人衛(wèi)第七版分析化學(xué)第二十章毛細(xì)管電泳法

1、第一節(jié) 概述,電泳（electrophoresis)是指溶液中帶電粒子在電場(chǎng)的作用下向與自身帶相反電荷的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。將電泳發(fā)展成為分離技術(shù)應(yīng)歸功于tiselius的工作。他于1937年建立“移界電泳（moving boundary electrophoresis)”，成功地將人血清中的蛋白質(zhì)分為白蛋白、和球蛋白，這項(xiàng)工作成為蛋白質(zhì)化學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)，因此tiselius本人榮獲1948年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。,高效毛細(xì)管電泳,經(jīng)典電泳法散熱差，分離電壓受到限制。 1981年，jorgenson和lukacs發(fā)表了在毛細(xì)管電泳發(fā)展史上具有劃時(shí)代意義的工作，他們采用75m內(nèi)徑的石英毛細(xì)管做為分離室，紫外柱

2、上檢測(cè)的方法，在30kv的分離電壓下分離丹?；被?，柱效達(dá)到40萬個(gè)理論塔板。他們的工作為毛細(xì)管電泳的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。,james w. jorgenson north illinois university 化學(xué)系教授,第二節(jié) 基本理論,一. 電滲,電滲（electroosmosis)是毛細(xì)管電泳分離理論中最基本的概念之一。 電滲是指在電場(chǎng)作用下，毛細(xì)管中或固相多孔物質(zhì)內(nèi)，液體沿固體表面移動(dòng)的現(xiàn)象。電滲與固液兩相界面的雙電層有著密切關(guān)系。,電滲速度uos以下式表示：,石英毛細(xì)管壁上的硅羥基在水溶液中發(fā)生電離，所產(chǎn)生的sio-負(fù)離子使毛細(xì)管壁帶負(fù)電荷。溶液中的抗衡離子靠靜電吸附和分子擴(kuò)散在固

3、液界面上形成雙電層（electric double layer)，雙電層包括緊密層和擴(kuò)散層。,hplc由于壓差產(chǎn)生拋物線型的流體流速輪廓。電滲流的流速輪廓是一個(gè)平面，在毛細(xì)管中如同瓶塞一樣流動(dòng)，不存在徑向的流速梯度。這是毛細(xì)管電泳分離柱效高于hplc的原因之一。,在電場(chǎng)作用下，固液兩相間的相對(duì)運(yùn)動(dòng)發(fā)生在緊密層與擴(kuò)散層之間的滑動(dòng)面上。由于離子的溶劑化作用，當(dāng)形成擴(kuò)散層的離子在電場(chǎng)中移動(dòng)時(shí)，攜帶著液體一同移動(dòng)，因此產(chǎn)生電滲流（electroosmotic flow,eof）,緩沖液ph對(duì)電滲流的影響隨著ph的增大，石英管壁表面的硅羥基解離度增加，界面有效電荷密度增大，eof隨之增大。,陽離子型的表

4、面活性劑使電滲流發(fā)生反轉(zhuǎn) a.無表面活性劑存在；b陽離子表面活性劑在毛細(xì)管壁表面的吸附，抵消了原來的負(fù)電荷，使電滲遷移率0；c.繼續(xù)增大陽離子表面活性劑的濃度，陽離子表面活性劑分子通過非極性鏈?zhǔn)杷嗷プ饔?，在毛?xì)管柱表面形成雙分子層，使電滲流反轉(zhuǎn).,在緩沖液中加入有機(jī)添加劑，如甲醇、異丙醇等，或水溶性高分子物質(zhì)，對(duì)eof也有較顯著的抑制作用。,電泳（electrophoresis）是指溶液中帶電粒子（離子）在電場(chǎng)中定向移動(dòng)的現(xiàn)象。 電泳遷移速度 uep 為： 式中 電泳遷移率（電泳淌度） （electrophoresis mobility)（m2/v.s） v毛細(xì)管柱兩端施加的電壓, l毛細(xì)管

5、柱長,二 . 電泳,在空心毛細(xì)管中一個(gè)粒子的淌度可近似表示為：,三、表觀淌度,由于電滲流速度大大高于電泳速度，所以，不管正離子、負(fù)離子還是中性分子，均隨電滲流移動(dòng)。,物質(zhì)在毛細(xì)管中的保留時(shí)間為： ld為毛細(xì)管柱進(jìn)樣端至檢測(cè)窗口的距離（有效長度）,四、分離效率和譜帶展寬 （一）理論板數(shù)和板高,毛細(xì)管電泳分離柱效方程,從分離柱效方程可知： （1）分離電壓v, n （2）v一定時(shí)，ld/l , n （3）擴(kuò)散系數(shù)d, n；大分子的d小，故ce對(duì)大分子分離柱效高。,（二）引起區(qū)帶展寬的因素 分子擴(kuò)散 焦耳熱 電流通過毛細(xì)管中的電解質(zhì)溶液時(shí)會(huì) 產(chǎn)生焦耳熱，使毛細(xì)管內(nèi)及周圍溫度分布。,由于毛細(xì)管柱中沿徑向

6、存在一個(gè)拋物線型的溫度梯度，由此引起介質(zhì)的粘度在徑向上的梯度分布，進(jìn)而引起徑向上的電泳速度梯度。,3.吸附 產(chǎn)生原因： （1）陽離子溶質(zhì)和帶負(fù)電的管壁的離子相互作用 （2）疏水作用。 對(duì)于生物大分子，如堿性蛋白和多肽等，吸附嚴(yán)重時(shí)可能導(dǎo)致測(cè)不到信號(hào)。因此，生物大分子分析時(shí)常需用涂層處理的毛細(xì)管柱。 4.進(jìn)樣 （過載） 5.電泳 樣品區(qū)帶與周圍電解質(zhì)溶液間的電導(dǎo)率差，從而導(dǎo)致峰形展寬。,分離度是指將淌度相近的組分分離的能力,分離度也可表示為柱效的函數(shù)：,討論：分離度是下列因素的函數(shù)：外加電壓v；有效柱長與總長度之比（ld/l）；電泳有效淌度差；電滲淌度,五、分離度,第三節(jié) 毛細(xì)管電泳的主要分離模

7、式,毛細(xì)管區(qū)帶電泳（capillary zone electrophoresis，cze） 膠束電動(dòng)色譜（micellar electrokinetic chromatography, mekc) 毛細(xì)管凝膠電泳（capillary gel electrophoresis, cge) 毛細(xì)管等速電泳（capillary isotachophoresis, citp) 毛細(xì)管等電聚焦（capillary isoelectric focus, cif) 毛細(xì)管電色譜（capillary electrochromatography, cec),一、毛細(xì)管區(qū)帶電泳（cze）,毛細(xì)管電泳最基本的分離模式

8、。背景電解質(zhì)是緩沖液，分離是基于樣品中各個(gè)組分間質(zhì)荷比的差異。有時(shí)需在緩沖液中加入一定的添加劑，用以提高分離選擇性，改變電滲流的大小、方向或抑制毛細(xì)管壁的吸附等。 在cze中，影響分離的操作條件為： 分離電壓 背景電解質(zhì)種類、濃度和ph 添加劑種類和濃度,分離效率與電壓間存在極大值。極大電壓通常也是最佳工作電壓。 在實(shí)際分離中，如果所用的毛細(xì)管很細(xì)或緩沖液的電導(dǎo)很低，極大電壓可能會(huì)超出儀器范圍，此時(shí)沒有最佳電壓，可選擇儀器允許的最大輸出電壓。 當(dāng)毛細(xì)管較粗或緩沖液電導(dǎo)較高時(shí)，極大電壓可能很小，若此時(shí)分離度很高，也可選擇大于極大值的電壓進(jìn)行分離。,1. 分離電壓,毛細(xì)管的溫度不僅影響分離的重視性

9、，而且影響分離效率。溫度選擇應(yīng)考慮熱效應(yīng)、分析重現(xiàn)性、分離效率和分離介質(zhì)對(duì)溫度的限制等因素。 溫度的確定也應(yīng)通過實(shí)驗(yàn)，多數(shù)情況下，在2030之間進(jìn)行電泳，能獲得良好的分離效果。可根據(jù)初步分離結(jié)果調(diào)整溫度。 不少糖類樣品需要高于室溫的分離環(huán)境，一些樣品如蛋白等則可能需要低于室溫的分離條件。,2.分離溫度,對(duì)背景電解質(zhì)的要求： 在所選擇的ph范圍內(nèi)有足夠大的緩沖容量。 在檢測(cè)波長處的吸收低。 自身的淌度低，即分子大而荷電小，以減少電流的產(chǎn)生。 應(yīng)使被測(cè)組分帶合適的電荷量，以實(shí)現(xiàn)有效進(jìn)樣和有合適的電泳淌度。 盡可能采用酸性緩沖溶液，在低ph下，吸附和電滲流值都很小。與毛細(xì)管種類匹配，涂層毛細(xì)管只能在

10、一定ph范圍內(nèi)使用。,3. 背景電解質(zhì),在cze中，常用于毛細(xì)管電泳的緩沖溶液有硼砂、磷酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽和醋酸鹽等。 緩沖體系的ph值要求與樣品的性質(zhì)有關(guān)，通常酸性組分的分離選擇在堿性條件下進(jìn)行，而堿性組分則選擇酸性介質(zhì)分離，蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸等兩性物質(zhì)，可選酸性(ph2)也可選堿性(ph9)分離介質(zhì)。糖類樣品通常在ph911之間能獲得最佳分離，羧酸或其它樣品多在ph59之間選擇分離條件。,ph的選擇也和毛細(xì)管種類有關(guān)，很多涂層毛細(xì)管只能在一定ph范圍內(nèi)使用，如聚丙烯酰胺涂層毛細(xì)管，只能在ph49范圍內(nèi)使用，否則涂層易水解失效。 在相同的ph下，不同緩沖體系的分離效果可能相差很大，一

11、般來說，能與樣品發(fā)生相互作用的試劑可能是最好的。如分離糖類和dna等分子時(shí)優(yōu)先使用硼酸鹽緩沖體系，因?yàn)榕鹚岣芘c糖羥基形成配位鍵，從而增加糖的負(fù)電荷和分離度。硼酸鹽緩沖體系也適用于其它含鄰羥基或多羥基的化合物分離。,為了選擇合適的ph值，需要ph調(diào)節(jié)劑調(diào)整介質(zhì)的酸堿性。由于多數(shù)緩沖試劑屬酸性物質(zhì)，如磷酸，所以ph調(diào)節(jié)劑主要是堿類，常用的ph調(diào)節(jié)劑有naoh、koh、tris等。有時(shí)也可考慮用胺或醇胺等有機(jī)堿，如乙醇胺、乙二胺。如果緩沖試劑為堿類，則可用酸作為調(diào)節(jié)劑，盡量使用弱酸，如 h3po4。 緩沖劑及調(diào)節(jié)劑的濃度對(duì)改善分離、抑制吸附、控制焦耳熱等均有影響，一般緩沖試劑的濃度控制在10200

12、mmol/l，有時(shí)為了抑制蛋白質(zhì)等的吸附作用，可用高達(dá)500mmol/l的濃度（此時(shí)應(yīng)減少分離電壓）。電導(dǎo)率高的緩沖試劑如磷酸鹽和硼酸鹽等，一般控制在20mmol/l，電導(dǎo)小的緩沖試劑如硼酸其濃度可在100mmol/l以上。,如果緩沖體系經(jīng)各種參數(shù)優(yōu)化后仍無法給出良好的分離結(jié)果，可以加入添加劑以改善分離。添加劑種類較多： 1.無機(jī)電解質(zhì)（nacl、kcl） 2.有機(jī)溶劑（如甲醇、乙腈） 3.非電解質(zhì)高分子（纖維素、多糖、聚乙烯醇、triton x-100) 4. 功能性添加劑（手性冠醚、環(huán)糊精等）,二、膠束電動(dòng)色譜（mekc）,在緩沖溶液中加入離子型表面活性劑（如sds），當(dāng)表面活性劑濃度超過

13、其臨界膠束濃度時(shí)，則形成親水膠束，膠束具有疏水內(nèi)核, 外層帶負(fù)電荷。溶質(zhì)分子則在極性緩沖液與膠束中心的非極性相（假固定相）之間有一定的分配。中性分子因其本身疏水性不同，在兩相中分配存在差異。在電滲流作用下，膠束攜帶溶質(zhì)一起前行，疏水性強(qiáng)的溶質(zhì)和膠束結(jié)合得較牢，流出慢。不同分子在兩相中的分配差異是mecc分離的基礎(chǔ)。,常用的陰離子表面活性劑有十二烷基硫酸鈉（sds）、n-月桂酰-n-甲基?；撬徕c（lmt）、?；敲撗跄懰徕c（stdc）等。 陽離子表面活性劑最常用的是季銨鹽，如十二烷基三甲基溴化銨（dtab）、十六烷基三甲基溴化銨（ctab）等。 非離子型表面活性劑有3-3-(氯化酰胺基丙基)二甲基

14、胺基-1-丙基磺酸酯（chaps）等。 另外，還有手性表面活性劑，如膽酸、毛地黃皂苷、十二烷基-n-l-纈氨酸鈉等。,表面活性劑選擇時(shí)應(yīng)考慮以下因素： （1）經(jīng)濟(jì)易得 （2）水溶性好 （3）紫外吸收背景越低越好 （4）不與樣品發(fā)生破壞性作用 （5）所形成的膠束足夠穩(wěn)定,碳鏈較短的陰離子表面活性劑為優(yōu)先選擇對(duì)象。sds易得、紫外吸收低，最為常用。如經(jīng)濃度、緩沖溶液及ph優(yōu)化，分離仍不佳，再換具有不同碳鏈長度或結(jié)構(gòu)的其它陰離子表面活性劑。若結(jié)果仍不好，應(yīng)考慮使用陽離子或中性、兩性表面活性劑，如ctab（十六烷基三甲基溴化銨）、triton x-100等。 應(yīng)注意：陽離子表面活性劑可能會(huì)改變電滲流方

15、向。 膠束修飾：添加重金屬離子可改變膠束表面的電荷數(shù)量；使用混合表面活性劑可調(diào)節(jié)分離度或峰分布；加入另一種膠束，如采用多相體系（水膠束環(huán)糊精），利用多種作用改善分離。,三、毛細(xì)管電色譜（cec）,以微填充柱作為分離柱，以電滲流驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相完成色譜分離過程。,cec中，固定相的選擇主要依據(jù)hplc的理論和經(jīng)驗(yàn)，常用c18或c8 。 根據(jù)固定相的特性（正相、反相等），緩沖液可以是水溶液或有機(jī)溶液。常用乙腈水或甲醇水等為流動(dòng)相。,毛細(xì)管分離條件選擇流程,1.盡可能多地了解樣品的類型、來源、組成及其性質(zhì)。 2.根據(jù)樣品性質(zhì)、來源選擇分離模式，若無樣品信息可先選cze。 3.根據(jù)樣品性質(zhì)確定檢測(cè)方法。 4

16、.確定ph、緩沖試劑濃度。 5.優(yōu)化其它操作參數(shù)，如毛細(xì)管尺寸、分離電壓、溫度等。 6.確定是否需要使用添加劑和非水溶劑。 7.根據(jù)分離結(jié)果考慮是否換其它分離模式。,第四節(jié) 毛細(xì)管電泳儀,1.高壓電極槽和進(jìn)樣機(jī)構(gòu) 2.填灌清洗機(jī)構(gòu) 3.毛細(xì)管 4.檢測(cè)器 5.鉑絲電極 6.低壓電極槽 7.恒溫系統(tǒng) 8.數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng),對(duì)ce的要求：,進(jìn)樣機(jī)構(gòu)不存在死體積，能進(jìn)行精確的進(jìn)樣控制。 需有毛細(xì)管清洗機(jī)構(gòu)。 高壓電源至少應(yīng)能輸出200a25kv的功率。 檢測(cè)器盡量安裝在接地端，優(yōu)先考慮柱上紫外檢測(cè)方式。 溫控范圍寬，以0 為界，越寬越好，上限不應(yīng)低于50 ，最好能達(dá)到6570 ，至少能在2040內(nèi)恒

17、溫，恒溫精度應(yīng)小于0.2 。,高壓電源一般采用（030）kv連續(xù)可調(diào)的直流高壓電源，電壓輸出精度應(yīng)高于1%。電極通常由直徑0.5mm1mm的鉑絲制成。電極槽通常是帶螺帽的玻璃瓶或塑料瓶（1ml5ml不等），以便于密封。 儀器必須接地，操作過程中必須注意高壓的安全保護(hù)。,一、高壓電源,二、毛細(xì)管,1.尺寸 毛細(xì)管尺寸的選擇與分離模式和樣品有關(guān)。自由溶液電泳多選用50或75m內(nèi)徑的毛細(xì)管，分離的有效長度?？刂圃?0100cm之間。如進(jìn)行大顆粒如紅細(xì)胞的分離，則需要內(nèi)徑大于 300m的毛細(xì)管。cge或cec的有效長度一般控制在20cm左右。 2.涂層 一般不需涂層處理。大分子化合物分離時(shí)，常常需要惰

18、性管壁，以抑制吸附。做cief或cge時(shí)，需要涂層毛細(xì)管以抑制電滲。在分離中，有時(shí)為了加強(qiáng)電滲或改變其方向，也需要涂層毛細(xì)管。,3. 清洗 毛細(xì)管在使用過程可能被污染，從而影響分析的結(jié)果。為使測(cè)定具有良好的重現(xiàn)性，毛細(xì)管在使用時(shí)應(yīng)經(jīng)常清洗。 空管通常用 0.l1mol/l naoh、水和緩沖液順序沖洗，各洗510min，或增加有機(jī)溶劑如甲醇清洗步驟，以除去管中的脂溶性吸附組分。如果懷疑管內(nèi)壁吸附有蛋白質(zhì)或其他有機(jī)分子，可用0.l1mol/l的hno3洗 510min，然后再按常規(guī)清洗。 兩次分析之間，可用運(yùn)行緩沖液清洗、平衡。,三、進(jìn)樣系統(tǒng),毛細(xì)管通道十分細(xì)小，所需樣品不過數(shù)nl，所以不能采用

19、色譜的進(jìn)樣方式。通過讓毛細(xì)管與樣品溶液直接接觸，然后由重力、電場(chǎng)力或其它動(dòng)力來驅(qū)動(dòng)樣品進(jìn)入管中。進(jìn)樣量可以通過控制驅(qū)動(dòng)力的大小或時(shí)間長短來控制。進(jìn)樣系統(tǒng)必須包括動(dòng)力控制、計(jì)時(shí)控制、電極槽或毛細(xì)管移位控制等機(jī)構(gòu)。 進(jìn)樣方式： 電動(dòng)法 壓力法 擴(kuò)散法,電動(dòng)進(jìn)樣,當(dāng)把毛細(xì)管的進(jìn)樣端插入樣品溶液并加上電場(chǎng)時(shí)，組分就會(huì)因電遷移和電滲作用而進(jìn)入管內(nèi)。 電動(dòng)進(jìn)樣的控制參數(shù)是電場(chǎng)強(qiáng)度e和進(jìn)樣時(shí)間t。電場(chǎng)強(qiáng)度e取值多在160kv/60cm 之間；進(jìn)樣時(shí)間通常在110s 之間，有時(shí)可達(dá)1min或更大。 優(yōu)點(diǎn)：電動(dòng)進(jìn)樣對(duì)毛細(xì)管內(nèi)的填充介質(zhì)沒有特殊限制，屬普適性方法，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作。 缺點(diǎn)：電動(dòng)進(jìn)樣對(duì)離子組分存在偏

20、向，電遷移速度快的進(jìn)樣多，電遷移速度小的少進(jìn)甚至不進(jìn)，這會(huì)降低分析的準(zhǔn)確性和可靠性。,壓力進(jìn)樣,也稱流動(dòng)進(jìn)樣，它要求毛細(xì)管中的填充介質(zhì)具有流動(dòng)性。當(dāng)毛細(xì)管兩端置于不同的壓力環(huán)境中時(shí)，管中溶液即能流動(dòng)，將樣品帶入。 可用三種方法產(chǎn)生進(jìn)樣動(dòng)力：正壓、負(fù)壓（管尾抽吸）、重力（虹吸）。 采用壓縮空氣（氣體鋼瓶）可實(shí)現(xiàn)正壓進(jìn)樣，并可與毛細(xì)管清洗系統(tǒng)共用，多為商品儀器采用。 優(yōu)點(diǎn)：壓力進(jìn)樣沒有偏向問題， 缺點(diǎn)：選擇性差，樣品及其背景同時(shí)被引入 管中，對(duì)后續(xù)分離可能產(chǎn)生影響。,擴(kuò)散進(jìn)樣,利用濃度差擴(kuò)散原理，當(dāng)將毛細(xì)管插入樣品溶液時(shí)，樣品分子因在管口界面存在濃度差而向管內(nèi)擴(kuò)散。擴(kuò)散進(jìn)樣動(dòng)力屬不可控制參數(shù)，進(jìn)樣量僅由擴(kuò)散時(shí)間控制。對(duì)于利用電動(dòng)和壓力進(jìn)樣的系統(tǒng)，設(shè)置電場(chǎng)或壓力差為零，即可實(shí)現(xiàn)擴(kuò)散進(jìn)樣。擴(kuò)散進(jìn)樣時(shí)間一般