免疫表面展示 Dll4 蛋白的家蠶桿狀病毒對【推薦論文】

1、免疫表面展示 dll4 蛋白的家蠶桿狀病毒對小鼠肺癌的抑制作用張浩1，張耀洲25（1. 浙江理工大學生命科學院，杭州 310018；2. 天津市國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，天津 300457）摘要：dll4(delta-like 4)蛋白是 notch 信號通路的一個配體，在血管生成過程中起到關(guān)鍵作 用。據(jù)研究，在許多腫瘤中如乳腺癌、胃癌等都存在 dll4 蛋白過表達現(xiàn)象。當封閉 dll4 通 路時腫瘤會因所生成的血管分支過多，無功能化，無法正常輸送氧氣和營養(yǎng)從而抑制腫瘤的10生長。將人源 dll4 基因利用重疊 pcr 方法與家蠶桿狀病毒信封蛋白 gp64 的信號肽序列和 跨膜區(qū)序列連接。并將該

2、片段插入到 pfastbac1 載體多克隆位點 bamh1 和 xhol1 兩個酶切 位點之間。利用 bac-to-bac 系統(tǒng)，構(gòu)建表面展示 dll4 蛋白的家蠶桿狀病毒。經(jīng) westerblotting及細胞免疫熒光檢測證明重組的桿狀病毒在家蠶細胞中表達 dll4 蛋白。將重組桿狀病毒bmn 細胞進行擴增,并將病毒上清液 50000rpm 超速離心 45mins，用 pbs 重懸沉淀，進行 30%15和 60%的蔗糖梯度密度離心，收集區(qū)帶，脫糖后，取少量制樣，進行 western blotting 鑒定， 結(jié)果表明純化獲得的桿狀病毒中含有 dll4 蛋白。將脫糖后獲得的病毒進行蛋白定量后，

3、以 每份 100g 粗蛋白注射免疫 c57bl/6 小鼠。每隔七天進行一次免疫，連續(xù)免疫 3 次，第三 次免疫后第二天接種小鼠 lewis 肺癌細胞。每隔一日檢查并記錄腫瘤生長情況。接瘤 12 天 后，對實驗小鼠眼眶取血，并拉頸處死，剝?nèi)×鲶w，測量體積。將所取的血清用 elisa 檢20測 dll4 抗體效價。經(jīng)檢測，在 10g/ml 抗原包被的情況下疫苗組小鼠血清中 dll4 抗體效 價為 1：3200，而免疫野生桿狀病毒組及對照組未檢測到 dll4 抗體。與對照組比較，疫苗免疫組的腫瘤體積約為對照組的 50%，說明免疫表面展示 dll4 蛋白的家蠶桿狀病毒對小鼠肺 癌具有一定抑制作用。關(guān)鍵

4、詞：分子生物學；桿狀病毒；dll4；腫瘤疫苗25中圖分類號：r73-36+2the inhibition of immuning bmnpv displaying dll4 to mouse lung canerzhang hao1, zhang yaozhou230(1. zhejiang sci-tech university school of life sciences, hangzhou 310018;2. tianjin international joint of biotechnology&medicine, tianj in 300457)abstract: it is re

5、port that dll4 have be detected over expression in majority kinds of cancer such as breast cancer，gastric cancer，lung cancer. when blockade dll4 function results in hypersprouting due to the loss of lateral inhibition of the endothelial tip cell phenotype mediated35through notch1. as a consequence,

6、an excessive, but nonproductive, angiogenic response is mounted, characterized by poor perfusion that results in hypoxia. amplified human dll4 gene and signaol pepitide, transmembrane area of gp64 with pcr then spliced with overlap extension pcr. clone the sp-dll4-tm into pfastbac1 between bamh1 and

7、 xhol1 clonesite, transformating ppastbac1gp64dll4 into dh10bac, choosing white spot culture and extracting bacmid genome,40using liposome transfect into bmn cell. after six days, cell loat obviously. extract viral genome, pcr identification. then transfer the virus in the bottle of bmn,after three

8、days,12000 rpmcentrifugal 30 mins, collect the cells and supernatant, 50000 rpm speed centrifugal 45 min, with pbs suspending precipitation, 30% and 60% sucrose density gradient centrifugation, collecting zone, take off sugar, take a small amount of sample preparation, western bloting appraisal. aft

9、er45taking off sugar , quantitate each 100 g protein immune c57bl/6 mice every seven days,continuous immune three times.the second day after the last immune . inoculate lewis lung cancer基金項目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃“863”項目（2011aa100603）作者簡介：張浩，（1988-），男 碩士，基因治療。通信聯(lián)系人：張耀洲，(1964-)，男，教授，家蠶生物反應(yīng)器。e-mail: yaozhouchina

10、cells in mouse. every two day inspecte and record tumor growth situation. after tumor 12 days later, taking blood from mice eyes for detecting dll4 antibody titer with elisa and pull mice neck to death, measuring cancer volume. in the concentration of 10 g/ml antigen ,thevaccine mice50serum d

11、ll4 valence is 1:3200. comparing with control group, the vaccine immune group of tumor size is about only 50% of the control group.keywords: molecular biology; baculovirus; dll4; cancer vaccine0引言55腫瘤綜合治療的重要策略之一就是靶向針對宿主血管系統(tǒng)，抑制腫瘤生長1。最近幾年， 貝伐單抗（bevacizumab avastin）能夠與人血管內(nèi)皮生長因子（vegf）結(jié)合并阻斷其生物 活性，被成功利用于臨

12、床治療多種癌癥，包括乳腺癌、結(jié)腸癌等2-3 。最近研究發(fā)現(xiàn)， dll4(delta-like 4)有選擇的在惡性腫瘤組織表皮中過度表達，而在正常的乳腺或結(jié)腸表皮中 并未發(fā)現(xiàn)異常4-5。幾個研究團隊在臨床模型和實驗小鼠模型實驗中表明，若封閉 dll4 信號60通路，由于對血管內(nèi)皮細胞中出芽細胞側(cè)面抑制消除導(dǎo)致血管過度出芽6。因此，一個過多 的，無功能的血管生長會導(dǎo)致血液流經(jīng)量減少，無法運輸營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，從而抑制腫瘤的 生長7-8。利用 dll4 特異性抗體堵塞 notch 信號通道，或者利用 dll4 可溶性蛋白 fc 融合能 夠附束住 notch 受體，阻滯 dll4 的激活，這些實驗顯示了

13、強有力的抗癌效果。那么能否研 制一類以 dll4 為靶點疫苗來抑制腫瘤的生長？因此，文章利用表面展示 dll4 的家蠶桿狀病65毒免疫 c57bl/6 小鼠，使其體內(nèi)產(chǎn)生針對 dll4 的抗體，從而降低腫瘤中 dll4 的水平，導(dǎo)致 腫瘤血管過多的分支，無功能化，最終達到抑制腫瘤生長的目的。1材料與試劑1.1材料載體 pmd18-tdll4 購自北京憶翹神舟科技有限公司；c57bl/6 小鼠由中國軍事醫(yī)學科70學院動物研究中心提供；pfastbac1 載體購自 invitrogen 公司1.2試劑主要試驗試劑來源：低糖 dmem 培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清（gibico），弗氏佐劑、 turbof

14、ecttm 體外轉(zhuǎn)染試劑、高保真 dna 聚合酶 phuscin、各類內(nèi)切酶 （fermentas），病 毒基因組提取試劑盒（sigma）,實時熒光定量 pcr 試劑盒（roche）。752實驗方法2.1pfastbac1gp64dll4 載體構(gòu)建以野生家蠶桿狀病毒基因組為模板，將信封蛋白 gp64 的信號肽基因和跨膜區(qū)基因通過pcr 獲得。以 gp64-sp-f /gp64-sp-r 互為引物，pcr 擴增。gp64-sp-f: 5-agtaggatccatggtaggcgctattg-380gp64-sp-r: 5-acgctgccgctaacgccgcaaagg-3以 gp64-tm-f

15、 /gp64-tm-r 互為引物，pcr 擴增。gp64-tm-f: 5-agtaggatccatggtaggcgctattg-3gp64-tm-r:5-acgctgccgctaacgccgcaaagg-3利用重疊 pcr 將其連接起來。以 sp-dll4-f，dll4-tm-r 為引物，pcr 擴增。85sp-dll4-f:5- tgcctttgcggcgttagcggcagcgtccc-39095100105110dll4-tm-r:5-aattcgccttcagctacctccgtggcaatg-3將信號肽 sp，跨膜區(qū) tm 與 dll4 基因的 pcr 產(chǎn)物割膠回收，進行重疊 pcr

16、。以gp64-sp-f,dll4-tm-r 為引物，信號肽 sp 和 dll4 基因 pcr 產(chǎn)物分別 5 l，pcr 擴增。 再將重疊的 pcr 產(chǎn)物回收，同樣的方法與跨膜區(qū) tm 重疊 pcr 擴增，獲得 sp-dll4-tm片段。將回收的 pcr 片段用酶切酶酶切切半小時，割膠回收 ，同時將 pfastbac1。重疊 pcr 產(chǎn)物，經(jīng)割膠回收，將 pfastbac1 載體和回收產(chǎn)物同時用 bamh1 和 xho1 雙酶切，割膠回收， 然后用 ligation high 連接。經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌 tg1 感受態(tài)，挑斑鑒定，挑取單克隆進行質(zhì)粒 酶切、pcr 鑒定，并測序。2.2bmnpvgp64

17、dll4 的獲得用構(gòu)建好的載體 pfastbac1gp64dll4 質(zhì)粒 5l 轉(zhuǎn)化 dh10bac 感受態(tài)，42熱激五分鐘， 加 lb 培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng) 4 h，均勻涂布于已經(jīng)涂好 x-gal 和 iptg 的三抗板上。37避光培養(yǎng)48 h，待藍斑明顯顯現(xiàn)，挑去白色單菌落。37震蕩培養(yǎng) 48 h，用堿裂解法提取 bacmid。 將提取獲得的 bacmid 進行鑒定。將鑒定成功的重組 bacmid 濃度檢測符合轉(zhuǎn)染要求，分別 取 8l bacmid 與 8l 脂質(zhì)體與已含有 200l 無血清培養(yǎng)基（sf-900sfm）eppendorf 管中 混勻，室溫孵育 20min，取生長狀態(tài)良好覆蓋率為

18、60%左右的 bmn 細胞，將 bacmid 脂質(zhì) 體復(fù)合物加入細胞中。28培養(yǎng) 5 天，細胞發(fā)病呈圓形，漂浮于培養(yǎng)基。收集細胞，離心，4保存。取病毒上清提病毒基因組，pcr 鑒定。2.3注射用病毒的樣品的制備2.3.1桿狀病毒純化將接種病毒 3 天后的細胞收集，先 12000 rpm 離心 30 min，然后 18000 rpm 離心 30 min， 取上清液轉(zhuǎn)移到超離管中，配平，50000 rpm 離心 45 min。用無菌 1ml pbs 重懸沉淀，用移 液槍吹打混勻。先在超速離心管中加入 5 ml 的上一步所獲取的含病毒樣品的溶解液，然后 在離心管中依次加入 30 % ,60 %的蔗糖

19、,加時用長針頭從底部往上加。50000 rpm 離心 1h, 發(fā)現(xiàn)在 30 %與 60 %之間有一條明亮的帶，用長針頭將帶都吸取出來，收集起來。再超離去 蔗糖，即最后獲得了純化的病毒。-20度凍干備用。1151202.3.2蛋白定量將 bsa 標準品完全溶解搖勻。用 pbs 將其 10 l 稀釋至 100 l ，使終濃度為 0.5 mg/ml。 將標準品按 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20l 加到 96 孔板的標準品孔中，加 pbs 補足到 20 l。加適 當體積樣品到 96 孔板的樣品空中，加標準品稀釋液到 20 l。各孔加入 200 l bca 工作液，37放置 30mi

20、n。 測定 a562nm 波長的吸收值。根據(jù)標準曲線計算出蛋白濃度。2.4c57bl/6 小鼠病毒免疫實驗以 c57bl/6 小鼠為實驗對象，先對小鼠進行免疫，再接種腫瘤評價其對腫瘤的抑 制效果。將實驗對象分為 3 組，第一組為對照組，只注射生理鹽水和弗氏不完全佐劑的 1:1 的混合液。第二組為野生桿狀病毒與弗氏不完全佐劑混合液，第三組為重組桿狀病毒與弗氏 不完全佐劑混合液組。每組六只小鼠，雌雄各半。弗氏佐劑和純化制備好的病毒粒子在無菌 ep 管中 1:1 混合，用振蕩器震蕩 10min，再用注射器反復(fù)抽吹，乳化半小時，直到白色混合 液靜置不分層為止。第一次免疫：每只小鼠以 100 l 計量，

21、于小鼠腋下皮下注射。用 1ml 的注射器，吸取125130135140100 l 乳化好的注射液，在小鼠右掖，皮下注射。7 天后，進行第二次免疫。將小鼠放入金屬網(wǎng)格籠內(nèi)固定，在小鼠大腿內(nèi)側(cè)皮下注射 100 l 注射液。再過 7 天，進行第三次免疫。在 小鼠另一側(cè)大腿，肌肉注射 100 l 注射液。2.5小鼠腫瘤模型的構(gòu)建以 c57bl/6 小鼠為實驗對象，用小鼠 lewis 肺癌細胞為瘤源建立小鼠肺癌模型。小鼠 肺癌細胞用 dmem 加 10% fbs，擴大培養(yǎng)。將長滿培養(yǎng)瓶底部細胞加入 3ml 胰酶，在 37培養(yǎng)箱中消化 3min，待細胞都分離脫落后，加入 pbs。用巴氏吸管吹打分散。將消化

22、后 的細胞轉(zhuǎn)移到無菌的 15 ml 離心管中，200 g 離心 5 min。離心后棄去上清，加入適量 pbs， 重懸混勻。取少量細胞懸液和臺酚藍混勻，在顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)，細胞密度為3108/ml,以每只小鼠注射 3107 個細胞注射小鼠。用 5 ml 注射的針頭 1 ml 的注射器，于小 鼠腋下皮下 100 l。供食供水，安靜飼養(yǎng)，每天觀察。2.6小鼠血液中 dll4 抗體水平檢測采用間接法 elisa 檢測小鼠血液中 dll4 抗體水平。dll4 蛋白購自于北京億翹神州公司。 將小鼠眼眶取血，37靜置 1 h，4000rpm 離心 4 min。將 dll4 蛋白梯度稀釋 100512

23、00，進 行包被過夜，洗板，37孵育處理后的小鼠血清 1 h，未免疫血清，pbs 為對照。洗板，加 入 goat-anti-rabbit 二抗，孵育 1 h。洗板，加入顯示劑，顯色，加終止液。酶標儀檢測。3實驗結(jié)果1451503.1pfastbacgp64dll4 載體鑒定如圖 1 所示，重組載體 pfastbacgp64dll4 經(jīng) bamh1 和 xhol1 雙酶切條帶以及 pcr 條帶 位置一致，在 2000bp 左右。實驗結(jié)果表明 pfastbacgp64dll4 載體構(gòu)建成功。由重疊 pcr 連 接的 sp-gp64-tm 片段成功插入到 ph 啟動子下。由華大基因測序結(jié)果與預(yù)計的完

24、全匹配。圖 1 重組 pfastbac1gp64dll4 載體鑒定fig.1 identification of recombinant pfastbacgp64dll4m：mark；1：以 gp64-sp-f，gp64-tm-r 互為引物 pcr 鑒定；2：酶切鑒定3.2bacmidgp64dll4 pcr 鑒定如圖 2 所示，泳道 2 為 m13 上下游引物 pcr 鑒定大小約在 4500bp 左右，而泳道 1 和 3分別為 m13f 和 dll4r， dll4f 和 m13r 互為引物 pcr 結(jié)果。結(jié)果表明 pfastbacgp64dll4155160載體轉(zhuǎn)入 dh10bac 大腸桿菌

25、中，經(jīng) t7 轉(zhuǎn)座后成功的將目的基因整合到 bacmid 中。圖2 bacmidgp64dll4 pcr 鑒定fig.2 identification of bacmidgp64dll4m:mark; 1. m13f 和 dll4r 互為引物; 2:m13 上下游引物;3 :dll4f 和 m13r 互為引物1651701753.3bmgp64dll4 病毒基因組 pcr 鑒定bmn 細胞轉(zhuǎn)染 bacmid 后，細胞膨脹、漂起發(fā)病。提取病毒基因組其 pcr 鑒定。如圖3 所示 pcr 結(jié)果與 bacmid 的 pcr 結(jié)果一致，各條帶都在同一位置。結(jié)果表明 bmgp64dll4病毒構(gòu)建成功，即

26、該病毒中 ph 啟動子下插入 sp-dll4-tm 基因。圖3 bmgp64dll4 病毒基因組 pcr 鑒定fig.3 pcr identification of recombinant bmgp64dll4 genomem:mark; 1. m13f 和 dll4r 互為引物; 2:m13 上下游引物; 3 :dll4f 和 m13r 互為引物3.4bmgp64dll4 發(fā)病家蠶細胞 western blotting 鑒定如圖 4（b）western blotting 結(jié)果顯示，重組桿狀病毒感染的家蠶細胞泳道 1 中有目的 條帶顯現(xiàn)，大小約為 70kd，正常家蠶細胞相應(yīng)泳道 2 沒有目的條

27、帶。結(jié)果表明重組桿狀病 毒感染的家蠶細胞中表達了融合的 dll4 蛋白但在發(fā)病和正常細胞中的 pege 膠如圖 4（a） 中不能看到明顯的蛋白條帶，或許蛋白表達含量較低。180185190195a b圖 4 bmgp64dll4 發(fā)病家蠶細胞 western blotting fig.4 bmgp64dll4 infected bmn cell westen blottin（a）bmgp64dll4 發(fā)病細胞電泳 sds-pege(a) bmgp64dll4 infected bmn cell sds pegem mark；1.發(fā)病家 蠶細胞的 page；2.正常家蠶細胞的 sds-page（

28、b）bmgp64dll4 發(fā)病家蠶細胞 western blotting (b)bmgp64dll4 infected bmn cell westen blotting m mark1.發(fā)病家蠶細胞 2.正常家蠶細胞3.5bmgp64dll4 感染 bmn 細胞中的 dll4 蛋白的免疫熒光檢測細胞免疫熒光檢測重組病毒表達的 dll4 融合蛋白能夠在家蠶細胞中表達，如圖 5（b） 中綠色熒光主要出在細胞膜上，這說明 dll4 蛋白主要定位于細胞膜上。而在正常細胞的對 照中未見有綠色熒光，文章中未給出相應(yīng)圖片。這說明融合上的信號肽能夠?qū)⒌鞍滓龑?dǎo)到細 胞膜上，同時跨膜區(qū)也能夠?qū)⒛康牡鞍锥ㄎ挥诩毎?/p>

29、上。abcd圖 5. 病毒 bmgp64dll4 的 dll4 蛋白在 bmn 細胞的免疫熒光檢測fig.5 the bmgp64dll4 dll4 protein in bmn cellular immune fluorescence detectiona. alexc488donkeyantirabbit,anti-dll4 一抗,dapi 染色，overlay 激光共聚焦顯微鏡 400 倍放大。b. alexc488donkeyantirabbit,anti-dll ;488nm 激發(fā) c. dapi 染色 激光共聚焦顯微鏡 uv 激發(fā)，400 倍放大。d. 激光共聚焦顯微鏡明場 400

30、 倍放大。2003.6病毒 bmgp64dll4 超速離心脫糖后 pege 及 western blotting如圖 6（b）所示純化后的桿狀病毒 westernblotting 檢測在 70kd 左右位置有條帶顯現(xiàn)。 結(jié)果表明，純化獲得的病毒中含有融合的 dll4 蛋白。說明 dll4 蛋白展示于桿狀病毒表面， 我們可以將其用作為疫苗。205210215220ab圖 6. 病毒 bmgp64dll4 超速離心脫糖后 pege 及 western blottingfig.6 bmgp64dll4 sds-pege and bmgp64dll4 western blotting(a) bmgp6

31、4dll4 病毒粒子 (a) bmgp64dll4 sds-page(b) bmgp64dll4 病毒粒子 western bloting（b）bmgp64dll4 western blotting3.7蛋白定量結(jié)果蛋白定量結(jié)果為 2 mg/ml。3.8小鼠血液中 dll4 抗體水平檢測用 dll4 蛋白作為包被抗原在 10g/ml 的情況下 elisa 檢測小鼠血清中抗體效價。如圖7 所示，免疫 bmgp64dll4 組小鼠效價為 1：3200，而免疫野生桿狀病毒組和對照組小鼠的 血清中基本檢測不到 dll4 的特異性抗體。實驗結(jié)果表明免疫后的小鼠血液中產(chǎn)生了針對 dll4 的特異性抗體。圖

32、 7. 小鼠血清中 dll4 抗體效價測定fig.7 determination of dll4 antibody titer in mouse serum3.9小鼠腫瘤體積生長情況將腫瘤視為球體計算體積.如圖 8 所示第 12 天平均腫瘤體積分別為對照組 5720mm3,免 疫野生桿狀病毒組 5000mm3，免疫 bmgp64dll4 疫苗組 3250mm3。結(jié)果表明:免疫 bmgp64dll4 疫苗組小鼠的腫瘤較對照組及免疫野生桿狀病毒組小鼠生長緩慢。12 天后，免疫 bmgp64dll4 疫苗組小鼠腫瘤平均體積為對照組的 55%。225230235圖 8.小鼠腫瘤生長情況fig.8 mo

33、use tumor size圖 9. 各實驗組小鼠腫瘤fig.9 each group mouse tumor3.10 小鼠接受免疫后體重的變化小鼠注射病毒后行為正常，行動活潑。如圖 10 三組實驗小鼠的體重增長速度由快到慢 依次是對照組、免疫野生桿狀病毒組和免疫 bmgp64dll4 疫苗組。說明無論是重組或者野生 桿狀病毒對小鼠有一定影響。圖 10. 小鼠接受免疫后體重的變化fig.10 the change of mouse weight after immunization2402452502552604結(jié)論利用 bac-to-bac 系統(tǒng)構(gòu)建了 bmgp64dll4 病毒。采用重疊

34、pcr 將 gp64 蛋白的信號肽和 跨膜區(qū)與 dll4 基因連接。病毒經(jīng)超速離心，蔗糖梯度密度離心純化后，能夠檢測到 dll4 蛋 白，說明 dll4 蛋白表面展示于家蠶桿狀病毒囊膜上。也有文獻報道將目的基因直接插入到 gp64 蛋白中也能夠被展示在桿狀病毒表面9，但這種展示方法對于目的蛋白的結(jié)構(gòu)和功能是 否會造成影響并不清楚。除囊膜表面展示技術(shù)外，衣殼展示外源蛋白亦是一個不錯的選擇。 將外源基因與衣殼蛋白 vp39 用柔性肽連接并將其連接到多角體啟動子后也能夠展示蛋白 10。我們將 rfp 蛋白與 vp39 連接，獲得了表面展示紅色熒光蛋白的病毒。不過這類展示 方法在疫苗生產(chǎn)中并未見有人采

35、用，也不清楚用此法制備的疫苗在動物體內(nèi)免疫會有何不 同。文章建立小鼠 lwise 肺癌荷瘤模型，利用表面展示人源 dll4 蛋白的桿狀病毒對小鼠進 行三次免疫，在免疫的小鼠血清中檢測到了 dll4 抗體，疫苗免疫組較對照組腫瘤生長緩慢 一些，抑瘤率達到 45%，許多研究者認為 dll4 蛋白人源與鼠源的同源性達到 87%，無法產(chǎn) 生免疫效果，但 2011 年 bk haller11等人的實驗結(jié)果，及本實驗結(jié)果都說明能夠產(chǎn)生針對 dll4 蛋白的抗體，這似乎是一個悖論。bk haller 等人認為是瞬時大量的蛋白進入體內(nèi)打破 了自身免疫耐受，從而產(chǎn)生了抗體。當然也存在抗體交叉反應(yīng)的情況，就是人源

36、的 dll4 蛋 白進入小鼠體內(nèi)后，誘導(dǎo)出來的抗體既能夠中和人源的 dll4 蛋白也能夠與鼠源的 dll4 蛋白 結(jié)合。在給小鼠免疫了桿狀病毒后，小鼠的行為沒有異常，行動能力也正常，但除免疫 bmgp64dll4 組小鼠體重明顯較對照組增長緩慢外，未見其他明顯副作用。盡管文章檢測到 dll4 的抗體，腫瘤的生長也受到抑制，但并未對腫瘤血管的生長情況進行證明，不能明確表 面腫瘤生長抑制的情況是封閉 dll4 通路的結(jié)果對于其具體原因有待于更深入的研究。參考文獻 (references)2652702752801 gale nw, dominguez mg, noguera i, et al. h

37、aploin-sufficiency si z. c, j. liu. what helps tumors evade vascular targeting treat-ment?j, 2008,chin. med. j. 121: 844-849.2 widakowich, cp dinh, e azambuja et al. her-2 positive breastcancer: what else beyond trastuzumab-based therapyj. anticancer agents med chem, 2008 , 8(2): 488-496.3 prager gw, poettler m, unseld m, zielinski cc. angiogenesis in cancer: anti-vegf escape mechanismsj. transl lung cancer res, 2012, 1:14-254 jubb am, turley h, moeller hc, steers g, han c, li jl et al.expression of delta-like