TAT-PTD的研究進展

1、TAT-PTD的研究進展 郭娜趙硯麗 河北省人民醫(yī)院麻醉科 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域（protein transduction domain, PTD）或稱細胞穿 膜肽（cell penetrating peptides, CPPs）是一條以肽為載體的有效運輸各 種物質(zhì)進入細胞及細胞核的系統(tǒng)。通過PTD攜帶的物質(zhì)有全長蛋白 質(zhì)、DNA、化學(xué)藥物、寡核苷酸、40 nm磁珠和200 nm脂質(zhì)體等。 目前已知的具有細胞穿膜效應(yīng)的多肽序列如表1所示。 表1具有細胞穿膜效應(yīng)的多肽序列 Table 1 Ami no acid seque nces of i ntracellular tran sducti on

2、peptides Peptide Amino acid seque nee HIV-1 TAT YGRKKRRQRRR HSV VP22 DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRPRRPVE Drosophila Antp RQIKIYFQNRRMKWKK V regi on of An ti-DNA an tibody VAYISRGGVSTYYSDTVKGRFTRQKYNKRA Kaposi FGF AAVALL PAVLLALLAP Grb2 (SH2 doma in) AAVLL PVLLAAP In tegri n3 3 VTVLAL GALAGVGVG HIV-

3、1 gp41 (1223) GAL FL GFL GAAGSTMGA Caiima n croc. Ig(v) light cha in MGLGLHLLVLAAALQGAMGL GLHLLLAAALQGA In flue nza HA22 (1220) WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKAL KACEA 最常用的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域如：Antp43-58 （Antenapedia,黑腹果 蠅觸足肽）、TAT47-57 （ transactiviting protein, HIV-1 反式激活蛋 白）、VP22 （單純皰疹病毒轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白）和Arginine-rich peptides

4、 （精 氨酸富含肽）等。本文主要介紹TAT-PTD。 1 HIV-1 TAT -PTD TAT蛋白是HIV后期轉(zhuǎn)錄的調(diào)控子，是HIV-1的LTR反式激活 基因所表達的一種蛋白，可以正調(diào)控HIV-1基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，在 HIV的生活史中起著極其重要的作用，對HIV的復(fù)制是必須的，TAT 有86個氨基酸殘基，由長為72個氨基酸與14個氨基酸的2個外顯子 組成。上個世紀 80 年代末， Green 和 Frankel 兩個獨立的小組同時發(fā) 現(xiàn) TAT 蛋白能夠穿過培養(yǎng)的細胞膜進入到其他細胞中。 TAT 可以有效地介導(dǎo)外源物質(zhì)進入細胞。 1988 年， Maurice 和 Paul發(fā)現(xiàn)TAT蛋白能夠

5、穿過細胞膜。1994年，Stephen將TAT蛋白 與其他外源蛋白用化學(xué)方法交聯(lián)，成功地將外源蛋白質(zhì)導(dǎo)入到了體外 培養(yǎng)的細胞以及動物組織中，但以這種化學(xué)鍵連接后的融合蛋白在腦 組織和腎臟中沒有活性。 1997 年， Eric Vives 等發(fā)現(xiàn)剪切后的 TAT 蛋白能夠穿過細胞膜并在細胞核中聚集，并確定該蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的基本區(qū) 段(basic domain)為 TAT 37 72 。至U 1998 年，Hikaru 發(fā)現(xiàn) TAT 蛋白 的 PTD 區(qū)段 (protein transduction domain) 與其他蛋白融合表達的蛋白 質(zhì)(TAT-蛋白質(zhì))能夠高效地進入體外培養(yǎng)的細胞，并且表現(xiàn)出生

6、物學(xué) 功能，具有生物學(xué)活性。 1999 年， Schwarze S. R. 3 研究發(fā)現(xiàn)： TAT 蛋白能夠通過血腦屏障，積累至一定濃度并表現(xiàn)出蛋白的活性。 2000 年， Lewin 等利用 TAT 蛋白將直徑為 45nm 的包裹有磁性微球的葡聚 糖導(dǎo)入至細胞中。 2001 年， Akiko Eguchi 等4 利用 TAT 蛋白將外源 基因?qū)胫良毎?，并且檢測至較強的外源基因所表達的螢光素酶的活 性。近些時候，嚴世榮、李敬風(fēng)等將 TAT 蛋白的 PTD 區(qū)段編碼基因 與外源蛋白基因連接表達融合蛋白，再將其轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)融合 蛋白可以快速至達體內(nèi)各組織，且表現(xiàn)出較強生物活性。 2 機制

7、關(guān)于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)的透膜機制目前仍不十分清楚，但是已證明 這種穿膜方式是不依賴于受體、通道、能量及胞吞作用。最近一些研 究表明，用D-型氨基酸替代TAT(48 - 60)的L-型氨基酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)導(dǎo) 效率增強了；用 TAT 的顛倒結(jié)構(gòu)同原始結(jié)構(gòu)有同樣作用；而且發(fā)現(xiàn)在 變性條件下，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力增強；人工合成的分枝多肽 (Rn) 4 中 精氨酸的數(shù)目與其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率有關(guān)；帶有胍基的擬肽也有同樣作用，均 可轉(zhuǎn)導(dǎo)多種類型的細胞，均說明并非受體、配體作用模式。還有研究 發(fā)現(xiàn)TAT(48 - 60)可以在細胞不能進行內(nèi)吞的4 C條件下轉(zhuǎn)導(dǎo)，用內(nèi)吞 作用的多種抑制劑，均不能抑制其轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，說明蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)不是通

8、過 胞吞作用的 。另外，用疊氮鈉和魚藤酮阻止 ATP 產(chǎn)生，也不能抑制 TAT(48 - 60) 衍生肽的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，說明蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)并非能量依賴性。 用藥物阻斷細胞通道，如brefelclin A( 一種高爾基體蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑)， 仍不能抑制蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)。用 PTD 堿性多肽處理細胞，并未發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi) 乳酸脫氫酶外漏，可能不是通過膜通道進入細胞。實驗證明，在 4 C時 盡管胞吞作用已失活，但是PTD和PTD融合蛋白仍能快速有效地進入 細胞。熱力學(xué)實驗證明， TAT-PTD 與細胞表面糖胺聚糖的解離系數(shù)約 為1卩mol/L比同樣帶有負電荷的脂質(zhì)膜大3個數(shù)量級。因此,TAT-PTD 與細胞表面糖胺聚糖的

9、結(jié)合比脂質(zhì)雙層膜更為可能； PTD 與三個不同 的糖氨聚糖 (硫酸肝素、肝素和硫酸軟骨素 B) 有相似的熱動學(xué)結(jié)合常 數(shù)( K) ，但結(jié)合點數(shù)目大致與硫酸化程度有關(guān)。 研究表明， 使用糖氨聚 糖裂合酶選擇性地降解硫酸肝素側(cè)鏈， 可競爭性抑制 TAT 的轉(zhuǎn)導(dǎo)。 相 反，如果加入的是主要作用于肝素而基本上不作用硫酸肝素的肝素酶， 只有當該酶達到較高濃度時才能對TAT的轉(zhuǎn)導(dǎo)起抑制作用?？梢苑纸?各種硫酸軟骨素的軟骨素酶A、B、C,以及特異性分解硫酸軟骨素 A和C的軟骨素酶A和C,對TAT-PTD的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力沒有影響。以上結(jié) 果也提示，生物膜上的糖氨聚糖可能是 PTD及相關(guān)蛋白的結(jié)合位點。 細胞表面的硫

10、酸肝素是跨膜的硫酸肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycans , HSPG)的膜外部分，這些HSPG可能是多種生物活性物 質(zhì)的共同受體。在無配體存在時，HSPG在細胞表面隨機分布。當有特 異性配體時，HSPG發(fā)生聚集并與細胞漿中的其他成分共同作用。在硫 酸肝素上，可能存在有PTD陽性肽的幾個獨立的結(jié)合位點，PTD與硫 酸肝素的緊密結(jié)合并形成中性PTD-糖氨聚糖復(fù)合物，為PTD的跨膜轉(zhuǎn) 導(dǎo)提供了固相化基礎(chǔ)，并通過HSPG相互交聯(lián)，激活細胞的攝取。這也 解釋了以PTD為載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運效率與細胞類型有關(guān)，因為有些細胞 表面僅有少量的HSPG。最近的一些研究表明，在細胞內(nèi)

11、PTD及其復(fù)合 物存在于內(nèi)吞體內(nèi)。提示細胞對PTD及其復(fù)合物的攝取可能通過細胞 膜快速的靜電作用，隨后內(nèi)吞到細胞內(nèi)。但并不排除尚存在其他攝取 機制。 3 TAT-PTD 與被轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)的連接方式 PTD與蛋白質(zhì)、肽、寡核苷酸、DNA及肽核酸等連接的方式有兩 種：非共價連接和共價連接。 非共價連接，與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)運方法相似簡單易行， PTDs 與寡核苷酸 PTDs可 或DNA按一定比例混合，在室溫共同孵育加入到培養(yǎng)細胞中, 攜帶寡核苷酸或DNA進入細胞。 共價連接主要有 3種方法： 1）化學(xué)合成，用共價鍵連接形成復(fù)合物 或采用T4連接酶，如TAT （47-57）通過二硫鍵與肽核酸或鎖核酸連接， 進入細

12、胞后二硫鍵斷裂，釋放出化合物發(fā)揮反義作用，在體內(nèi)不被巨 噬細胞吞噬，血液成分也不影響其攝取過程，在細胞內(nèi)的作用時間延 長；2） 間接連接途徑， 構(gòu)建含有 VP22 的目的蛋白的 cDNA 表達載體， 轉(zhuǎn)染細胞1224 h后，表達出融合蛋白能從轉(zhuǎn)染的細胞進入周圍其他 細胞；3）體外構(gòu)建融合聚肽，其N端或C端帶標簽序列，通過大腸埃 希菌表達載體產(chǎn)生大量的PTDs重組蛋白，進入細胞后，PTDs與蛋白質(zhì) 間的連接斷裂，釋放出的蛋白質(zhì)重新折疊。利用這種方法，已得到大 量不同相對分子質(zhì)量與PTDs連接的蛋白質(zhì)，細胞毒性檢測復(fù)合物幾乎 沒有毒性。 4 TAT-PTD 融合蛋白的制備 TAT融合蛋白一般用以下

13、的程序制備。首先，將編碼 TAT-PTD的cDNA 插入質(zhì)粒（如pET32a）中，構(gòu)建TAT-PTD的表達載體。再將編碼目的蛋白質(zhì) 或多肽的 cDNA 插入到該載體的 TAT-PTD 序列框架的下游， 再將其轉(zhuǎn)化入大 腸桿菌中，即可表達 TAT-PTD 融合蛋白。 TAT-PTD 融合蛋白少數(shù)以一種可 溶的形式在細菌中被表達，但大多數(shù)是以不可溶形式出現(xiàn)在細菌的包含體內(nèi)。 尿素可使貯存在包含體內(nèi)的蛋白變性溶解。用含有尿素的Ni2+-NTA 瓊脂糖親 和柱來純化蛋白，再用離子交換柱或凝膠過濾法除去尿素。可以觀察到變性 的TAT-PTD融合蛋白能進入幾乎所有的細胞 。 5 TAT-PTD 的不同應(yīng)用

14、 目前將基因、蛋白導(dǎo)入細胞的方法包括磷酸鈣共沉淀法、顯微注 射法、電擊穿孔法、穿孔蛋白、 ATP 處理、脂質(zhì)體法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、 細胞融合法、病毒載體轉(zhuǎn)染法等，但這些方法存在著以下問題：大量 細胞能否在相當長的一段時間內(nèi)接受試劑的處理、是否需要外界的作 用（如運用電場 ）、進入細胞的蛋白量有多少、 各個細胞吸收的劑量是否 相同、技術(shù)的可重復(fù)性有多大；細胞在處理中是否受到傷害或發(fā)生改 變、效率低、需要昂貴的試劑、特殊的設(shè)備、技術(shù)復(fù)雜不易掌握、安 全性等。以上問題在一定程度上限制了這些方法的應(yīng)用 目前，大量研究表明PTD具有強大的運載潛能。PTD不僅可以攜 帶多肽、GFP、RNase A、半乳糖苷酶

15、等蛋白質(zhì)，而且可以攜帶 DNA、 反義核酸、FITC、有機分子、脂質(zhì)體、以及鐵顆粒等無機物。運載能 力可以達到 120 kD (如半乳糖苷酶 )、 40 nm (如鐵顆粒 ) ，沒有明顯的 證據(jù)表明PTD有運載極限2。 某些藥用生物分子，如： 蛋白質(zhì)、 DNA 及小分子化合物進入細胞 內(nèi)或細胞核內(nèi)都要受到這些物質(zhì)本身理化性質(zhì)的影響。其穿膜能力主 要受以下幾方面影響：脂溶性、極性、分子量。脂溶性大、分子量小 的生物分子容易穿過細胞膜；反之，極性大、分子量大的生物分子不 易穿過細胞膜。有些化合物不能直接進入細胞、細胞核內(nèi)，限制了這 些化合物作為藥物的使用。許多疾病的治療需要大分子物質(zhì)，如腦血 管疾

16、病常常需要神經(jīng)生長因子、超氧化物歧化酶等保護劑，由于其難 以透過血腦屏障，不能達到有效的治療濃度。因此，建立和發(fā)展高效、 安全、可控、簡便、實用的細胞內(nèi)生物大分子導(dǎo)入系統(tǒng)和核轉(zhuǎn)移體系， 已經(jīng)成為疾病防治的一個重要課題。對于開發(fā)上述這些藥物，PTD的 發(fā)現(xiàn)極具意義，有著廣泛的作為藥物傳遞的前景。 在細胞及器官移植領(lǐng)域，目前多采用腺病毒基因轉(zhuǎn)染等方法研究 一些有保護作用的蛋白，但均因其病毒源性、轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)低等問題限制 其廣泛應(yīng)用。PTD已經(jīng)應(yīng)用于AIDS的研究，TAT-胱天蛋白酶原3 (TAT-procaspase-3)進入到HIV感染的細胞后能夠在HIV編碼的特異蛋 白酶的作用下切割為成熟的胱天蛋

17、白酶 3 ( caspase-3 ) ，從而誘導(dǎo)細胞 凋亡。在癌癥研究方面，已經(jīng)利用PTD攜帶P53蛋白誘導(dǎo)癌細胞的調(diào)亡， 另外，在體內(nèi)和/或體外還成功進行了 PTD轉(zhuǎn)運HSV-1胸苷激酶、周期 蛋白 A(cyclin A) / cdk2 抑制肽、脂質(zhì)體包被的阿霉素 (Doxrubicin) 等腫 瘤抑制藥物的實驗。外源性GDNF能使缺血大鼠腦梗死灶體積縮小，腦 水腫減輕。Kilic等采用C57BL/6j鼠制作MCAO 30min再灌注模型， 再灌注后10 min尾靜脈注射TAT-GDNF，3 d后處死大鼠，TTC染色 發(fā)現(xiàn)梗死體積明顯小于GDNF組，免疫組化顯示TAT-GDNF組紋狀體 胱冬

18、酶 -3活性降低，存活神經(jīng)元較對照組增多。Cao 等7 構(gòu)建了 TAT-PTD與Bcl-XL的融合蛋白，檢測其在缺血再灌注損傷時的神經(jīng)保 護作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將 PTD-Bcl-XL 加入皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)基中，幾乎所 有細胞內(nèi)均有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)，且轉(zhuǎn)導(dǎo)速度驚人， 15 min 即達高峰，能顯著 抑制星形孢菌素 (staurosporine) 誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。 在局灶性腦缺血模 型中，缺血前 2 h 腹腔注射 PTD-Bcl-XL 預(yù)處理大鼠，可使梗死體積縮 小40 %,而且缺血后45min內(nèi)給藥仍然有效，但缺血120 min后給藥則 無效。Asoh等發(fā)現(xiàn)，將PTD融合到FNK蛋白產(chǎn)生PTD-FNK蛋白

19、，這種 蛋白對體外培養(yǎng)液中正在凋亡的皮質(zhì)神經(jīng)元有保護作用,在沙土鼠短 暫性全腦缺血模型中，PTD-FNK可使61.8 %89 %海馬CA1神經(jīng)元存 活，F(xiàn)NK的保護作用較野生型Bcl-XL更強。丁勁等構(gòu)建及表達乙肝病 毒靶向核糖核酸酶與 TAT-PTD 融合表達的原核表達載體,為體內(nèi)應(yīng)用 靶向核糖核酸酶治療乙型肝炎奠定了基礎(chǔ)。Schwarze、組還發(fā)現(xiàn)，變 性的蛋白質(zhì)似乎比正確折疊的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移還有效。他們指出,一旦 變性蛋白質(zhì)進入細胞,在分子伴侶的幫助下,這些變性蛋白質(zhì)能恢復(fù) 正確折疊。蛋白質(zhì)純化過程中變性,既有利于提高回收率,又能提高 轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。最近，Eguchi等構(gòu)建重組入噬菌體，將TA

20、T蛋白呈現(xiàn)于噬 菌體表面,這個重組噬菌體成功地將內(nèi)部所攜帶的外源基因?qū)肓瞬?乳動物細胞；說明TAT蛋白還可以作為一個元件，去構(gòu)建其他的轉(zhuǎn)運 系統(tǒng)，使其應(yīng)用更加廣泛。2001年，S.Y. Choi等發(fā)現(xiàn)TAT-CAT可有效 透過動物外皮，并在表皮層和真皮層中有大量聚集(49-57aa),這為透 皮給藥提供了一種新思路。 現(xiàn)在, 直接用細菌表達的 TAT-PTD 融合蛋白或用編碼 VP22 基因 的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞來解決生物學(xué)難題已取得了突破性進展。雖然兩 種方法的建立都意味著對 DNA 轉(zhuǎn)染或病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)的巨大改進, 但是 二者相比,直接使用 TAT-PTD 融合蛋白在實際應(yīng)用中有幾個優(yōu)點：

21、(1) 對于象原代細胞這樣難以轉(zhuǎn)染的細胞而言, TAT-PTD 融合蛋白系統(tǒng)無 疑優(yōu)于VP22重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法，實際操作中所有細胞都可成為轉(zhuǎn)導(dǎo)的對 象。由于每個細胞含有相同的胞內(nèi)蛋白質(zhì)濃度,所以只要控制加入到 培養(yǎng)介質(zhì)中的蛋白量就可以輕而易舉地控制胞內(nèi)蛋白的濃度。 (2) 由于 TAT-PTD融合蛋白迅速進入細胞內(nèi)部，5min后胞內(nèi)最大濃度開始降 低,所以可以精確地控制時間。例如,可將融合蛋白在細胞周期某一 特定相加入,以保證生物活性發(fā)生在蛋白加入后的幾分鐘內(nèi) 3 。 綜上所述，TAT-PTD具有如下特點：TAT-PTD可以非常高效 (100%)將與其融合的蛋白質(zhì)在體外轉(zhuǎn)入各種細胞及細胞核中；

22、TAT-PTD這種高轉(zhuǎn)導(dǎo)活性在體內(nèi)仍能進行；TAT-PTD可穿過血腦屏 障，并只進入灰質(zhì)細胞中；TAT-PTD可以將變性的蛋白質(zhì)以更高的 效率轉(zhuǎn)入細胞內(nèi)，且這些蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)仍能復(fù)性； TAT-PTD介導(dǎo) 融合蛋白進入細胞是非受體介導(dǎo)的。 但是，TAT蛋白是艾滋病毒1型(HIV-1)的LTR反式激活基因所表 達的一種蛋白， 它不但可以正調(diào)控 HIV-1 基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制， 還可以 分泌到胞外，抑制免疫細胞的分化和增殖，文獻資料表明，在 HIV 感 染早期細胞外TAT蛋白的存在和感染者的免疫抑制密切相關(guān)。細胞外 TAT蛋白誘導(dǎo)免疫細胞發(fā)生凋亡問利于HIV的感染和體內(nèi)傳播。同時還 能促進卡波氏肉瘤腫瘤細胞的發(fā)生、生長，還可直接或間接作用于皮 質(zhì)層和皮質(zhì)下層區(qū)引起神經(jīng)系統(tǒng)的損害 9,10 。 6 展望 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)仍處于較初級階段，它是介導(dǎo)生物活性分子轉(zhuǎn)移 的一種新方式，在那些不需要長期和可調(diào)控表達轉(zhuǎn)入基因的應(yīng)用中， 它有特別的作用，而且技術(shù)簡便，可以避免目前基因治療中的一些副 作用；在實體瘤的治療和細胞及器官移植的保護性研究中，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn) 導(dǎo)比目前病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移效率更高，在未來基礎(chǔ)研究和藥物開發(fā) 等方面將有廣闊的應(yīng)用前景 5 ：可設(shè)計全新的復(fù)合物治療各種疾病， 還可根據(jù)組織細