腫瘤分子生物標(biāo)志物的流式定量分析.ppt

1、腫瘤分子生物標(biāo)志物的流式定量分析,近年來已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種腫瘤生物分子標(biāo)志物，已將標(biāo)志物應(yīng)用于腫瘤診斷、判定療效、預(yù)測預(yù)后和轉(zhuǎn)移等方面，且有較大的腫瘤臨床和研究的實(shí)用價(jià)值，并在研究癌變的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制中引起人們的極大關(guān)注，特別在癌前期病變腫瘤標(biāo)志物研究中，成為腫瘤防治研究的熱點(diǎn)之一，已經(jīng)顯示出在癌變研究中具有重要意義。 流式細(xì)胞應(yīng)用于腫瘤分子生物標(biāo)志的檢測已有較多的文獻(xiàn)報(bào)道，如DNA異倍體、激素受體、癌基因和抗癌基因蛋白產(chǎn)物等，發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)志物與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和細(xì)胞的分化、分級、轉(zhuǎn)移和預(yù)后有一定相關(guān)性，現(xiàn)分述如下,一、DNA異倍體,研究證明，大部分惡性腫瘤有DNA含量的異常改變(DNA含量的增多

2、或減少)，Badogie等報(bào)道，實(shí)體瘤的異倍體檢出率在60-100%。由于腫瘤細(xì)胞在增殖分裂過程中出現(xiàn)DNA合成的丟失或不分離，而產(chǎn)生了DNA異常的細(xì)胞群，即出現(xiàn)DNA異常的干系(克隆)，這種DNA異常干系，即稱為DNA異倍體。流式細(xì)胞術(shù)定量分析DNA異倍體，應(yīng)用于腫瘤的早期診斷和預(yù)后評價(jià)方面,癌前病變出現(xiàn)DNA異倍體及在癌變早期診斷的意義,癌前期病變是腫瘤防治研究中的一個(gè)重要課題，從癌前病變中發(fā)現(xiàn)早期癌變的患者，并找出作為早期癌變的特征性標(biāo)志物，是人們一直努力探尋的方法，使腫瘤得到早期發(fā)現(xiàn)、早期治療具有重要意義。 研究發(fā)現(xiàn)，在眾多的癌前病例中，并非所有的癌前病變都將發(fā)生、發(fā)展成為癌癥。哪些癌

3、前病變將發(fā)生癌變，哪此將不發(fā)生癌變，是人們正在努力尋找作為癌變的恃征性標(biāo)志物,目前，從病理形態(tài)學(xué)方法對于可能癌變的病例作出一個(gè)確切的診斷標(biāo)準(zhǔn)還十分困難。 研究證明，DNA異倍體的出現(xiàn)可能是癌前病變發(fā)生癌變的一個(gè)重要標(biāo)志物，已有作者對食管、宮頸、胃、鼻咽、口腔粘膜癌前病變進(jìn)行了流式DNA倍體分析研究。 Tedori等應(yīng)用 FCM 分析了20例胃粘膜萎縮性胃炎伴不典型增生細(xì)胞的DNA倍體，發(fā)現(xiàn)DNA異倍體9例，其中5 例在隨診半年后被病理學(xué)確診為癌變，發(fā)現(xiàn)異倍體與癌前病變細(xì)胞不典型增生程度有關(guān),作者對208例石蠟包埋組織、和1000 多例食管脫落細(xì)胞的癌前病變細(xì)胞流式 DNA 倍體分析(見表15)

4、，并指出如下診斷標(biāo)準(zhǔn)，供參考。 1.出現(xiàn)DNA異倍體峰位診斷陽性。 2.S期細(xì)胞大于15%，G2M期大于10%(突出的四倍體峰位)診斷為陽性。 3.S期細(xì)胞大于 10-15%， 并有突出四倍體峰位，診斷為可疑癌。 4.GO/1期細(xì)胞峰的CV值大于9%，作為參考指標(biāo),我們的研究結(jié)果(見表16)，表明DNA異倍體可能是重要的癌變標(biāo)志物,從癌前病變中發(fā)現(xiàn)早期癌變和潛在癌變病例，并對其作出一個(gè)早期預(yù)警性診斷，已成為人們十分關(guān)注的研究焦點(diǎn)，通過對癌前病變細(xì)胞DNA異倍體的FCM檢測，可能有助于對癌前病變作出病理學(xué)診斷的超早期癌診斷。 研究發(fā)現(xiàn)癌前病變細(xì)胞DNA含量與病變不典型增生程度密切相關(guān)(見表17)

5、。DNA指數(shù)隨不典型增生增高逐漸漸升高，從DNA含量進(jìn)一步說明癌變并非由正常細(xì)胞突發(fā)為癌細(xì)胞，而是經(jīng)過一個(gè)量變到質(zhì)變的過程，癌前病變即處于量變過程,出現(xiàn)DNA異倍體細(xì)胞群則證明從量變到質(zhì)變的過程，Tedori 等認(rèn)為，當(dāng)癌前病變出現(xiàn) DNA異倍體時(shí)， 說明已發(fā)生癌變或已具有潛在癌變的可能性， 盡管還不具備病理形態(tài)學(xué)的癌變診斷標(biāo)準(zhǔn)， 大多數(shù)研究者還發(fā)現(xiàn)，癌前病變不典型增生程度越重，DNA非整倍體出現(xiàn)率越高，不典型增生程度越重，癌變的發(fā)生率越高。 由此可見，癌前病變出現(xiàn)DNA非整倍體對預(yù)測和診斷癌變是一個(gè)重要而有價(jià)值的標(biāo)志物， 對于形態(tài)學(xué)上診斷為癌前病變的病例， 有必要進(jìn)行 DNA 倍體的檢測，

6、對出現(xiàn)DNA異倍體病人，應(yīng) 進(jìn)行密 切的隨訪， 及時(shí)發(fā)現(xiàn)早期癌 變征象，做到早診斷、早治療,二、抑癌基因P53蛋白,從生物分子水平研究證明，腫瘤是基因性疾病，是由某些致癌基因激活或抑癌基因的失活(突變或丟失)及其功能的調(diào)控失常而促發(fā)腫瘤，當(dāng)各種致癌因子參與下誘導(dǎo)癌基因和抑癌基因的異常改變，其效應(yīng)分子的基因蛋白產(chǎn)物的過量表達(dá)，它們相互之間在腫瘤的發(fā)生發(fā)展上起著重要作用,因此，對癌基因與抗癌基因與癌變的關(guān)系研究成為腫瘤研究的熱點(diǎn)之一，已隨著分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展和單克隆抗體技術(shù)的應(yīng)用，大量具有高度特異性識別腫瘤細(xì)胞內(nèi)外抗原的單克降抗體出現(xiàn)，為腫瘤研究尋找到了很多新的標(biāo)志物。 癌基因和抑癌基因在人體

7、組織的調(diào)整作用，是通過其效應(yīng)分子蛋白質(zhì)產(chǎn)物。近年來，由于生產(chǎn)出多種高度特異的癌基因蛋白產(chǎn)物的單克隆抗體，為探索癌基因與腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及與腫瘤的生物學(xué)特性關(guān)系的研究辟出了新徑,P53基因是近年來發(fā)現(xiàn)的具有重要作用的抑癌基因，定位于人的17號染色體(17、13、1)其早在1979年就發(fā)現(xiàn)了P53基因。 當(dāng)時(shí)是在被惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為是一個(gè)原癌基因(oncogene)，因此沒有引起研究者的重視，直到1989年，一些科學(xué)家的研究有了新發(fā)現(xiàn)，認(rèn)為P53基因存在兩種類型：即野生型(wild type)和突變型(Mutant type)，這兩種類型的P53基因在人體內(nèi)具有兩種不同的作用,野生型P5

8、3可以阻止細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，并可阻止受損傷細(xì)胞 DNA無法修復(fù)的細(xì)胞DNA復(fù)制過程，引起細(xì)胞凋亡 (Apoptosis)或程序性細(xì)胞死亡(program cell death. pcd)。這一發(fā)現(xiàn)使人們認(rèn)識到野生型P53的一個(gè)重要功能是作用細(xì)胞增殖周期的一個(gè)調(diào)控點(diǎn)(check-point)。 野生型 P53 基因的丟失和突變，使 P53基因正常功能喪失，而成為突變型P53基因，科學(xué)家研究認(rèn)為， 突變型 P53 可導(dǎo)致細(xì)胞增殖功能的增強(qiáng)。突變后的P53不但失去了正常調(diào)控細(xì)胞增殖分化的功能，而且可變?yōu)橐粋€(gè)直接的腫瘤基因， 對細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化起促進(jìn)作用,近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在人類大多數(shù)惡性腫瘤中均存在P5

9、3突變基因，而且不同的致癌物可引起不同的特異性突變譜。因此P53基因的突變已引起腫瘤研究者極大關(guān)注。 研究認(rèn)為，癌基因致癌作用是通過其效應(yīng)分子的癌基因蛋白來發(fā)揮其對細(xì)胞的轉(zhuǎn)化作用的。因此，檢測癌基因蛋白 的表達(dá)量是一種極有效的研究方法。 研究證明，野生型P53基因蛋白具有極不穩(wěn)定的構(gòu)型，半衰期很短(約30分鐘)，因此，在正常狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)含量甚微，一般方法很難測量到。然而，突變后的P53基因，其蛋白發(fā)生了構(gòu)型上的改變，半衰期明顯延長，穩(wěn)定性增強(qiáng)，在細(xì)胞內(nèi)形成堆積，含量增高,近年來許多學(xué)者應(yīng)用流式細(xì)胞免疫熒光技術(shù)并結(jié)合鼠抗人P53基因蛋白單克隆抗體，對多種人類腫瘤進(jìn)行了P53基因蛋白的定量檢測，均

10、檢出異常P53蛋白的過量表達(dá)。Morkve等應(yīng)用FCM首先對石蠟包埋支氣管肺癌細(xì)胞的P53蛋白進(jìn)行了定量檢測，并提出用熒光指數(shù)(Fluoresence Ind -ex FI)來表示P53蛋白表達(dá)量。 他們的研究發(fā)現(xiàn)， P53的表達(dá)量與肺癌細(xì)胞的分化程度相關(guān)，未分化型的小細(xì)胞肺癌P53的表達(dá)量和陽性表達(dá)均明顯高于分化型的肺癌的P53表達(dá)量，還發(fā)現(xiàn)P53表達(dá)陽性的腫瘤細(xì)胞S期細(xì)胞百分比明顯高于P53表達(dá)陰性者,由此認(rèn)為，突變后的P53蛋白可能調(diào)節(jié)惡性腫瘤細(xì)胞增殖速度加快，DNA合成加速起重要作用。 齊鳳英等應(yīng)用FCM分析了乳癌和乳腺良性病變細(xì)胞P53蛋白表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)良性病變伴有導(dǎo)管上皮異型增生細(xì)胞

11、P53蛋白的表達(dá)量增高。說明P53蛋白的過量表達(dá)在乳腺正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化一一癌變過程中起直接參與作用，揭示P53突變蛋白的表達(dá)將有可能作為癌變早期診斷的一個(gè)標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)P53蛋白的表達(dá)量與乳癌細(xì)胞的分化程度密切相關(guān)， P53蛋白的高表達(dá)多在浸潤性乳癌，高度浸潤性生長分化差的乳癌P53表達(dá)強(qiáng)陽性,他們還研究了乳癌P53表達(dá)量與DNA倍體和預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)DNA異倍體乳癌P53表達(dá)量明顯高于二倍體乳癌，P53表達(dá)量高的乳癌細(xì)胞增殖活性高于P53表達(dá)量低的乳癌。 研究結(jié)果表明，P53蛋白的表達(dá)量與乳癌的預(yù)后密切相關(guān)，P53陽性表達(dá)的乳癌生存期短，P53陰性表達(dá)的乳癌生存期長，認(rèn)為檢測P53蛋白的表達(dá)量

12、可作為乳癌一個(gè)實(shí)用的新的預(yù)后標(biāo)志物,還有作者研究FCM檢測乳癌P53蛋白表達(dá)的單因素與預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)P53陽性表達(dá)的乳癌生存期短，且常伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳癌P53表達(dá)陽性，既使淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移，但P53表達(dá)陽性乳癌生存期亦短，證實(shí)P53突變，表達(dá)量增高可能是一個(gè)有別于其他預(yù)后因素而成為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后監(jiān)測指標(biāo)。 還有一些作者研究了膀胱癌、結(jié)直腸癌等細(xì)胞的P53表達(dá)，也證實(shí)了P53與腫瘤病理分級相關(guān)，隨病理分級的增高而P53表達(dá)增強(qiáng)。P53的表達(dá)與腫瘤的復(fù)發(fā)、生存率亦有關(guān)，過量表達(dá)的腫瘤患者生存期短，易復(fù)發(fā)，預(yù)后差,應(yīng)用FCM檢測腫瘤P53基因蛋白的異常表達(dá)提供了客觀的量化參量，為判斷腫瘤的惡性度、預(yù)

13、后以及指導(dǎo)臨床治療，提供新的腫瘤標(biāo)志物。 P53基因失活性突變參與了一系列人類實(shí)體癌的早期發(fā)展，業(yè)已證明P53基因突變直接影響（3 階段)直腸腺瘤(包括結(jié)腸腺瘤)向直腸腺癌(包括結(jié)腸腺癌)的轉(zhuǎn)化。從臨床腫瘤學(xué)的觀點(diǎn)P53基因突變是處在癌變前的階段。但從癌癥發(fā)生的全過程來看，P53基因突變是處于癌癥發(fā)生與發(fā)展的中后階段(如圖 26,圖26 結(jié)直腸癌的多階段發(fā)生過程,至今癌癥的確診主要依靠細(xì)胞病理學(xué)，大多不能分辨癌癥的病因，發(fā)現(xiàn)P53 特征性突變將有可能使癌癥的研究從細(xì)胞水平進(jìn)入分子水平，從能確診癌的細(xì)胞病理學(xué)進(jìn)入能分析基因特征結(jié)構(gòu)的分子生物學(xué)，流式細(xì)胞技術(shù)是能保持細(xì)胞和亞細(xì)胞成分的完整生活狀態(tài)下

14、，進(jìn)行定量分子分析方法。并可為其他分析技術(shù)，提供富集制樣基礎(chǔ)，無疑地，它將為上述轉(zhuǎn)變提供重要的技術(shù)基礎(chǔ),三、癌基因蛋白產(chǎn)物,ras P21蛋白 自八十年代發(fā)現(xiàn)ras原癌基因以來，腫瘤研究人員對其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)多種人類腫瘤中存在ras癌基因的激活，認(rèn)為ras基因在腫瘤發(fā)生的生物機(jī)制中起著十分重要的作用，并發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤的早期發(fā)生和預(yù)后有關(guān)，所以ras癌基因的激活和其蛋白P21的表達(dá)研究已成為目前研究的熱點(diǎn)之一,在眾多的癌基因中，人們最關(guān)注、研究最深入的是ras原癌基因。在人類惡性腫瘤中，最常見的癌基因之一，ras基因的激活能啟動和加速細(xì)胞的生長、增殖以致引發(fā)細(xì)胞的

15、惡性轉(zhuǎn)化，ras原癌基因族(K-ras、N-ras、Ha-ras)P21蛋白產(chǎn)物是一種共同表達(dá)的蛋白。 研究證明，ras癌基因的激活與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)，當(dāng)癌變發(fā)生時(shí)，ras癌基因首先激活，P21蛋白常出現(xiàn)過量表達(dá)，ras P21蛋白已被證明在各種人類腫瘤(乳腺癌、肺癌、胃癌)有過量表達(dá),有作者應(yīng)用FCM定量分析了膀胱早期癌P21蛋白的表達(dá)含量，發(fā)現(xiàn)早期癌病變中的P21蛋白表達(dá)增高，認(rèn)為P21蛋白是腫瘤早期階段的標(biāo)志物，推測ras癌基因在腫瘤早期就已激活，并隨著腫瘤的發(fā)展，進(jìn)一步參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。 還有作者應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)定量研究胃癌前病變，口腔癌前病變的ras P21蛋臼的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ra

16、s P21蛋白的表達(dá)量與癌前病變不典型增生程度密切相關(guān)，說明ras癌基因的激活，在癌變過程中起重要作用，而隨不典型增生程度的加重，其表達(dá)量逐漸增高。認(rèn)為ras P21蛋白的表達(dá)量有希望成為癌變早期診斷的一個(gè)標(biāo)志物,同時(shí)還發(fā)現(xiàn)P21蛋白的表達(dá)量與胃癌惡性程度無關(guān)，與口腔癌惡性分級有關(guān)，但大多數(shù)研究證明，ras P21表達(dá)是與腫瘤的DNA倍體相關(guān)，DNA異倍體的腫瘤P21表達(dá)量明顯高于DNA二倍體的腫瘤，說明ras P21的表達(dá)量多少，明顯地調(diào)控及影響著惡性細(xì)胞DNA合成及其DNA含量的異常改變。 P21的表達(dá)與腫瘤的增殖分裂具有極好的相關(guān)性，表達(dá)陽性的腫瘤其S期百分率明顯高于表達(dá)陰性的腫瘤。說明

17、ras P21蛋白在腫瘤生長增殖過程中起著重要調(diào)控作用,大多定量研究ras P21表達(dá)量的報(bào)道證實(shí)P21蛋白的表達(dá)與腫瘤病人的預(yù)后密切相關(guān)，有作者在對膀胱癌的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P21蛋白表達(dá)量高(或表達(dá)陽性)復(fù)發(fā)率及死亡率明顯高于陰性表達(dá)者，且存活期短，說明P21的過量表達(dá)，預(yù)示腫瘤具有更惡性生物學(xué)行為，揭示腫瘤易復(fù)發(fā)，預(yù)后不良。 有些作者認(rèn)為，P21表達(dá)量檢測，可以作為腫瘤復(fù)發(fā)的一個(gè)早期信號，如果結(jié)合病理分級、臨床分期和P21的定量分析，綜合性的判斷惡性腫瘤病人的預(yù)后，對評價(jià)預(yù)后無疑具有十分重要的意義,癌基因C-erbB-2蛋白產(chǎn)物,癌基因C-erbB-2位于17號染色體Q21區(qū)帶上，編碼分子為

18、185190k 。有作者研究認(rèn)為，C-erbB-2癌基因活化，其蛋白產(chǎn)物過量表達(dá)在癌癥的發(fā)生機(jī)制中起重要作用。 近來有人發(fā)現(xiàn)C-erbB-2基因蛋白過量表達(dá)和乳腺癌的轉(zhuǎn)化機(jī)制有特殊關(guān)系，他們用NIH/3T3細(xì)胞做轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)C-erbB-2基因具有促發(fā)腫瘤的作用，C-erbB-2蛋白的過量表達(dá)，使細(xì)胞增殖失去調(diào)控，促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化,目前研究最多是c-erbB-2癌基因蛋白與乳腺癌的關(guān)系，很多文獻(xiàn)報(bào)道了C-erbB-2在乳癌細(xì)胞中的過量表達(dá)與乳癌的組織分級，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及激素受體、細(xì)胞增殖周期和DNA倍體以及和臨床預(yù)后關(guān)系。 有人應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的免疫熒光技術(shù)定量研究了乳腺癌、乳腺囊性增生和囊性增

19、生癌變細(xì)胞的C-erbB-2蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)囊性增生和囊增癌變細(xì)胞的C-erbB-2蛋白表達(dá)量逐漸增高，提示在囊性增生并癌變的過程中，C-erbB-2蛋白的過量表達(dá)是早期癌變的一個(gè)標(biāo)志物，可作為乳癌早期診斷的一個(gè)參考指標(biāo),他們的研究還發(fā)現(xiàn)，C-erbB-2蛋白過量表達(dá)的乳癌，DNA含量常為異倍體，且增殖指數(shù)也增高。 說明C-erbB-2蛋白過量表達(dá)對加速細(xì)胞DNA合成和細(xì)胞增殖有重要作用，大部分研究報(bào)道認(rèn)為，乳腺癌細(xì)胞中C-erbB-2蛋白的表達(dá)與如下參量有關(guān),與組織學(xué)分級有關(guān)，隨分級的增高，C-erbB-2呈現(xiàn)高表達(dá)。 與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無轉(zhuǎn)移有關(guān)。 與DNA倍體有關(guān)，二倍體腫瘤表達(dá)量低，異倍體腫

20、瘤表達(dá)高。 與雌激素受體有關(guān)，C-erbB-2蛋白過量表達(dá)的乳癌，受體常為陰性。而表達(dá)量低的乳癌，受體常為陽性。 與臨床預(yù)后有關(guān)，C-erbB-2表達(dá)過量的乳癌，無病生存期和總存活期明顯縮短，常出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，而C-erbB-2蛋白表達(dá)量低，預(yù)后較好，認(rèn)為是一個(gè)重要的預(yù)后參數(shù),四、腫瘤轉(zhuǎn)移基因CD44,CD44基因位于人類11號染色體的短臂上，可分為兩種類型，按其外顯子表達(dá)方式，可稱為組成型CD44S和變異型CD44V。 研究表明，正常情況下，CD44S基因蛋白是廣泛存在細(xì)胞膜的跨膜糖蛋白，在大多數(shù)上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等均可以檢測到該糖蛋白的表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)，CD44基因蛋白的作用，主要參

21、與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的特異性連接，有如下功用,介導(dǎo)淋巴細(xì)胞與毛細(xì)血管的小靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合。 參與淋巴細(xì)胞的活化。 能與細(xì)胞外基質(zhì)中的透明質(zhì)酸膠原蛋白、纖維粘連蛋白、層連蛋白分子結(jié)合。 參與細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合，使細(xì)胞偽足形成，參與細(xì)胞遷移運(yùn)動。 變異型CD44V基因與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系，是近期人們最新的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的，目前已成為研究腫瘤轉(zhuǎn)移的一個(gè)新的熱點(diǎn)課題,研究發(fā)現(xiàn)，正常組織中和沒有轉(zhuǎn)移能力的惡性細(xì)胞主要有 CD44S基因蛋白表達(dá)，而具有轉(zhuǎn)移能力的惡性細(xì)胞主要是變異型CD44V基因蛋白的高表達(dá)，但在正常上皮細(xì)胞中變異型CD44V僅有很弱的表達(dá)，確切證實(shí)變異型CD44V基因與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，是在

22、1991年德國學(xué)者Gunth-er等首先報(bào)道了他們突破性研究結(jié)果。 他們從大鼠胰腺癌細(xì)胞中分離到了具有轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞株和沒有轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞株，然后用具有轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞膜蛋白作為抗原，制備出了單抗腫瘤細(xì)胞與抗體結(jié)合，而不與沒有轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞結(jié)合，經(jīng)過對這一單抗的序列分析后證實(shí)為變異型CD44V基因蛋白,將變異型CD44V基因首先用于臨床腫瘤標(biāo)本的研究是英國學(xué)者M(jìn)atsumura和他的同事們，他們檢測了乳腺癌和結(jié)腸癌，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移癌都有高水平的CD44V表達(dá)而從非轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞僅能檢出很弱的表達(dá)。 最近有學(xué)者應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和抗人CD44單克隆抗體，對種植于小鼠體內(nèi)黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行了研究分析，認(rèn)為CD44在

23、腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移機(jī)制中具有重要作用,我們應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析了膀胱癌，乳腺癌細(xì)胞的變異型CD44V基因蛋白產(chǎn)物的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳癌均有強(qiáng)的表達(dá)量，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳癌僅有較弱的表達(dá)量。變異型CD44基因蛋白的表達(dá)和腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系的研究尚處于初步研究階段。 有許多未知有待更深入的探討，相信隨著CD44基因的研究進(jìn)一步深入將會為腫瘤的轉(zhuǎn)移和診斷提供新的標(biāo)志物,五、血型糖蛋白A (GlyCopt1orin A. GPA,人類體細(xì)胞突變的發(fā)生，及其在癌發(fā)生的生物分子機(jī)制中的作用研究，越來越引起腫瘤學(xué)者的極大關(guān)注。當(dāng)人體遭受到致癌因子的損害后，存在于骨髓中的紅系造血干細(xì)胞的血型糖蛋白A基因位點(diǎn)發(fā)生

24、突變，并產(chǎn)生變異的子代紅細(xì)胞，這種改變可成為一種標(biāo)記而長期保留下來，而形成紅細(xì)胞變異株。變異株紅細(xì)胞表面所攜帶有GPA抗原(即 M/N血型決定簇)，這種變異的GPA抗原物質(zhì)是一種特異性的標(biāo)志物，它的一對等位基因位于染色體4Q28-31,目前，已經(jīng)分離克隆出抗變異型紅細(xì)胞GPA的單克隆抗體，用熒光探針標(biāo)記這些抗體就可用流式細(xì)胞術(shù)檢測這些血液中紅細(xì)胞的GPA變異株的頻率，為研究人類活體細(xì)胞突變找到一個(gè)簡便的新方法。 有作者使用流式細(xì)胞術(shù)并結(jié)合抗GPA變異型單克隆抗體，對食管癌前病變患者紅細(xì)胞膜GPA的表達(dá)和變異株頻率進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)癌前病變患者的M/N血型的變異株GPA表達(dá)明顯高于正常人，說明GP

25、A變異株的檢測頻率，對有癌變傾向的個(gè)體，可作為一個(gè)有重要意義的監(jiān)測標(biāo)志物,也有學(xué)者將FCM-GPA表達(dá)的檢測應(yīng)用于放射線損害和腫瘤化療藥物引起人類體細(xì)胞突變的檢測，發(fā)現(xiàn)在日本廣島原子彈爆炸后的幸存者中，其GPA變異紅細(xì)胞頻率與其爆炸時(shí)(1945年)的受輻射劑量相關(guān)，至今已40多年后的幸存者，其骨髓紅系造血干細(xì)胞GPA位點(diǎn)上仍有突變點(diǎn)并仍可檢出變異的子代細(xì)胞。 這種FCM檢測紅細(xì)胞膜上GPA變異株的方法，比其他檢測體細(xì)胞突變的方法(DNA修復(fù)試驗(yàn)，微核檢測，染色體畸變率檢測等，這些方法都需要在體外進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，需要幾天或幾周時(shí)間才可得出結(jié)果)有很大優(yōu)點(diǎn)?？芍苯訌幕铙w取少量全血，在1-2小時(shí)之內(nèi)就

26、可檢出結(jié)果，可應(yīng)用于大量人群體細(xì)胞突變的研究，為腫瘤的早期診斷和防治工作提供新的線索和依據(jù),六、腫瘤多藥抗藥性基因蛋白的流式分析,多抗藥性(Multidrug resistant，Mdr)基因蛋白P糖白是近年來的腫瘤抗藥性的分子學(xué)基礎(chǔ)。腫瘤細(xì)胞的抗藥性具有極復(fù)雜的分子生物機(jī)制，是影響腫瘤化療療效的主要障礙，腫瘤細(xì)胞一旦對一種化療藥物產(chǎn)生抗性，對其他結(jié)構(gòu)和功能不同的化療藥物也會產(chǎn)生抗藥現(xiàn)象(即為多抗藥性)。因此腫瘤多抗藥性的研究尤其引人重視,80年代中期已經(jīng)有人從Mdr細(xì)胞株中分離出人類Mdr基因，其基因產(chǎn)物的編碼為P-糖蛋白，并將人類多抗藥基因轉(zhuǎn)染小鼠NIH3T3細(xì)胞，得到了多抗藥性的細(xì)胞株，

27、用抗P-糖蛋白的特異性單克隆抗體檢出了該細(xì)胞株有人類Mdr基因蛋白產(chǎn)物的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了P-糖蛋白是產(chǎn)生多抗藥性的物質(zhì)基礎(chǔ)。 P-糖蛋白介導(dǎo)多抗藥基因，在人類分兩型，即Mdr1型、Mdr2型，均位于人的7號染色體上， Mdr1型和Mdr2型基因產(chǎn)物具有80%的同源性，但經(jīng)過基因轉(zhuǎn)染試驗(yàn)證實(shí)Mdr2基因產(chǎn)物與多抗藥性無關(guān)，但Mdr2的作用和生理功能有待進(jìn)一步探討,Mdr1型是與腫瘤多抗藥性有關(guān)的重要基因之一，P-170kd糖蛋白是Mdr1型基因表型的分子基礎(chǔ)，它具有ATP依賴性主動轉(zhuǎn)運(yùn)泵的功能，可將藥物從細(xì)胞中泵出，從而降低細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，P-糖蛋白是一種跨膜蛋白分子，主要分布在胞漿膜內(nèi)一側(cè)，僅有很少一部分分子在細(xì)胞膜表面。 近年來，已經(jīng)對P-糖蛋白與臨床腫瘤多抗藥性的關(guān)系進(jìn)行了大量的探索，并已克隆產(chǎn)生了抗P-糖蛋白的單克隆抗體，現(xiàn)在已有售出商品的單抗，由Malvern等生產(chǎn)的抗P-170糖蛋白C219單抗、Scheper等生產(chǎn)的JSB-1單抗、Victor Ling等生產(chǎn)的Ab-1多克隆抗體，這些抗體的問世，大大推動了腫瘤多抗藥性的研究工作,最近幾年，又將流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用到測定腫瘤細(xì)胞多抗藥性的研究，有作者認(rèn)為，F(xiàn)CM定量測定P-糖蛋白的表達(dá)量和測定