腫瘤藥物敏感實(shí)驗(yàn)課件

1、腫瘤藥物敏感實(shí)驗(yàn)1 腫瘤藥物敏感實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤藥物敏感實(shí)驗(yàn) 腫瘤藥物敏感實(shí)驗(yàn)2 化療的重要性化療的重要性 自19461946年GillmanGillman和PhillipPhillip報(bào)道氮芥類(lèi) 藥物治療造血系統(tǒng)腫瘤以來(lái)，化學(xué)治療巳取 得很大的進(jìn)步。目前化學(xué)治療已使絨癌、惡 性淋巴瘤、睪丸精原細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺癌等 多種惡性腫瘤獲得治愈的機(jī)會(huì)，大多數(shù)惡性 腫瘤能得到緩解，化療在惡性腫瘤的治療中 具有不可替代的地位。 腫瘤藥物敏感實(shí)驗(yàn)3 腫瘤化療的局限性腫瘤化療的局限性 腫瘤的化學(xué)治療在半個(gè)世紀(jì) 以來(lái)，雖然取得顯著進(jìn)展，但臨 床抗腫瘤藥物治療的總有效率并 不高，阻礙化學(xué)治療取得更好療 效的原因眾多，主要

2、包括： 腫瘤藥物敏感實(shí)驗(yàn)4 抗腫瘤藥物研究表明，即使是相同 組織學(xué)類(lèi)型的腫瘤對(duì)同一抗腫瘤藥物 的反應(yīng)也并不盡一致，對(duì)不同臟器或 不同組織學(xué)類(lèi)型的腫瘤采用相同的用 藥方案，效果更是千差萬(wàn)別。目前大 多數(shù)化療是采用的對(duì)某種臟器既定的 聯(lián)合方案,仍有一定的盲目性。 1.1. 現(xiàn)行化療的盲目性現(xiàn)行化療的盲目性 腫瘤藥物敏感實(shí)驗(yàn)5 2.2.化學(xué)治療的抗藥性化學(xué)治療的抗藥性 有些腫瘤對(duì)某些藥物存在先 天耐藥,還有些腫瘤經(jīng)化療緩解， 腫瘤敏感株殺滅，耐藥株成為 復(fù)發(fā)的根源，而且對(duì)以后的化 療抵抗。 腫瘤藥物敏感實(shí)驗(yàn)6 3. 抗癌藥物的毒性抗癌藥物的毒性 所有抗腫瘤藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞 的同時(shí)，也殺傷正常的組織

3、細(xì)胞，尤 其是增殖旺盛的骨髓造血細(xì)胞和胃腸 道細(xì)胞。期望通過(guò)增大劑量、增加用 藥品種、縮短間隔時(shí)間的方法來(lái)提高 抗癌效果，則將進(jìn)一步加重毒性作用。 腫瘤藥物敏感實(shí)驗(yàn)7 如何解決這些問(wèn)題？如何解決這些問(wèn)題？ 腫瘤化療個(gè)體化腫瘤化療個(gè)體化: : 研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)藥敏 檢測(cè)結(jié)果指導(dǎo)選藥，有效率可在原來(lái)固定 化療方案的基礎(chǔ)上提高一倍以上，于是提 出了腫瘤化療個(gè)體化的概念(即預(yù)見(jiàn)性化 療)。根據(jù)個(gè)體腫瘤敏感性檢測(cè)的結(jié)果，選 用敏感的藥物的聯(lián)合方案，無(wú)疑將會(huì)大大 提高腫瘤的治療水平。 腫瘤藥物敏感實(shí)驗(yàn)8 腫瘤藥敏的可行性腫瘤藥敏的可行性 七十年代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的突破，新型培 養(yǎng)材料、培養(yǎng)基的問(wèn)世。 19831

4、983年MosmannMosmann建立了MTTMTT法，方法簡(jiǎn)便， 設(shè)備要求不高，檢測(cè)時(shí)間短，便于在臨 床上廣泛開(kāi)展。 新的抗癌藥不斷問(wèn)世，同一種腫瘤有多 種聯(lián)合化療方案可供選擇。 腫瘤藥物敏感實(shí)驗(yàn)9 腫瘤藥敏的方法學(xué)腫瘤藥敏的方法學(xué) 裸鼠皮下移植裸鼠皮下移植 裸鼠腎包膜下移植裸鼠腎包膜下移植 裸鼠原位移植裸鼠原位移植 腫腫 瘤瘤 細(xì)細(xì) 胞胞 藥藥 敏敏 體內(nèi)法體內(nèi)法 體外法體外法 l染料排斥法染料排斥法 l集落形成法集落形成法 l同位素法同位素法 l四唑藍(lán)比色法四唑藍(lán)比色法 腫瘤藥物敏感實(shí)驗(yàn)10 裸鼠腎包膜下移植裸鼠腎包膜下移植 裸鼠腎包膜下移植實(shí)驗(yàn)是腫瘤細(xì) 胞藥敏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)最常用的方法，

5、但由于裸鼠需要在無(wú)菌條件下飼 養(yǎng)，而且腎包膜下移植實(shí)驗(yàn)操作 復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，不易在臨床 廣泛開(kāi)展。 腫瘤藥物敏感實(shí)驗(yàn)11 染料排斥實(shí)驗(yàn)染料排斥實(shí)驗(yàn) 原理是細(xì)胞死亡后膜通透性增加，染 料通過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞著色，故通過(guò) 計(jì)數(shù)未著色細(xì)胞可計(jì)算出藥物的殺傷 率。但由于某些受殺傷尚未死亡的細(xì) 胞也不易著色，故假陰性率較高。另 外在計(jì)數(shù)時(shí)主觀的因素會(huì)出現(xiàn)較大的 誤差，目前較少應(yīng)用。 腫瘤藥物敏感實(shí)驗(yàn)12 集落形成法集落形成法 集落法(Human Tumor Cell Cloning Assay, HTCA）腫瘤組織由增殖和非增殖細(xì)胞組 成，其中僅有 1具有旺盛的增殖能力， 是腫瘤浸潤(rùn)擴(kuò)散和復(fù)發(fā)的根源。

6、這種細(xì) 胞具有形成細(xì)胞集落的能力,故又稱為腫 瘤干細(xì)胞。 測(cè)定腫瘤干細(xì)胞對(duì)藥物的敏 感性符合臨床藥物治療的需要。 腫瘤藥物敏感實(shí)驗(yàn)13 集落形成法方法學(xué)集落形成法方法學(xué) 雙層瓊酯法：底層 加入0.5% 0.5% 的瓊脂培 養(yǎng)液, 上層加含腫 瘤細(xì)胞懸液的0.3 % 0.3 % 瓊脂培養(yǎng)液。上層 培養(yǎng)液供腫瘤細(xì)胞 生長(zhǎng)，下層防止細(xì) 胞貼壁及成纖維細(xì) 胞的過(guò)度生長(zhǎng)。 玻璃毛細(xì)管法: 培養(yǎng) 基0.60.6mlml，瘤細(xì)胞懸液 0.10.1mlml,抗癌藥0.1 ml, 1瓊脂糖0.2ml加在 一起混勻后向玻璃毛 細(xì)管內(nèi)加入5050ll，冷 卻凝固后置37二氧 化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 腫瘤藥物敏感實(shí)驗(yàn)14

7、 集落形成法的優(yōu)點(diǎn)集落形成法的優(yōu)點(diǎn) 抑制纖維母細(xì)胞的增殖，不受腫瘤細(xì)胞 以外的細(xì)胞的影響。 下層滋養(yǎng)層可加入各種輔助分子，更利 于腫瘤的生長(zhǎng)。 直接測(cè)定藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞中最活躍的成 分腫瘤干細(xì)胞的影響。 腫瘤藥物敏感實(shí)驗(yàn)15 集落形成法的缺點(diǎn)集落形成法的缺點(diǎn) 高純度單細(xì)胞懸液的制備困難。 所形成的細(xì)胞集落并非都是腫瘤 細(xì)胞集落。 成功率低，有一定的難度。 培養(yǎng)周期長(zhǎng)，需10天左右。 腫瘤藥物敏感實(shí)驗(yàn)16 放射性同位素標(biāo)記 的核苷酸容易摻入 DNA和RNA分子中 放射性同位素發(fā)靈 敏度高，重復(fù)性好。 時(shí)間短，可較快地 得到結(jié)果。 儀器設(shè)備要求高。 由于具有放射性，故 操作時(shí)需要一定的防 護(hù)措施。

8、廢料需特別處理。 放射同位素法放射同位素法 3 3H H的 的射線能量低，分辨率高，半衰期長(zhǎng)達(dá)射線能量低，分辨率高，半衰期長(zhǎng)達(dá) 1212年年, ,3 3H H標(biāo)記胸腺嘧啶核苷標(biāo)記胸腺嘧啶核苷( (3 3HTdR)HTdR)為最常用。為最常用。 腫瘤藥物敏感實(shí)驗(yàn)17 3 3HTdR HTdR摻入法摻入法 用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1 110105 5/ /mlml。將將 此濃度的細(xì)胞接種于微量培養(yǎng)板，每孔此濃度的細(xì)胞接種于微量培養(yǎng)板，每孔 100100ll，每每3 3孔為一組，加入孔為一組，加入100100ll含有化含有化 療藥的培養(yǎng)基，培養(yǎng)療藥的培養(yǎng)基，培養(yǎng)5252小時(shí)，加入

9、小時(shí)，加入2020l l 3 3HTdR, HTdR,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，吸棄上清，加入實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，吸棄上清，加入0.30.3 胰蛋白酶消化細(xì)胞，用多頭細(xì)胞收集器收胰蛋白酶消化細(xì)胞，用多頭細(xì)胞收集器收 集細(xì)胞。最后用液體閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)定每分集細(xì)胞。最后用液體閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)定每分 鐘脈沖數(shù)（鐘脈沖數(shù)（CPMCPM）值。值。 腫瘤藥物敏感實(shí)驗(yàn)18 四唑藍(lán)比色法（四唑藍(lán)比色法（MTTMTT法）法） 原理：活細(xì)胞內(nèi)線粒體脫氫酶能將四甲基偶氮唑原理：活細(xì)胞內(nèi)線粒體脫氫酶能將四甲基偶氮唑 鹽轉(zhuǎn)化為藍(lán)紫色結(jié)晶物鹽轉(zhuǎn)化為藍(lán)紫色結(jié)晶物( (formazan)formazan)，用二甲亞砜用二甲亞砜 （DMSODMSO）溶解

10、后，可在酶標(biāo)儀上記錄吸光度。溶解后，可在酶標(biāo)儀上記錄吸光度。 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):1.:1.操作簡(jiǎn)便，設(shè)備要求不高，時(shí)間短。操作簡(jiǎn)便，設(shè)備要求不高，時(shí)間短。 2. 2.實(shí)驗(yàn)精確，重復(fù)性好，而且無(wú)主觀人為實(shí)驗(yàn)精確，重復(fù)性好，而且無(wú)主觀人為 因素影響，臨床符合率因素影響，臨床符合率8585。 3. 3.成功率高，約為成功率高，約為80809090 腫瘤藥物敏感實(shí)驗(yàn)19 MTTMTT法操作方法法操作方法 用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1 110105 5/ /mlml后接后接 種于微量培養(yǎng)板，每孔種于微量培養(yǎng)板，每孔100100，每組設(shè)三個(gè)平，每組設(shè)三個(gè)平 行孔，加入行孔，加入100100l l

11、 含有化療藥的培養(yǎng)基含有化療藥的培養(yǎng)基, ,置置 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6868小時(shí)，加入小時(shí)，加入2020l MTTl MTT后再后再 培養(yǎng)培養(yǎng)4 4小時(shí)小時(shí), ,吸棄上清，每孔加二甲亞砜吸棄上清，每孔加二甲亞砜 200200l,l,用微量震蕩器震蕩用微量震蕩器震蕩, ,使結(jié)晶產(chǎn)物充分使結(jié)晶產(chǎn)物充分 溶解，在自動(dòng)酶標(biāo)儀上比色，測(cè)出波長(zhǎng)溶解，在自動(dòng)酶標(biāo)儀上比色，測(cè)出波長(zhǎng) 570570nmnm處的吸光度，最后計(jì)算細(xì)胞殺傷活性。處的吸光度，最后計(jì)算細(xì)胞殺傷活性。 腫瘤藥物敏感實(shí)驗(yàn)20 MTTMTT法注意事項(xiàng)法注意事項(xiàng) 血供豐富的腫瘤組織在制取腫瘤單細(xì)胞懸血供豐富的腫瘤組織在制取腫瘤單細(xì)胞懸 液時(shí)，大量的紅細(xì)胞影響測(cè)定，可用紅細(xì)液時(shí)，大量的紅細(xì)胞影響測(cè)定，可用紅細(xì) 胞裂解液裂解紅