離子交換層系

1、離離 子子 交交 換換 層層 析析 ion exchange chromatography 一、原理一、原理 離子交換層析離子交換層析是用是用離子交換劑離子交換劑（具有離子交換（具有離子交換 性能的物質(zhì)）性能的物質(zhì)）作固定相作固定相，利用它與流動相中的離，利用它與流動相中的離 子能進(jìn)行子能進(jìn)行可逆的交換可逆的交換性質(zhì)來分離離子型化合物的性質(zhì)來分離離子型化合物的 層析方法。層析方法。 即溶液中的離子同離子交換劑上即溶液中的離子同離子交換劑上功能基團(tuán)交換反功能基團(tuán)交換反 應(yīng)應(yīng)的過程。的過程。 帶電荷量少帶電荷量少，親和力小，親和力小 的的先先被被洗脫洗脫下來，下來，帶電荷量多帶電荷量多， 親和力大

2、的親和力大的后后被被洗脫洗脫下來。下來。 離子交換過程示意：離子交換過程示意： 起始起始 吸附吸附 解吸解吸 完成完成 x+ : 起始緩沖離子起始緩沖離子 y+ ： ：待分離離子待分離離子 z+ ： ：待分離離子待分離離子 二、離子交換劑的種類二、離子交換劑的種類 在惰性載體上引入帶有電荷的活性基團(tuán)即離在惰性載體上引入帶有電荷的活性基團(tuán)即離 子交換劑。子交換劑。 （一）按活性功能基團(tuán)帶電荷性質(zhì)不同（一）按活性功能基團(tuán)帶電荷性質(zhì)不同 陽離子交換劑陽離子交換劑 帶負(fù)電荷，與陽離子交換帶負(fù)電荷，與陽離子交換 陰離子交換劑陰離子交換劑 帶正電荷，與陰離子交換帶正電荷，與陰離子交換 （二）按載體種類不同

3、（二）按載體種類不同 1.離子交換樹脂離子交換樹脂：主要有聚苯乙烯樹脂：主要有聚苯乙烯樹脂 苯乙烯苯乙烯+二乙烯苯二乙烯苯 聚苯乙烯聚苯乙烯 （單體）（交聯(lián)劑）（單體）（交聯(lián)劑） 二乙烯苯二乙烯苯 交聯(lián)度交聯(lián)度 = 100% 苯乙烯苯乙烯 + 二乙烯苯二乙烯苯 交聯(lián)度大，網(wǎng)孔變小，大分子量的離子不能進(jìn)交聯(lián)度大，網(wǎng)孔變小，大分子量的離子不能進(jìn) 入樹脂顆粒內(nèi)發(fā)生離子交換。入樹脂顆粒內(nèi)發(fā)生離子交換。 在不影響分離的情況下，以采用在不影響分離的情況下，以采用交聯(lián)度較高交聯(lián)度較高的的 樹脂為好，這樣可以提高樹脂對離子的選擇樹脂為好，這樣可以提高樹脂對離子的選擇 性性 。 目數(shù)目數(shù)：離子交換樹脂的顆粒直徑

4、大?。弘x子交換樹脂的顆粒直徑大小 Dowex 50 為為20-50目目 Dowex 20 840 m 50 297 m 100 149 m （代表二乙烯苯的百分含量）代表二乙烯苯的百分含量） 樹脂樹脂resin（據(jù)所含交換基團(tuán)的性質(zhì)分）據(jù)所含交換基團(tuán)的性質(zhì)分） 陽離子交換樹脂陽離子交換樹脂 強(qiáng)酸型強(qiáng)酸型 含磺酸基團(tuán)含磺酸基團(tuán) (R-SO3H) 中等酸型中等酸型 含磷酸基團(tuán)含磷酸基團(tuán) (-O-PO2H4) 弱酸型弱酸型 含酚基、羧基含酚基、羧基 陰離子交換樹脂陰離子交換樹脂 強(qiáng)堿強(qiáng)堿 含季胺基團(tuán)含季胺基團(tuán) -N+(CH3)3 弱堿弱堿 含叔胺、伯胺基團(tuán)含叔胺、伯胺基團(tuán)-N(CH3)2 陰離子交換

5、樹脂對化學(xué)試劑及熱都不如陽離子交換陰離子交換樹脂對化學(xué)試劑及熱都不如陽離子交換 樹脂穩(wěn)定。樹脂穩(wěn)定。 2.離子交換離子交換纖維素纖維素 陰離子交換纖維素陰離子交換纖維素 如如:DEAE-纖維素纖維素 pH8.6以下分離中性或酸性物質(zhì)以下分離中性或酸性物質(zhì),具二乙胺乙具二乙胺乙 基基 陽離子交換纖維素陽離子交換纖維素如如:CM-纖維素纖維素 一般一般 pH4條件下使用條件下使用,具有羧甲基具有羧甲基 3.離子交換凝膠離子交換凝膠 分離大分子物質(zhì)分離大分子物質(zhì) 如：葡聚糖（如：葡聚糖（Sephadex）、）、 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 （PAG）、）、瓊脂糖（瓊脂糖（Sepharose） 三、操作注意

6、點(diǎn)三、操作注意點(diǎn) （一）離子交換劑的選擇（一）離子交換劑的選擇 原則：原則：根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)選擇根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)選擇同一性質(zhì)離同一性質(zhì)離 子交換劑中選用對被分離物質(zhì)各組分之間結(jié)合子交換劑中選用對被分離物質(zhì)各組分之間結(jié)合 力力差異大差異大的型號交換劑，以保證通過離子交換的型號交換劑，以保證通過離子交換 層析后能得到比較滿意的結(jié)果。層析后能得到比較滿意的結(jié)果。 考慮因素：考慮因素： 1.被分離物質(zhì)帶何種電荷被分離物質(zhì)帶何種電荷 2.被分離物質(zhì)分子的大小被分離物質(zhì)分子的大小 大分子物質(zhì)選用凝膠，其次選用纖維素大分子物質(zhì)選用凝膠，其次選用纖維素 3.被分離物質(zhì)所處的環(huán)境被分離物質(zhì)所處的環(huán)境 4

7、.被分離物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)被分離物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì) 5.被分離物質(zhì)的大概數(shù)量被分離物質(zhì)的大概數(shù)量 根據(jù)分離過程的實(shí)驗(yàn)條件根據(jù)分離過程的實(shí)驗(yàn)條件 強(qiáng)酸強(qiáng)堿強(qiáng)酸強(qiáng)堿應(yīng)用廣泛應(yīng)用廣泛 弱酸型弱酸型只能在堿性只能在堿性pH范圍內(nèi)使用范圍內(nèi)使用 弱堿型弱堿型只能在酸性只能在酸性pH范圍內(nèi)使用范圍內(nèi)使用 （二）緩沖液的選擇（二）緩沖液的選擇 原則原則：不能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，所帶電荷應(yīng)與樣品一：不能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，所帶電荷應(yīng)與樣品一 致。避免使樣品變性致。避免使樣品變性 (三三)洗脫劑洗脫劑 原則原則：所用洗脫液比吸著物質(zhì)具有更活潑的：所用洗脫液比吸著物質(zhì)具有更活潑的 離子或基團(tuán)離子或基團(tuán) 改變改變pH或離子強(qiáng)度

8、或離子強(qiáng)度 增強(qiáng)洗脫液與離子交換劑的結(jié)合力增強(qiáng)洗脫液與離子交換劑的結(jié)合力 降低分離物與離子交換劑的結(jié)合力降低分離物與離子交換劑的結(jié)合力 洗脫方式：梯度洗脫洗脫方式：梯度洗脫 四、應(yīng)用四、應(yīng)用 分離多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他帶電的分離多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他帶電的 生物分子生物分子 離子交換層析法分離氨基酸及測定離子交換層析法分離氨基酸及測定 原理原理 所用樣品為天冬氨酸和組氨酸的混合液，分別所用樣品為天冬氨酸和組氨酸的混合液，分別 屬酸性氨基酸屬酸性氨基酸( (pI2.77)pI2.77)、堿性氨基酸堿性氨基酸( (pI7.59)pI7.59)，用用 強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂強(qiáng)酸型陽離子交換

9、樹脂Dowex50，在一定的洗脫條在一定的洗脫條 件下洗脫，將它們分離。利用氨基酸可與茚三酮反件下洗脫，將它們分離。利用氨基酸可與茚三酮反 應(yīng)生成有色化合物進(jìn)行氨基酸鑒定。應(yīng)生成有色化合物進(jìn)行氨基酸鑒定。 紫色物質(zhì)，用于紫色物質(zhì)，用于氨基酸的比色測定和紙層析顯色氨基酸的比色測定和紙層析顯色 與水含茚三酮的反應(yīng)：與水含茚三酮的反應(yīng)： R CH NH2 COOH O O OH OH + 2H2O O O O O N H CH R N CHCOOH R CO2 O O N CH2 R O O NH2 H RCHO + O O OH OHO O N H O O O O N O O H H2O Asp

10、His pH4.2 pH 10 器材器材 1. 層析柱等層析柱等 2.2. 沸水浴沸水浴 試劑試劑 Dowex50 0.1mol/L NaOH pH4.2檸檬酸緩沖液檸檬酸緩沖液 樣品液：氨基酸混合液樣品液：氨基酸混合液 茚三酮混合液茚三酮混合液 操作操作 1 1、層析：將、層析：將Dowex50裝柱后，用裝柱后，用0.1mol/L NaOH清洗樹脂清洗樹脂5分鐘。再用分鐘。再用pH4.2檸檬酸緩檸檬酸緩 沖液沖液平衡平衡10分鐘。（方法同凝膠層析法）加樣分鐘。（方法同凝膠層析法）加樣 8滴。當(dāng)樣品進(jìn)入樹脂后，加入滴。當(dāng)樣品進(jìn)入樹脂后，加入pH4.2檸檬酸檸檬酸 緩沖液洗脫加樣后立即收集，每管收集緩沖液洗脫加樣后立即收集，每管收集3ml （控制流速控制流速15滴滴/ /分鐘）。當(dāng)?shù)谝环逡怀霈F(xiàn)，分鐘）。當(dāng)?shù)谝环逡怀霈F(xiàn)， 換用換用0.1mol/L NaOH作洗脫液，直至第二峰作洗脫液，直至第二峰 收集完畢。用收集完畢。用pH4.2緩沖液再平衡緩沖液再平衡10分鐘，再分鐘，再 生。生。 2 2、檢測：從第、檢測：從第2管起每收集管中加入管起每收集管中加入2ml茚三酮茚三酮 顯色液，充分混合，沸水浴顯色液，充分混合，沸水浴15分鐘，自來水冷分鐘，自來水冷 卻，觀察氨基酸與茚三酮的顯色反應(yīng)，若生成卻，觀察氨基酸與茚三酮的顯色反應(yīng)