腫瘤分子檢測與質(zhì)量控制課件

1、深圳市人民醫(yī)院病理科 分子實驗室 姜陽陽 2015-10-27,腫瘤分子檢測方法與質(zhì)量控制,醫(yī)學(xué)發(fā)展歷程的啟示,經(jīng)驗醫(yī)學(xué),循證醫(yī)學(xué),精準(zhǔn)醫(yī)學(xué),診斷靠治療后期經(jīng)驗積累,診斷治療以人群、科學(xué)研究證據(jù)指導(dǎo)臨床實踐,診斷治療以個體為基礎(chǔ)，更加提前、具體與精確,分子時代,肺腺癌：EGFRKRASBRAFALK-ROS1RET等檢測已是共識； 肺鱗癌發(fā)生模式不同，檢測靶標(biāo)以擴增為主，同時EGFR、ALKROS1某些病例也有必要檢測,我們可以用的分子生物學(xué)手段,實時熒光PCR方法（擴增阻礙突變系統(tǒng)法（Amplification Refractory Mutation System，ARMS）、PCR-高分辨

2、溶點曲線分析（HRM）、數(shù)字PCR等） PCR-雜交法（膜上、芯片基因芯片 、乳膠顆粒Luminex） PCR-Sanger測序 PCR-焦磷酸測序 新一代高通量測序 PCR-SSCP、RFLP、dHPLC等 熒光原位雜交（FISH） 直接雜交 免疫組化,分子病理檢測的主要方法,檢測技術(shù),檢測對象,檢測基因,檢測水平,EGFR，KRAS，BRAF， BRCA, BCR-ABL，JAK2,EML4-ALK，ROS1，HER2， RET,BRCA1，TOP2A，TYMS,EGFR，EML4-ALK， HER2,是RT-PCR平臺上的特異擴增技術(shù)（易開展） 共發(fā)表300多篇文獻(xiàn) 著名的大型臨床研究

3、- 如IPASS、INFORM等,國際肺癌協(xié)會專家共識中國基因突變檢測專家共識日本臨床專家共識,ARMS技術(shù)被臨床證明的腫瘤基因突變檢測技術(shù),DNA 基因重排,融合mRNA或5/3 mRNA差異表達(dá),嵌合蛋白表達(dá),肺癌中ALK基因變異的表達(dá)調(diào)控,FISH/CISH NGS,RT-PCR 5/3比較qRT-PCR RACE-PCR,IHC,熒光原位雜交技術(shù)（FISH,2個信號分離直徑的要求，使實際應(yīng)用中結(jié)果難以判斷 有5-11%出現(xiàn)假陽性信號分離1，2，3 工作強度大，費時 主觀性強，受人為因素影響大,橫向,縱向,1. FISH技術(shù)是美國藥物臨床試驗中所采用的檢測方法。 2. 采用“分離”分析，

4、基因倒位和ALK重排后，紅色和綠色探針分開 3. 15%的樣本細(xì)胞中呈現(xiàn)分開的紅色和綠色信號表示陽性結(jié)果1,操作簡單，時間短 結(jié)果客觀，易于判讀，減少人為因素的影響 除FFPE樣本外，還適用其他類型樣本組織1 與EGFR、RET、ROS1等其他檢測不沖突，共用相同組織切片和PCR擴增程序，節(jié)約有限資源和時間 中國熒光PCR儀器普及率更高，更加適合國情,實時逆轉(zhuǎn)錄法（Real Time-PCR,CFDA批準(zhǔn)的基因檢測產(chǎn)品,基于Real Time-PCR方法檢測驅(qū)動基因的分子診斷產(chǎn)品獲得CFDA批準(zhǔn)最多,2-3 片F(xiàn)FPE樣品 同時將DNA和RNA分離出來 同時獲得EGFR、ALK和ROS1檢測結(jié)

5、果,節(jié)約樣本、節(jié)約時間、節(jié)約成本,DNA/RNA,EGFR突變型,ALK陽性 或ROS1陽性,EGFR野生型 ALK陰性 ROS1陰性,吉非替尼 厄洛替尼 ?？颂婺?阿法替尼,克唑替尼 色瑞替尼,其他治療方式,DNA/RNA共分離劑盒,EGFR/ALK+ROS1,2.5小時PCR,4.5小時,FFPE切片1-3片 或活檢小標(biāo)本,2015 NSCLC NCCN指南,對于NSCLC患者建議檢測EGFR和ALK基因狀態(tài)； 對于ROS1/MET/RET/BRAF/ HER2等嶄露頭角的靶基因也給予關(guān)注,1.室內(nèi)質(zhì)量控制 2.室間質(zhì)量評價,分子病理實驗室的質(zhì)量控制,1.建立標(biāo)準(zhǔn)化的實驗室 2.具備資質(zhì)且

6、相對固定的人員 3.性能穩(wěn)定的試劑 4.持續(xù)不斷的學(xué)習(xí)和開展質(zhì)控,醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗室管理辦法（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)2010194號） 醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴展檢驗實驗室工作導(dǎo)則（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)2010194號,FISH實驗區(qū),臨床基因擴增實驗室 標(biāo)準(zhǔn)化操作文件（sop,1.寫你所做 2.做你所寫 3.實驗室的精髓,可操作性的sop文件,人員資質(zhì),理想的試劑,試劑方法的性能驗證及每批試劑的質(zhì)檢 性能指標(biāo)： 重復(fù)性（精密度） 準(zhǔn)確性（定量：回收率、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)等；定性：方法學(xué)比較等） 線性范圍（定量） 分析特異性 測定下限 抗干擾能力,資質(zhì)認(rèn)證 試劑質(zhì)量 試劑反應(yīng)性能 前后批號結(jié)果一致性 測定下限 批內(nèi)變異（10%)和批間變異（15-25,你其實做了這些，但是你有記錄么,1.日常維護(hù) 2.定期保養(yǎng) 3.維修記錄,實驗室最忠實的員工-儀器,全流程：標(biāo)本接收-石蠟切片-核酸提純-實時熒光定量PCR擴增-結(jié)果分析 分析前：標(biāo)本接收、制片、填寫檢測申請單 分析中：核酸提取、擴增、產(chǎn)物分析、檢測有效性判斷 分析后：結(jié)果分析、報告審核、結(jié)果解釋 標(biāo)準(zhǔn)：重復(fù)，可控，規(guī)范,全流程室內(nèi)質(zhì)控,DNA模板質(zhì)量更重要，建議對提取的DNA模板進(jìn)行質(zhì)量檢測： OD260/OD280=1.80.2， OD260/OD2301.7,全流程