樣品測定 1流動相比例調(diào)整：由于我國藥品標準中沒有規(guī)定柱的長度及填料的粒度，因此每次新開檢新品種時幾乎都須調(diào)整流動相（按經(jīng)驗，主峰一般應調(diào)至保留時間為615分鐘為宜）。所以建議第一次檢驗時請少配流動相，以免浪費。弱電解質(zhì)的流動相其重現(xiàn)性更不容易達到，請注意充分平衡柱,92,樣品測定,2樣品配制：溶劑；容器：塑料容器常含有高沸點的增塑劑，可能釋放到樣品液中造成污染，而且還會吸留某些藥物，引起分析誤差。某些藥物特別是堿性藥物會被玻璃容器表面吸附，影響樣品中藥物的定量回收，因此必要時應將玻璃容器進行硅烷化處理,93,樣品測定,3記錄時間

26、：第一次測定時，應先將空白溶劑、對照品溶液及供試品溶液各進一針，并盡量收集較長時間的圖譜（如30分鐘以上），以便確定樣品中被分析組分峰的位置、分離度、理論板數(shù)及是否還有雜質(zhì)峰在較長時間內(nèi)才洗脫出來，確定是否會影響主峰的測定,94,樣品測定,4進樣量：藥品標準中常標明注入10l，而目前多數(shù)HPLC系統(tǒng)采用定量環(huán)（10l、20l和50l），因此應注意進樣量是否一致。（可改變樣液濃度,95,樣品測定,5計算：由于有些對照品標示含量的方式與樣品標示量不同，有些是復合鹽、有些含水量不同、有些是鹽基不同或有些是采用有效部位標示，檢驗時請注意,96,方法研究,1波長選擇：首先在可見紫外分光光度計上測量樣品液

27、的吸收光譜，以選擇合適的測量波長，如最靈敏的測量波長并避開其它物質(zhì)的干擾。從紫外光譜中還可大體知道在HPLC中的響應值，如吸收度小于0.5時，HPLC測定的面積將會很小。 2流動相選擇：盡量采用不是弱電解質(zhì)的甲醇-水流動相,97,食品分析,98,99,100,2.環(huán)境分析,101,102,3.藥物分析,103,104,人參皂苷的分析,105,5. 農(nóng)藥分析,106,第4章 儀器使用細節(jié),107,1.HPLC用水,專門的純水機或超純水機； 去離子水重蒸； 二次或三次重蒸水； 采用類似家用的純水機； 市場上瓶裝的純凈水或蒸餾水； 其它途徑,108,2. 樣品,溶解樣品用溶劑最好是流動性，或者用溶劑

28、強度與流動相相近的溶劑。 進樣樣品要求無微粒，樣品溶液均要用0.45m的濾膜過濾,109,3.流動相的配制,流動相通常按體積比配制。 流動相在使用前一般都需要過濾，尤其使用了加緩沖鹽的流動相時。 如果沒有自動脫氣裝置，流動相配好后應該采用合適的方法脫氣，如超聲波脫氣，真空脫氣、氦氣脫氣等,110,在HPLC系統(tǒng)中使用的注射器針頭有別于氣相色譜，是平頭注射器。一方面，針頭外側(cè)緊貼進樣器密封管內(nèi)側(cè)，密封性能好，不漏液，不引入空氣；另一方面，也防止了針頭刺壞密封組件及定子。盡快轉(zhuǎn)動閥，不能停留在中途，否則過高的壓力在柱頭上引起損壞。 六通閥進樣器的進樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。使用部分裝液法

29、進樣時，進樣量最多為定量環(huán)體積的75，并且要求每次進樣體積準確、相同；使用完全裝液法進樣時，進樣量最少為定量環(huán)體積的3至5倍，即20l的定量環(huán)最少進樣60至100l的樣品，這樣才能完全置換樣品定量環(huán)內(nèi)殘留的溶液，達到所要求的精密度及重現(xiàn)性,4. 六通閥的使用,111,防止微粒阻塞進樣閥和減少對進樣閥的磨損。為防止緩沖鹽和其它殘留物質(zhì)留在進樣系統(tǒng)中，每次結(jié)束后應沖洗進樣器，通常用不含鹽的稀釋劑、水或不含鹽的流動相沖洗，在進樣閥的Load和Inject位置反復沖洗,112,5.泵的保養(yǎng),使用流動相盡量要清潔； 進液處的砂芯過濾頭要經(jīng)常清洗； 流動相交換時要防止沉淀； 避免泵內(nèi)堵塞或有氣泡,113,

30、色譜柱問題及解決方法： 保留值和分離度的重現(xiàn)性：影響方法的準確度與精密度 譜峰拖尾：分離質(zhì)量下降，精密度下降 色譜柱壽命,6. 色譜柱,114,115,樣品溶劑對分離結(jié)果的影響,116,柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強烈震動； 當柱子和色譜儀聯(lián)結(jié)時，閥件或管路一定要清洗干凈； 要注意流動相的脫氣； 避免使用高粘度的溶劑作為流動相； 進樣樣品要提純； 嚴格控制進樣量； 每天分析工作結(jié)束后，要清洗進樣閥中殘留的樣品； 每天分析測定結(jié)束后，都要用適當?shù)娜軇﹣砬逑粗?若分析柱長期不使用，應用適當有機溶劑保存并封閉,117,高效液相色譜柱發(fā)展史,19世紀70年代中期，HPLC儀開始出現(xiàn)，主要填料：1

31、0 m 的無定型硅膠顆粒。 70年代后期，發(fā)展了反相液相色譜。 80年代，HPLC 被廣泛應用于化合物的分離，主要填料：粒徑為5 10 m 球形硅膠。 90年代早期，粒徑為 5 m 的高純硅膠，即所謂的 B 型硅膠被發(fā)展，并成為這個行業(yè)填料的標準，這種 B 型硅膠含有微量的金屬。 90年代后期，為了滿足快速分離的需求，發(fā)展了 3 m 或 3.5 m 的球形硅膠，其作用和性能逐漸的獲得了人們的認同和接受。 21世紀早期，為適應超快速的分離要求，粒徑小于 2 m 的填料被開發(fā)出來，發(fā)展出了整體柱、無機和有機雜化硅膠。 目前，市場上流行的分析用的 HPLC 硅膠基質(zhì)填料主要為 B 型硅膠,118,P

32、LC色譜柱及其填料的特征,HPLC 色譜柱的基質(zhì)材料 硅膠與聚合物 現(xiàn)代高效液相色譜填料的特征 色譜柱結(jié)構(gòu) 固定相 鍵合相 色譜柱接頭 鍵合相穩(wěn)定性,119,硅 膠基質(zhì)材料,目前應用最為廣泛的基質(zhì)材料。 高機械強度和高的比表面積。 可利用直接的廣泛的表面鍵合反應來滿足正相、反相、離子交換、疏水作用色譜和體積排除色譜的需求。 高效。 重現(xiàn)性好。 pH 適用范圍為pH 28。 具有容易導致強堿性物質(zhì)拖尾的，表面活性和帶酸性的硅羥基,120,聚合物基質(zhì)材料,交聯(lián)苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯。 pH 穩(wěn)定性好：pH 1 13。 可以在很寬的范圍內(nèi)進行表面化學處理以滿足反相色譜、離子交換色譜、疏水作

33、用色譜和體積排阻色譜的需求。 在中等 pH 條件下對強堿性物質(zhì)具有更好的峰形。 填料的體積隨著流動相的不同而改變，如膨脹或收縮。 分離效率相對硅膠而言比較低 重現(xiàn)性不好,121,硅 膠 外 形,球形硅膠: 現(xiàn)代 HPLC 填料 粒徑小 (5 m, 3 m, 2 m) 重現(xiàn)性好 穩(wěn)定性好 分離效率高,無定型硅膠: 最初的 HPLC 填料 粒徑 5 m 柱床穩(wěn)定性差 比表面積較小 價格便宜,122,硅 膠 純 度,硅膠純度對強極性化合物的分離最重要。 以前的純度較低的硅膠（稱為 A 型硅膠）, A 型硅膠是以金屬硅酸鹽制備而來，具有很高的金屬含量，可被用作中性化合物和非離子化合物的分離。 純度高、

34、酸性較弱的硅膠 (稱為 B 型硅膠)，這種硅膠是以無金屬的工藝制備而來，只含有微量的金屬，建議用于分離離子化合物和可電離的化合物，特別是堿性化合物。 金屬雜質(zhì)引起對螯合劑和堿性化合物的分離產(chǎn)生不對稱峰或拖尾峰,123,硅膠純度,124,硅膠孔徑,125,硅 膠 粒 徑,126,HPLC 色譜柱結(jié)構(gòu),127,鍵 合 相,鍵合相: 反相: 70%; C18, 65%; C8, 15%; Cyano, 5%, 苯基柱 5%, 正相: 20%; 硅膠、 -NH2、 -CN 其它 (手性柱, 離子交換柱): 10% 反相色譜是目前應用得最為廣泛的高效液相色譜方法。 C18 和 C8 在反相色譜終應用得最為廣泛,128,封 尾,封尾是用如三甲基硅烷等小分子與