動(dòng)物細(xì)胞工程

1、,動(dòng)物細(xì)胞工程,世界生物醫(yī)藥發(fā)展概況,自上世紀(jì)90年代以來(lái)，生物醫(yī)藥市場(chǎng)增速一直都維持在全球藥品市場(chǎng)增速的2-3倍。以2007年為例，全球生物技術(shù)藥物年銷售額同比增長(zhǎng)12.5%，總額突破750億美元，這一增速是2007年全球藥品市場(chǎng)增速（6.4%）的兩倍。 抗體藥物是近年來(lái)增長(zhǎng)率最快的生物技術(shù)藥物，全球年銷售額從1997年的3.1億美元上升到2007年的270億美元，十年內(nèi)增長(zhǎng)了87倍。抗體藥物在生物藥物產(chǎn)業(yè)中所占份額也從2000年的1/5上升到2007年的1/3，且年均增長(zhǎng)12.4%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于全球制藥行業(yè)6%的增長(zhǎng)水平。 經(jīng)濟(jì)學(xué)家們預(yù)計(jì)20072012年的抗體藥物年平均銷售額增長(zhǎng)率將保持在1

2、4%左右，實(shí)際超過(guò)預(yù)計(jì)。,Epogen (EPO, 促紅細(xì)胞生成素) Humulin（胰島素） Intron-A (-IFN, -干優(yōu)素) Engreix-B (乙肝疫苗) Cerezyme (葡萄腦苷脂酶) Activase (t-PA, 組織纖維蛋白溶酶原激活劑) Humatrope (hGH, 生長(zhǎng)激素) Reopro (抗Gpllb/IIIa抗體) Avonex (IFN-la, -la干擾素) Protropin/Nutropi (somatrem/somatropin) Pulmozyme (-鏈球菌DNA酶) Proleukin (IL-2,白介素-2) Leukine (GM-

3、CSF, 粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子),早期上市的主要生物技術(shù)產(chǎn)品,由培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的部分藥品 產(chǎn)品 臨床用途 產(chǎn)生細(xì)胞 干擾素 癌癥、病毒感染 Namalwa 干擾素 癌癥、病毒感染 CHO EPO 貧血 CHO tPA 溶血栓 CHO VIII因子 血友病 CHO 乙肝表面抗原 疫苗 CHO 人生長(zhǎng)激素 侏儒癥 CHO GCSF 化療解救 CHO 單抗OKT3 腎移植 雜交瘤,當(dāng)前的生物技術(shù)研究前沿,生物醫(yī)藥 學(xué)科綜合,治療性抗體,組織工程技術(shù),生物 藥遞送 技術(shù),RNAi藥物,基因治療,天然藥物合成生物學(xué),干細(xì)胞治療,新型疫苗,2010年全球生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu),IMS Health Ma

4、rket prognosis,生物醫(yī)藥在全球前十大藥品中的排名,Global Pharmaceutical Market Review & World Top Ten/Twenty Drugs 2008,美國(guó)FDA已經(jīng)批準(zhǔn)或即將批準(zhǔn)的治療性抗體藥物,在我國(guó)批準(zhǔn)上市的國(guó)外單抗藥物,在中國(guó)批準(zhǔn)上市的國(guó)產(chǎn)單抗藥物,動(dòng)物細(xì)胞工程 基本概念 應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)原理和方法（細(xì)胞融合或基因轉(zhuǎn)導(dǎo)等），通過(guò)某種工程學(xué)手段（遺傳操作等），在細(xì)胞整體水平或細(xì)胞器水平上，按照人們的意愿來(lái)改變細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)或獲得細(xì)胞產(chǎn)品（特定的蛋白制品）的一門綜合科學(xué)技術(shù)。,單克隆抗體,細(xì)胞融合,細(xì)胞培養(yǎng),胚胎移植 (提高產(chǎn)

5、仔率),核 移 植 (克隆牛、羊等),動(dòng)物細(xì)胞工程,一、動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器 生物反應(yīng)器是利用酶或生物體（如微生物、細(xì)胞）所具有的生物功能，在體外進(jìn)行生化反應(yīng)的裝置系統(tǒng)，是一種生物功能模擬機(jī)，如發(fā)酵罐、固定化酶或細(xì)胞反應(yīng)器等。動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器近年來(lái)得到迅速的發(fā)展，利用動(dòng)物細(xì)胞可以準(zhǔn)確、有效地生產(chǎn)醫(yī)藥生物技術(shù)制品，如活性肽、單抗、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等。,利用動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器產(chǎn)生蛋白的必要性 1細(xì)菌和酵母系統(tǒng)產(chǎn)生哺乳動(dòng)物蛋白并不另人滿意，主要原因是該系統(tǒng)不一定能產(chǎn)生完全正確的哺乳動(dòng)物蛋白。 2動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)往往經(jīng)過(guò)一系列翻譯后修飾，才能成為成熟蛋白，而微生物系統(tǒng)不一定能實(shí)現(xiàn)翻譯后修飾。 3

6、翻譯后修飾因不同的蛋白而有差異，其中以糖基化最為常見(jiàn)，尤其對(duì)于分泌的蛋白更是如此，其他修飾也可發(fā)生。 4翻譯后修飾對(duì)某些蛋白的活性是不可缺少的。修飾也將影響蛋白在體內(nèi)的穩(wěn)定性、清除率，以及組織分布等。,蛋白翻譯后修飾的原因,蛋白活性調(diào)節(jié)的需要 蛋白相互作用的需要 亞細(xì)胞水平定位的需要等,哺乳動(dòng)物蛋白常見(jiàn)的翻譯后修飾 糖基化 (glycosylation) 谷氨酸的g-羧化 (g-carboxylation) 門冬氨酸的b-羥化 (b-hydroxylation) 磷酸化與硫酸化 (phosphorylation & sulphatation) 蛋白水解加工 (proteolytic proce

7、ssing) 酰胺化 (amidation) ,還有：甲基化、乙?；?、甲?；?、十四烷基化、異戊二烯基化、氨基化去氨基化、二硫鍵形成、硝化等共兩百多種類型。,蛋白質(zhì)翻譯后修飾,主要內(nèi)容: 泛素化 糖基化 磷酸化 乙?；?甲基化,泛素化在生命過(guò)程中的作用,泛素化是泛素與其他蛋白結(jié)合，并進(jìn)一步降解蛋白的過(guò)程。 對(duì)于細(xì)胞分化、細(xì)胞器的合成、細(xì)胞凋亡、DNA 修復(fù)、新蛋白的合成、調(diào)控細(xì)胞增殖和蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)壬磉^(guò)程都起到很重要的作用。,蛋白糖基化的作用,糖基化在生物過(guò)程中起著重要作用，如免疫保護(hù)、病毒復(fù)制、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞之間黏附、炎癥的產(chǎn)生等。,糖基化在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中形成 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中形成的大部分蛋白是糖

8、蛋白,蛋白磷酸化的作用,可逆的磷酸化過(guò)程幾乎涉及所有的生理及病理過(guò)程，如細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤的發(fā)生、新陳代謝、神經(jīng)活動(dòng)、肌肉收縮以及細(xì)胞的增殖、發(fā)育和分化等作用。,蛋白的乙?；饔?組蛋白的乙酰化和去乙?；腔虮磉_(dá)過(guò)程中重要的調(diào)控方式，是轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的關(guān)鍵修飾。組蛋白去乙?；竿ㄟ^(guò)去除組蛋白的乙?；推渌D(zhuǎn)錄調(diào)控參與腫瘤發(fā)生和進(jìn)展。,組蛋白的乙?；?乙酰化增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄 去乙?；种妻D(zhuǎn)錄,蛋白甲基化的作用,組蛋白上的甲基化，不僅在真核細(xì)胞染色質(zhì)的遺傳外修飾中占有中心地位，對(duì)細(xì)胞分化、發(fā)育、基因表達(dá)、基因組穩(wěn)定性及癌癥研究均有深遠(yuǎn)的影響。其他類型的甲基化的異常或甲基化酶的突變常會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生。,動(dòng)物細(xì)

9、胞生物反應(yīng)器的基本特征 1需要用基因轉(zhuǎn)導(dǎo)或細(xì)胞融合等方法建立必要的生產(chǎn)細(xì)胞系； 2需要大量、高密度培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液與培養(yǎng)設(shè)備； 3需要控制細(xì)胞的生長(zhǎng)與蛋白的表達(dá)； 4在產(chǎn)品的生產(chǎn)過(guò)程中，出現(xiàn)一些可能影響安全性的副產(chǎn)品，包括細(xì)胞碎片蛋白、 DNA、病毒等，需要在產(chǎn)品的純化過(guò)程中加以清除； 5在細(xì)胞培養(yǎng)中，可出現(xiàn)對(duì)細(xì)胞有害的副產(chǎn)品，如氨離子、乳酸等，應(yīng)在培養(yǎng)液的組成以及培育條件等方面考慮限制這些毒性產(chǎn)物的釋放。,動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的問(wèn)題 1產(chǎn)量低 與微生物系統(tǒng)比較，動(dòng)物細(xì)胞重組蛋白的產(chǎn)量較低； 2生產(chǎn)設(shè)備與技術(shù)復(fù)雜 細(xì)胞生長(zhǎng)慢，工藝條件要求高，易染菌； 3控制生產(chǎn)過(guò)程較困難 細(xì)胞生長(zhǎng)速度與產(chǎn)物表達(dá)

10、量的控制要求高； 4細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中易受損傷 動(dòng)物細(xì)胞比微生物脆弱，培養(yǎng)條件要求苛刻； 5產(chǎn)品純化困難 培養(yǎng)液中含有大量外源性蛋白，原材料的質(zhì)量不好控制，如血請(qǐng)等； 6成本較高 所用儀器設(shè)備、培養(yǎng)基等材料價(jià)格貴。,細(xì)胞工程在優(yōu)化細(xì)胞株過(guò)程中的應(yīng)用 1防止細(xì)胞凋亡 凋亡抑制方法，培養(yǎng)基補(bǔ)充，基因策略(bcl-2等)； 2代謝工程 通過(guò)代謝調(diào)控抑制乳酸鹽和氨水等毒性代謝產(chǎn)物產(chǎn)生； 3分子伴侶工程 增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中與蛋白分泌有關(guān)的分子伴侶蛋白數(shù)量； 4轉(zhuǎn)譯后加工工程(糖基化工程) 通過(guò)合適的糖基轉(zhuǎn)移酶過(guò)表達(dá)達(dá)到此目的。,生物反應(yīng)器,生物反應(yīng)器在生物過(guò)程中起中心作用，是實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵設(shè)備，是連接原料

11、和產(chǎn)物的橋梁。,細(xì)胞或酶等生物催化劑 （游離或固定化）,生 物 反 應(yīng) 器,空氣,CO2等,冷卻水,原材料,培養(yǎng)基,滅菌,底物,產(chǎn)物,廢物,除菌,檢測(cè)和控制,產(chǎn)物預(yù)處理,產(chǎn)品提取或液化,副產(chǎn)物,生物反應(yīng)器中復(fù)雜的相互關(guān)系,生物反應(yīng)器 1攪拌式 經(jīng)典的動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器； 2氣升式 有氧傳遞速度大、傳熱效果及混合性能好； 3中空纖維管 細(xì)胞密度大、血清用量小、細(xì)胞不易受損； 4流化床式 比表面積大、適合培養(yǎng)各種細(xì)胞。,1攪拌式（籠式攪拌器）,2氣升式（氣腔式反應(yīng)器）懸浮培養(yǎng)或微載體培養(yǎng)用,中空纖維反應(yīng)器：左右兩箭頭為無(wú)菌空氣進(jìn)出口。細(xì)胞生長(zhǎng)在由半透性的多孔膜制成的中空纖維管外表面。,3中空纖維管中空

12、纖維貼壁反應(yīng)器,培養(yǎng)基出口,細(xì)胞,培養(yǎng)基入口,4流化床式流化床反應(yīng)器,基本原理是使支持細(xì)胞生長(zhǎng)的微粒呈流態(tài)化。由膠原制成的微粒，具有像海綿一樣的多孔性，用非毒性物質(zhì)增加其比重，使之達(dá)到1.6 或更高，以便它在高速向上流動(dòng)的培養(yǎng)波中里流態(tài)化。細(xì)胞接種于微粒中，通過(guò)反應(yīng)器垂直向上循環(huán)流動(dòng)的培養(yǎng)液使之成為流化床，不斷提供給細(xì)胞必要的營(yíng)養(yǎng)成分，細(xì)胞得以在微粒中生長(zhǎng)。同時(shí)新鮮培養(yǎng)液不斷地被加入，培養(yǎng)產(chǎn)物或代謝產(chǎn)物又不斷地被排除。,流化床、攪拌式、微載休培養(yǎng)細(xì)胞密度的對(duì)比,培養(yǎng)類型細(xì)胞類型細(xì)胞密度(cell/mL) 流化床貼壁依賴性 1.3 108 流化床雜 交 瘤 0.3 108 微載體攪拌釜貼壁依賴性

13、 0.2-2 107 恒化床雜 交 瘤 2.0 106,二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng) 原代培養(yǎng)： 10代以內(nèi)的組織培養(yǎng)細(xì)胞； 正常細(xì)胞： 1050代未經(jīng)轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)細(xì)胞； 轉(zhuǎn)化細(xì)胞： 重組DNA進(jìn)入受體的過(guò)程叫“轉(zhuǎn)化”,得到重組DNA的細(xì)胞叫“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”； 細(xì)胞系: 特定基因背景的無(wú)限傳代細(xì)胞，BHK-21, CHO-K1, MDCK, MRC-5, Namalwa, Vero, WI-38。,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程,除單細(xì)胞原生動(dòng)物外，細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程具有以下特性： 細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，易受微生物污染，培養(yǎng)時(shí)需用抗生素； 動(dòng)物細(xì)胞較微生物大得多無(wú)細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，適應(yīng)環(huán)境能力差； 培養(yǎng)過(guò)程需氧量少，且不耐受強(qiáng)

14、力通風(fēng)與攪拌形成的較大流體剪切力： 在培養(yǎng)中，細(xì)胞相互粘連以集群形式存在，培養(yǎng)過(guò)程具有群體效應(yīng)、錨地依賴性、接觸抑制性及功能全能性： 培養(yǎng)過(guò)程產(chǎn)物分布于細(xì)胞內(nèi)外，反應(yīng)過(guò)程成本較高，但產(chǎn)品價(jià)格昂貴； 大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)，不可照用微生物反應(yīng)的經(jīng)驗(yàn)； 原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖50代即退化死亡。,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)特性,用于細(xì)胞培養(yǎng)的部分細(xì)胞系 細(xì) 胞來(lái) 源用 途 COS非洲綠猴腎細(xì)胞小規(guī)模量單抗 CHO中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞表達(dá)重組蛋白 BHK倉(cāng)鼠腎細(xì)胞生產(chǎn)畜用疫苗 MDCK狗腎細(xì)胞生產(chǎn)畜用疫苗 MRC-5人胚肺組織細(xì)胞產(chǎn)生人用疫苗 Namalwa淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞生產(chǎn)a-干擾素 Vero猴腎臟成纖維細(xì)胞生產(chǎn)人用制品 WI

15、-38胚肺組織細(xì)胞生產(chǎn)人用疫苗,細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的放大 1篩選細(xì)胞系 2確定培養(yǎng)條件 3產(chǎn)物表達(dá)的優(yōu)化 4中試放大 5放大生產(chǎn),細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境 1培養(yǎng)用品的無(wú)菌處理 器材、培養(yǎng)基、試劑等； 2培養(yǎng)條件 水質(zhì)、pH、滲透壓、溫度、空氣、攪拌速度。,細(xì)胞培養(yǎng)基 1天然培養(yǎng)基： 血漿凝塊、血清淋巴液、胚胎浸液及羊水、腹水等。 2合成培養(yǎng)基： DMEM、RPMI 1640、Hams F12、IMDM等。包含氨基酸（氮源） 、糖（碳源） 、鹽類、維生素、激素、生長(zhǎng)因子、微量元素、脂等；10% 血清。,無(wú)血清懸浮培養(yǎng) 1無(wú)血清培養(yǎng)基 可替代血清功能的生物材料配制細(xì)胞培養(yǎng)基，如牛血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素等；

16、 2無(wú)動(dòng)物來(lái)源培養(yǎng)基 需要的蛋白來(lái)源于重組蛋白或者蛋白水解物； 3無(wú)動(dòng)物蛋白培養(yǎng)基 部分添加物是來(lái)源于植物蛋白的水解片段或合成多肽片段等其他衍生物； 4化學(xué)組分限定培養(yǎng)基 最安全、最理想的培養(yǎng)基，可保證培養(yǎng)基批次間一致性，少量動(dòng)物來(lái)源蛋白水解物、蛋白都是成分明確。,常用培養(yǎng)方法 1懸浮培養(yǎng) 2貼壁培養(yǎng) 3微載體培養(yǎng)（葡聚糖） 4包埋和微囊培養(yǎng)（瓊脂糖、海藻酸鈣凝膠）,1. 貼壁培養(yǎng) 分散的細(xì)胞懸浮液在培養(yǎng)器中往往要貼附在壁上，這叫細(xì)胞貼壁。原來(lái)是圓形的細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展呈多種形態(tài)。此后細(xì)胞就開(kāi)始有絲分裂并很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。一般在數(shù)天后就鋪滿生長(zhǎng)表面，形成致密的細(xì)胞單層，叫做單層細(xì)胞，這種

17、培養(yǎng)的方法又叫單層細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)中有一個(gè)非常有趣的現(xiàn)象是細(xì)胞的接觸抑制。當(dāng)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)到表面相互接觸時(shí)，就停止分裂增殖，長(zhǎng)成單層的細(xì)胞經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，一定須在重新分散后分瓶繼續(xù)培養(yǎng)，使其繼續(xù)分裂增殖，這叫傳代。 2. 懸浮培養(yǎng) 是指細(xì)胞在培養(yǎng)器中自由懸浮生長(zhǎng)過(guò)程，主要用于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)，如雜交瘤細(xì)胞等。動(dòng)物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是在微生物發(fā)酵的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。由于動(dòng)物細(xì)胞的特點(diǎn)，如沒(méi)有細(xì)胞壁保護(hù)，不能耐受劇烈的攪拌和通氣，因此在許多方面又與經(jīng)典的發(fā)酵有所不同。對(duì)于小規(guī)程培養(yǎng)多采用轉(zhuǎn)瓶和滾瓶培養(yǎng)，大規(guī)模培養(yǎng)多采用發(fā)酵罐式的細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器。懸浮培養(yǎng)，設(shè)備結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，有成熟的理論計(jì)算，可以借鑒微生

18、物發(fā)酵的部分經(jīng)驗(yàn)，放大效應(yīng)小。但是懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞密度較低，轉(zhuǎn)化細(xì)胞懸浮培養(yǎng)有潛在致癌危險(xiǎn)。此外，有許多動(dòng)物細(xì)胞屬于貼壁依賴性的，不能懸浮培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)的關(guān)鍵是要選擇適當(dāng)?shù)臄嚢韬屯庋b置。,3. 微載體培養(yǎng)系統(tǒng) 微載體是直徑為 60250m 的微珠。采用微裁體系統(tǒng)培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞，細(xì)胞易壁于微載體上，微載體（和細(xì)胞）懸浮于培養(yǎng)基中，細(xì)胞在微載體表面逐漸生長(zhǎng)成單層。這種模式把單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)融匯在一起，具有兩種培養(yǎng)方法的優(yōu)點(diǎn)。 1)表面積/體積比大；2)由于微裁體懸浮于培養(yǎng)基中，是均勻懸浮培養(yǎng)，簡(jiǎn)化了細(xì)胞生長(zhǎng)各種環(huán)境因素的監(jiān)測(cè)和控制，細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境亦均勻；3)培養(yǎng)基利用率高；4)采樣重演性好；5

19、）收獲過(guò)程不復(fù)雜；6)放大較容易；7)勞動(dòng)強(qiáng)度小，占用空間小。 4. 包埋培養(yǎng) 對(duì)懸浮生長(zhǎng)和貼壁依賴生長(zhǎng)的細(xì)胞都適用，細(xì)胞生長(zhǎng)的密度高，抗剪切力和抗污染能力強(qiáng)。對(duì)懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞用海藻酸鈣包埋，對(duì)貼壁依賴生長(zhǎng)細(xì)胞用膠原包埋。由于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)慢而費(fèi)用高，且對(duì)剪切力敏感，經(jīng)包埋后可有效的保護(hù)細(xì)胞。,5. 微囊化培養(yǎng) 在動(dòng)物細(xì)胞微囊化制備中，主要是應(yīng)用海藻酸聚氨基酸方法，簡(jiǎn)單過(guò)程是動(dòng)物細(xì)胞與海藻酸溶液混合攪拌，經(jīng)過(guò)微囊發(fā)生器將微球滴入氯化鈣溶液中，形成凝膠，然后再用聚氨基酸處理，使微球表面成膜，最后用檸檬酸處理去除微球內(nèi)的鈣離子，以便球內(nèi)的海藻酸成液態(tài)，動(dòng)物細(xì)胞得以懸浮在其中。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化中海藻酸

20、和聚氨基酸是關(guān)鍵材料。微囊化方法能使細(xì)胞處于相對(duì)穩(wěn)定、受剪切力小的環(huán)境中，而養(yǎng)分和氧又可以從微囊外的培養(yǎng)液擴(kuò)散進(jìn)入。,1000L氣升式細(xì)胞反應(yīng)器系統(tǒng),細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式 1分批式操作 2半連續(xù)式操作（反復(fù)分批式或換液培養(yǎng)） 3流加式操作（分批培養(yǎng)過(guò)程中間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基） 4連續(xù)罐流式操作（連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基）,分批、連續(xù)、流加操作方式的比較,4.因經(jīng)常滅菌會(huì)降低儀器使用壽命,大規(guī)模生產(chǎn)的操作 1培養(yǎng)基的配制 2種子細(xì)胞的制備 3雜交瘤細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng) 4產(chǎn)品的分離純化 5產(chǎn)品的冷凍干燥,單批細(xì)胞培養(yǎng)及反應(yīng)時(shí)間,3.125ml,62.5ml,1.25L,10kL,500L,25L,da

21、y1620,day2125,day1115,day2832,day15,day812,day610,day1317,day1822,day1519,day2024,day2327,day2529,day2125,day3034,day2630,儲(chǔ)槽 10kL,day32,day25,day26,day33,母細(xì)胞庫(kù),生物產(chǎn)品生產(chǎn)工藝開(kāi)發(fā)要素,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用 1獲得細(xì)胞產(chǎn)物，如蛋白質(zhì)生物制品，包括病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體等； 2制備燒傷病人植皮所需的皮膚細(xì)胞； 3獲得檢測(cè)用細(xì)胞，檢測(cè)有毒物質(zhì)的毒性。,三、動(dòng)物細(xì)胞的基因工程 基因工程基本概念 在生物體外，通過(guò)對(duì)DNA分子進(jìn)行人工“剪切”和

22、“拼接”，對(duì)生物的基因進(jìn)行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行無(wú)性繁殖，使重組基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的基因產(chǎn)物。,高表達(dá)細(xì)胞株的建立 基因轉(zhuǎn)染 選擇瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法，既取決于實(shí)驗(yàn)的要求，同時(shí)經(jīng)濟(jì)和技術(shù)因素也可考慮在內(nèi)。 1基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 常見(jiàn)于實(shí)驗(yàn)室研究，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染跳過(guò)了通過(guò)細(xì)胞的鑒定與選擇來(lái)判斷質(zhì)粒整合至細(xì)胞基因組這一步，速度快。 2基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 用于臨床或商業(yè)目的，一個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染能將目的基因DNA整合到宿主細(xì)胞染色體組中。,動(dòng)物細(xì)胞的核酸轉(zhuǎn)移方法 1磷酸鈣沉淀法； 2DEAE右旋糖酐法； 3脂質(zhì)體包被法； 4微量注射法； 5電脈沖法； 6基因槍； 7逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。,1、化

23、學(xué)法,磷酸鈣沉淀法： 目的基因與磷酸鈣等物質(zhì)混合，形成沉淀的DNA微細(xì)顆粒，易通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并整合到受體細(xì)胞基因組中，在適當(dāng)條件下得以表達(dá)。方法簡(jiǎn)單，但轉(zhuǎn)化效率低。 Ca2(PO4)2+DNA 混合微細(xì)顆粒 （Ca離子濃度 125 mmol， DNA 離子濃度 50ug/ml， PH 7.0） 沉淀反應(yīng)2030min 細(xì)胞在沉淀物中暴露 524h,2、物理方法,電穿孔法（electroporotion） 將細(xì)胞置于高壓脈沖電場(chǎng)中，通過(guò)電壓使細(xì)胞產(chǎn)生可逆性的穿孔。周圍基質(zhì)中的DNA可滲進(jìn)細(xì)胞，進(jìn)而表達(dá)。 瞬間 細(xì)胞 細(xì)胞膜核摸通透性增加 高壓脈沖 DNA滲入細(xì)胞,3、顯微注射法（micr

24、oinjection ）利用顯微操作把目的基因直接注入靶細(xì)胞或細(xì)胞核中,Clone sheep Dolly 體細(xì)胞 提取 核 重組細(xì)胞 回植 Dolly 卵細(xì)胞 去核 細(xì)胞,外源基因在細(xì)胞中的表達(dá) 1降解 2游離狀態(tài) 3整合到宿主細(xì)胞的染色體,病毒表達(dá)載體 1SV40病毒載體 2逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 3牛痘病毒載體 4牛乳頭瘤病毒載體 5腺病毒載體 6多瘤病毒 7Epstein-Barr virus, Sinbis virus 8重組病毒載體等,細(xì)胞轉(zhuǎn)基因遺傳標(biāo)記的選擇系統(tǒng) 1二氫葉酸還原酶基因選擇系統(tǒng) (dhfr) 2胸苷激酶基因選擇系統(tǒng) (tk) 3新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 (neo) 4氯霉素乙酰

25、轉(zhuǎn)移酶基因 (cat) 5綠色熒光蛋白基因 (gfp) 特定的遺傳標(biāo)志（基因）和相應(yīng)的選擇培養(yǎng)劑: MTX (dhfr), HAT (tk), 四環(huán)素 (tetr), 卡那霉素 (kanr) 和新霉素 (neo) 基因。,細(xì)胞株篩選 1傳統(tǒng)篩選方法 最常用的方法是有限稀釋克隆（LDC）； 2流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞分選 膜標(biāo)記技術(shù)，優(yōu)勢(shì)在于篩選數(shù)目大幅增加； 3基于細(xì)胞分泌率的高表達(dá)細(xì)胞的篩選 凝膠微液滴技術(shù)檢測(cè)，基于基質(zhì)的分泌檢測(cè)； 4細(xì)胞篩選的自動(dòng)化系統(tǒng) 激光激活分析和處理系統(tǒng)，自動(dòng)挑選克隆， Cello系統(tǒng)。,四、雜交瘤技術(shù) 雜交瘤與單克隆抗體 單克隆抗體與多克隆抗體比較的優(yōu)點(diǎn) 1）高度特異性； 2）同質(zhì)性； 3）可工業(yè)化生產(chǎn)； 4）高度可重復(fù)性； 5）免疫原不一定要高度純化； 6）可制備人源抗體。,動(dòng)物細(xì)胞的融合方法,雜交瘤的制備方法 免疫（immunization） 細(xì)胞融合（cell fusion） PEG 選擇（selection） HAT培養(yǎng)基 篩選（screening） 細(xì)胞克?。╟loning） 有限稀釋法 抗體特征鑒定（characterization） 細(xì)胞保存（storage）,BioTechniques 20