植物的原生質(zhì)體培養(yǎng)

1、植物的原生質(zhì)體培養(yǎng),主要內(nèi)容,原生質(zhì)體的概念 原生質(zhì)體培養(yǎng)的優(yōu)越性 原生質(zhì)體的分離 原生質(zhì)體的培養(yǎng),原生質(zhì)體(protoplast)： 指除去細(xì)胞壁的細(xì)胞或是說一個(gè)被質(zhì)膜所包圍的裸露球形細(xì)胞,細(xì) 胞,微 絲,葉綠體,線粒體,質(zhì) 膜,液 泡,細(xì)胞核,內(nèi)質(zhì)網(wǎng),微 管,細(xì)胞壁,高爾基體,植物細(xì)胞模式圖,細(xì)胞壁由三種主要成分構(gòu)成 纖維素25-50%、半纖維素53%和果膠5,一、植物原生質(zhì)體的特點(diǎn)： 1、吸收能力增強(qiáng)：易于攝取外來遺傳物質(zhì)、細(xì)胞器、細(xì)菌、病毒等；易于吸收氧、養(yǎng)分； 2、具有全能性：具有全套的遺傳物質(zhì)，具有細(xì)胞壁再生并能進(jìn)行人工培養(yǎng)分化發(fā)育成完整植株的能力； 3、在一定條件下可誘導(dǎo)原生質(zhì)體

2、融合，形成雜種細(xì)胞 。 4、分泌能力提高: 去除了細(xì)胞壁的擴(kuò)散障礙，使細(xì)胞膜的透過性增強(qiáng)，利于胞內(nèi)產(chǎn)物的分泌。 5、穩(wěn)定性較差: 失去了細(xì)胞壁的保護(hù)作用，穩(wěn)定性較差，易于受到滲透壓等條件變化的影響,原生質(zhì)體用途,原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義,1）為細(xì)胞融合奠定基礎(chǔ)。有性雜交不能進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)交流。 （2）是遺傳工程的理想受體。能夠直接攝取外源DNA，細(xì)胞器甚至微生物。 （3）理論研究。細(xì)胞壁再生、細(xì)胞膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)、病毒侵染。 因?yàn)榧?xì)胞壁不僅具有保護(hù)功能，還參與細(xì)胞的生長和分化等生命活動(dòng)。但是必須指出：原生質(zhì)體必須再生出細(xì)胞壁才能繼續(xù)發(fā)育,二、 原生質(zhì)體的制備 不同的植物細(xì)胞，由于細(xì)胞壁的組成、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有所不

3、同，原生質(zhì)體的制備方法也不一樣。 1、用于分離原生質(zhì)體的材料準(zhǔn)備：選取生長旺盛的細(xì)胞，幼嫩的組織。 無菌試管苗葉片 上胚軸和子葉 培養(yǎng)細(xì)胞（愈傷組織,2、原生質(zhì)體的分離 1）、機(jī)械法：利刃機(jī)械切割 2）、酶解法：果膠酶和纖維素酶處理,1）機(jī)械法,1892年首先用于藻類分離原生質(zhì)體 做法：先使細(xì)胞質(zhì)壁分離，再用刀把細(xì)胞壁切破，使原生質(zhì)體流出或釋放出來,優(yōu)點(diǎn)：該方法可避免酶制劑對(duì)原生質(zhì)體的破壞作用。 缺點(diǎn)： 1) 手工操作難度大，原生質(zhì)體得率低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，難以大量制備。 2）能夠用此法產(chǎn)生原生質(zhì)體的植物種類受到限制,2）酶解法,1960年英國諾丁漢大學(xué)的科金第一次用酶解法從番茄幼苗根尖中大量制備出

4、原生質(zhì)體； 常用酶：纖維素酶類、果膠酶類、半纖維素酶、蝸牛酶等； 優(yōu)點(diǎn)：條件溫和、原生質(zhì)體完整性好、活力高、得率高，而且?guī)缀跛械闹参锘蛩鼈兊钠鞴俳M織或細(xì)胞均可用酶解法獲得原生質(zhì)體。 缺點(diǎn)：酶制劑中均含有核酸酶、蛋白酶、過氧化物酶以及酚類物質(zhì)，影響所獲原生質(zhì)體的活力,酶解制備原生質(zhì)體過程,1)、取材預(yù)處理 2)、酶解制備 3)、原生質(zhì)體收集,1）材料預(yù)處理 (暗處理，預(yù)培養(yǎng)和低溫處理) 在酶處理前，常把供體組織置于合適濃度的穩(wěn)壓液中，使細(xì)胞預(yù)質(zhì)壁分離約一小時(shí)后再用酶液處理。 原因：預(yù)質(zhì)壁分離可使胞壁內(nèi)表層充分暴露，增加胞壁降解酶與胞壁的接觸面而提高胞壁降解速度；降低原生質(zhì)體內(nèi)電解質(zhì)滲漏，防止在

5、分離期間外來酶被吸入細(xì)胞內(nèi)，降低原生質(zhì)體對(duì)酶液中可能存在的有害影響的敏感，提高原生質(zhì)體的穩(wěn)定性和存活率,A、酶溶劑及其滲透壓 酶的種類 酶溶劑：原生質(zhì)體培養(yǎng)基或特殊配制、PH値。 滲透壓調(diào)節(jié)劑：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。 B、酶解時(shí)間：酶濃度及溫度,2）酶解考慮因素,酶的種類和濃度,纖維素酶（Cellulase） Onozuka R-10 果膠酶（Pectolyase）Y-23 半纖維素酶（Hemicellulase） 對(duì)幼葉來說，酶濃度較低：0.5-1纖維素酶，果膠酶(0.2-0.5); 酶量少 對(duì)愈傷組織、懸浮細(xì)胞：纖維素酶、果膠酶的濃度要提高到1或2。酶量大,酶液PH值：5.4-5.8，

6、因?yàn)镻H高，酶活性低；PH低，原生質(zhì)體損壞多,酶液滲透壓,裸露的原生質(zhì)體必須維持在一定的滲透壓下，才既不漲破，又不因過度收縮而破壞內(nèi)部結(jié)構(gòu)。因此在酶液中須加入滲透壓穩(wěn)定劑來代替細(xì)胞壁對(duì)原生質(zhì)體起保護(hù)作用。 常用的滲透壓穩(wěn)定劑是糖醇系統(tǒng)，包括甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。 目前大多數(shù)使用甘露醇或山梨醇，它們能穩(wěn)定地維持滲透濃度。濃度一般為0.4-0.8 mol/L。而蔗糖等易被原生質(zhì)體吸收利用，降低滲透濃度，故不常用,其它,酶液中加入葡聚糖硫酸鉀、CaCl2等鹽類,保護(hù)細(xì)胞膜、提高原生質(zhì)體穩(wěn)定性和活力,酶解處理的條件 光：一般黑暗下靜止進(jìn)行； 溫度：25，兼顧原生質(zhì)體及酶活性； 時(shí)間：幾小時(shí)到

7、幾十小時(shí)，太長不利于原生質(zhì)體的活性，一般24小時(shí)。如煙草葉片酶處理2小時(shí)后葉肉細(xì)胞解離完畢,3）原生質(zhì)體分離過程：一步法（以煙草葉片為例,第一步：預(yù)處理即對(duì)煙草植株限制供水 第二步：取幼葉常規(guī)表面消毒后在無菌條件下剝?nèi)ネ獗砥で谐?cm的小塊 第三步：制作混合酶液（纖維素酶2%和果膠酶0.5 % ）并加入的0.7 mol甘露醇0.1 m mol CaCl2. PH5.6 第四步：將小塊煙葉放入混合酶液25 處理810小時(shí) 第五步：過濾、離心、洗滌（ 0.7 mol甘露醇液含0.1 m mol CaCl2 ）。如此23次、得原生質(zhì)體,圖示原生質(zhì)體分離過程（以葉片為例,以愈傷組織為材料分離原生質(zhì)體,

8、以葉片為材料分離原生質(zhì)體,3、原生質(zhì)體的收集和純化,酶解處理后得到混合液包括原生質(zhì)體、細(xì)胞團(tuán)和組織碎片等，必須將雜質(zhì)和酶液除去，才可以繼續(xù)培養(yǎng)。 原生質(zhì)體純化方法有：離心沉淀法，漂浮法，接口法,1）離心沉淀法 篩網(wǎng)過濾（400目）除去未消化的細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)和碎片后在適當(dāng)試劑（甘露醇）內(nèi)低速離心。 優(yōu)缺點(diǎn)： 比較簡單 但不易除盡一些完整的細(xì)胞，或引起原生質(zhì)的破碎,2）飄浮法 據(jù)原生質(zhì)體比重小能在一定滲透壓的溶液（如25%的蔗糖）中漂浮得到收集。 優(yōu)缺點(diǎn)： 可以得到較為純凈、完整的原生質(zhì)體。 但完好的原生質(zhì)體數(shù)量較少。 3）沉淀法和飄浮法結(jié)合 先沉淀后漂浮，重復(fù)操作，純化后可用于培養(yǎng)或細(xì)胞融合,4）

9、接口法（界面法,采用兩種比重不同的溶液，使原生質(zhì)體處于兩液相的界面之中，其中一種溶液的密度大于原生質(zhì)體的密度，另一種溶液的密度小于原生質(zhì)體的密度，原生質(zhì)體介于兩種溶液之間。 優(yōu)缺點(diǎn)： 可以收到數(shù)量較大的純凈原生質(zhì)體，同時(shí)避免收集過程中原生質(zhì)體因相互擠壓而破碎,以柑桔為例,原生質(zhì)體分離純化流程圖,目的：檢驗(yàn)獲得的原生質(zhì)體是否真正的原生質(zhì)體 鑒定方法(針對(duì)有無細(xì)胞壁,4、原生質(zhì)體鑒定,低滲爆破法： 原生質(zhì)體在低滲溶液中吸水脹破，觀察有無細(xì) 胞壁碎片,熒光染色法： 通過熒光增白劑染色后離心去除多余染料，在熒光顯微鏡下觀察（波長3600-4400），綠光顯示有纖維素，紅光示真正的原生質(zhì)體,5、原生質(zhì)體

10、活力檢測,染色法 FDA法：FDA（二乙酸熒光素）能穿越細(xì)胞質(zhì)膜，被活細(xì)胞內(nèi)的酯酶裂解，在熒光顯微鏡下發(fā)熒光（熒光素）。 伊凡藍(lán)法：伊凡藍(lán)不能穿過質(zhì)膜，但質(zhì)膜受到嚴(yán)重?fù)p壞使細(xì)胞被染色。 胞質(zhì)環(huán)流法：是否存在胞質(zhì)環(huán)流判斷原生 質(zhì)體活力； 滲透壓變化法：活原生質(zhì)體會(huì)隨著外界滲透壓的變化體積變化。 氧電極法：活原生質(zhì)體在光照下光合放氧，無光呼吸耗氧,6、影響原生質(zhì)體活力的因素 分離材料的生理狀態(tài)； 酶解條件：酶質(zhì)量、濃度、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶溶液的滲透壓； 分離條件：離心次數(shù)、離心速度、純化方法、分離持續(xù)時(shí)間； 環(huán)境條件：操作環(huán)境的溫度、分離用具的影響,二、原生質(zhì)體的培養(yǎng),一）培養(yǎng)基 1滲透壓：原

11、生質(zhì)體的滲透壓原則是培養(yǎng)基滲透壓與細(xì)胞滲透壓等滲。常用的滲透壓調(diào)節(jié)劑：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。 2無機(jī)鹽 3有機(jī)成分：維生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。 4激素：常用的激素：NAA、IAA、BA與2,4-D 5pH值,二）原生質(zhì)體培養(yǎng)方法,液體淺層培養(yǎng) 固體培養(yǎng) 液體固體雙層培養(yǎng) 瓊脂糖珠培養(yǎng),三）影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的主要因素,基因型：如番茄與秘魯番茄有性雜交后對(duì)性狀分離的遺傳分析，證明其愈傷組織的再生能力是2個(gè)顯性基因所決定； 原生質(zhì)體的來源：供體材料體類型、供體細(xì)胞的分化程度、供體細(xì)胞的生長同步性； 起始培養(yǎng)密度與培養(yǎng)基：基本起始密度、培養(yǎng)基激素水平、密度與培養(yǎng)基營養(yǎng)成分完全性,三、原生質(zhì)體的發(fā)育和植株再生,完整細(xì)胞,一般包括如下幾個(gè)步驟： 1）細(xì)胞壁再生： 體積膨大，葉綠體重新排列，新的細(xì)胞壁開始合成，細(xì)胞由球形變成橢圓形,2）分裂： 一般在培養(yǎng)2-3天后細(xì)胞質(zhì)增加，細(xì)胞器增殖，DNA、蛋白質(zhì)等合成增加，細(xì)胞分裂，形成小的細(xì)胞團(tuán)，發(fā)育成愈傷組織或胚狀體。 3）植株再生,第一次分裂,第二次分裂,第三次分裂,多細(xì)胞團(tuán),肉眼可見細(xì)胞團(tuán),愈傷組織,愈傷組織,植物原生質(zhì)體培養(yǎng)的應(yīng)用,1、利用原生質(zhì)體融合獲得融合細(xì)胞 2、利