酶解法提取山楂黃酮的工藝

1、酶解法提取山楂黃酮的工藝56罷88食品研究與開發(fā)第31卷第期民明町司1r及基礎(chǔ)研究酶解法提取山楂黃酮的工藝劉曉光.毛波.胡立新:?(1.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團(tuán))股份有限公司,北京101107;2.湖北工業(yè)大學(xué)膜技術(shù)研究所,湖北武漢430068)摘要:重點(diǎn)研究以纖維素酶酶解提取山楂果黃酮的工藝.考察纖維素酶的濃度,ph值,溫度,時(shí)間,料液比5個(gè)單因素.結(jié)果表明其最佳條件為:酶質(zhì)量濃度為0.15mg/ml,酶解ph值為5.0,酶解溫度為55oc,酶解時(shí)間為90min,料液比為l:12(g:g).而在這個(gè)最佳條件下,黃酮的提取率可達(dá)到90%,且黃酮類化合物的活性依然存在.關(guān)鍵詞:山楂果;總黃酮;纖維素

2、酶studyonextractionofflavoneinhawthornwithenzymeliuxiao-guang,maobo,hulixin2,(1.innermongoliamengniudairy(group)co.,ltd,beijing101107,china;2.hubeiuniversityoftechnologyschoolofchemicalandenvironmentalengineering,wuhan430068,hubei,china)abstract:thisexperimentkeypointresearchthetechnologywithenzymati

3、chydrolysisofcelluloseenzymeextracttheflavonoidsfromhawthorn.examinedtheconcentrationofcellulase,ph,temperature,time,solidliquidratiooffivesingle-factors.theresultsshowthattheoptimumconditionsis:massconcentrationofenzymeis0.15mg/ml,phis5.0,temperatureis55,timeis90min,solid-liquidratiois1:12(g:g).int

4、hisoptimumconditions,notonlytheeflavonoidsextractionratecanreach90%butalsoensuretheactivityofflavonoidscompoundstillexist.keywords:hawthorn;totalflavone;cellulase山楂屬于薔薇科植物,在我國(guó)具有悠久的保健與藥用歷史.山楂果中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分:黃酮類化合物,山楂酸,熊果酸,果膠,維生素,有機(jī)酸,糖類以及氨基酸等30多種重要化合物1】.其中黃酮類化合物占有7%左右,其功能能改善血液循環(huán),降低膽固醇,改善心腦血管,降低血糖和三元脂肪酸丙酯和

5、穩(wěn)定膠原質(zhì)等,同時(shí)它還是一種很強(qiáng)的抗氧化劑囝.山楂黃酮的提取方法國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者都做了大量研究,大多數(shù)只限于山楂葉的研究,但是其含量較低,提取效率受到限制3.再加上大多數(shù)只限于醇提,而溶劑在回收時(shí)會(huì)增加試驗(yàn)的復(fù)雜性和能耗,以及在最終的提取產(chǎn)品中還有可能含有這些有機(jī)溶劑.山楂黃酮是包裹在細(xì)胞壁中,而這些細(xì)胞壁的主要成分是纖維素.為了提高提取率就必須先打破細(xì)胞壁釋放出里面的物質(zhì).所以纖維素就成了影響提取率的最大因作者簡(jiǎn)介:劉曉光(198l一),男(漢),工程碩士,研究方向:食品加工工藝.通信作者:胡立新(1966一),男(漢),副教授,副院長(zhǎng).素【4j.為了避免有機(jī)溶劑的殘留以及提高提取率,本試驗(yàn)將

6、應(yīng)用纖維素酶對(duì)山楂黃酮進(jìn)行提取分析.1材料與分析方法1.1材料與試劑山楂粉:河北省黃驊市天福園綠色健康產(chǎn)業(yè)有限公司;蘆丁標(biāo)樣:北京維欣儀奧科技發(fā)展有限公司;膜設(shè)備:廣州潔圣膜技術(shù)有限公司;纖維素酶:張家港市金源生物化工有限公司;乙醇,鹽酸.1.2試驗(yàn)儀器722n可見分光光度計(jì):上海精密科學(xué)儀器有限公司;ph計(jì):菏澤市鑫源儀器儀表有限公司;電導(dǎo)率儀:上海宇隆儀器有限公司;恒溫水浴鍋,攪拌機(jī).l_3含量檢測(cè)51工作曲線的繪制:按照文獻(xiàn)所述4】的方法得到計(jì)算蘆丁含量y(1g/ml)與吸光度a間的回歸方程為:y=558.258a+1.63834,相關(guān)系數(shù)r=0.9996.山楂果黃酮的計(jì)算舊:參考資料所

7、應(yīng)用的方法,即基礎(chǔ)研究食品研究與開發(fā)2010年8月第31卷第8期取水提后的待測(cè)液5.0ml于50ml容量瓶中,用30%乙醇定容,取2.0ml于10ml容量瓶中,以下操作同上面的標(biāo)準(zhǔn)曲線一樣,測(cè)定其在510nm處吸光度a.從山楂果中提取的總黃酮含量可按下列公式計(jì)算:jy101o總黃酮含量=一xl00%w式中:100/5,51y2為稀釋倍數(shù);為山楂粉末的重量.1.4有效性檢測(cè)通過文獻(xiàn)所述,運(yùn)用化學(xué)試劑顯色反應(yīng)來鑒定酶解提取的黃酮類化合物的活性是否失活,其主要是選取一些比較有代表性的試劑進(jìn)行顯色反應(yīng).并通過化學(xué)試劑的顯色反應(yīng)結(jié)果來判斷黃酮類化合物的活性.2試驗(yàn)方法加酶提取按如下試驗(yàn)方案進(jìn)行:山楂粉一

8、酶解一離心一上清液/沉淀物一水提一上清液一混合液一待測(cè)其中沉淀物的水提條件:料液比1:15,溫度5o和攪拌時(shí)間1h2.1酶解最佳條件的確定為了更精確的研究出最佳條件:稱取6.0g山楂粉,分別選取了5個(gè)單因素25個(gè)值進(jìn)行試驗(yàn).即酶質(zhì)量濃度:0.05,0.1,0.15020.25mg/ml;ph值:3.5,4,4.5,5,5.5;酶解溫度:40,45,50,55,60ci=;酶解時(shí)間:30,60,90,120,150min;料液比:1:5,1:8,1:10,1:12,1:15.在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,確定每個(gè)單因素的最佳值所處的范圍,并根據(jù)這個(gè)范圍取相應(yīng)的值進(jìn)行正交試驗(yàn)來確定酶解的最佳工藝條件.

9、2.2活性測(cè)定在上面確定的最佳條件下,對(duì)山楂進(jìn)行酶解,離心,再把沉淀物水提1次,混合2次提取液.然后用膜對(duì)提取的綜合液進(jìn)行濃縮.然后根據(jù)1.4的方法對(duì)濃縮液進(jìn)行化學(xué)試劑顯色反應(yīng)來鑒定提取物的活性.3結(jié)果與分析3.1用酶解提取黃銅的條件選擇?單因素試驗(yàn)將山楂粉用纖維素酶解后,進(jìn)行總黃酮的提取與分析,與直接用水提取山楂總黃酮的提取與分析,其結(jié)果見下表1.由表1可見,在ph值4.5,溫度50,時(shí)間1h,料液比1:10的條件下浸提.加酶效果顯著.3.1.1酶濃度對(duì)浸提效果的影響在ph值4.5,溫度50,時(shí)間1h,料液比1:10的s=i裹1酶解對(duì)提取黃酮的影響table1theeffectsofenzy

10、meonextractionofflavone條件下,濃度對(duì)黃酮提取的影響,見圖1.咖m蕊=ii砥趲酶質(zhì)量濃度/(mg/ml)圖1酶的質(zhì)量濃度對(duì)總黃酮含量的影響fig.1effectoftheenzymemassconcentrationonthecontentofthetotalflavonoid由圖1可以看出,隨著酶質(zhì)量濃度的提高,總黃酮含量也在不斷地匕升,當(dāng)酶的質(zhì)量濃度達(dá)到0.15mg/ml的時(shí)候,總黃酮含量的增加就會(huì)變得緩慢一些,由此可知總黃酮的提取也差不多達(dá)到最值了.而且,當(dāng)總黃酮含量達(dá)到最值時(shí),它是不會(huì)隨著酶量的增加而有所變化.而酶解過度又可能對(duì)黃酮的苷鍵造成影響.因此,結(jié)合實(shí)際隋

11、況,認(rèn)為酶的最佳質(zhì)量濃度在0.15mll左右.3.1.2溫度對(duì)酶解效果的影響溫度對(duì)酶解效果的影響的試驗(yàn)條件:纖維素酶的濃度0.1mg/ml,ph值4.5,時(shí)間1h,料液比1:10,結(jié)果見圖2.面托匿粗氆酶解溫度,圖2溫度對(duì)總黃酮含量的影響fig.2effectofthetemperatureonthecontentofthetotalflavonoids由圖2可知:溫度越高,酶解效果越好.但溫度過高,一方面會(huì)破壞黃酮類化合物的活性,而溶出的雜質(zhì)也在增加,另一方面也會(huì)增加試驗(yàn)的復(fù)雜性和能耗.因此,根據(jù)實(shí)際情況,選擇的最佳溫度在55左右.3.1.3ph和酶解時(shí)間對(duì)黃酮提取的影響ph對(duì)酶解來說是很重

12、要的一個(gè)因素,最佳的ph-=t5薔塞鋈31食品研究與開發(fā)第卷第8期艮麗研司,t及基礎(chǔ)研究ph圖3ph值對(duì)總黃酮含量的影響fig.3effectofthephvalueonthecontentofthetotalflavonoids能發(fā)揮出酶的最佳功能.因此在其他相同的條件下,ph對(duì)總黃酮含量的影響從圖3可以看出,總黃酮的含量隨著ph的變大而增加,直到達(dá)到ph=5.0時(shí),總黃酮含量的增加有些平緩了,而隨著ph值得不斷增大,溶出的雜質(zhì)也越來越多.因此,綜合考慮本試驗(yàn)取ph=5.0左右為最佳ph值范圍.嵩警駑酶解時(shí)j司rain圖4酶解時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響fig.4effectofthereacti

13、ngtimeonthecontentofthetotalflavonoids由圖4可以得知,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),其提取的總黃酮也在不斷地增加,當(dāng)?shù)竭_(dá)120min的時(shí)候,總黃酮的增加量就變得小多了.但是直到達(dá)到一定時(shí)間后,總黃酮的含量是會(huì)趨向一個(gè)平衡值.因此,從各方面考慮,選擇的最佳時(shí)間為t=12omin左右.3.1.4料液比對(duì)黃酮提取的影響料液比對(duì)于下一步的試驗(yàn)很重要,如果料液比過小,就會(huì)導(dǎo)致有些物料沒有被浸泡,在試驗(yàn)時(shí)它們就有可能沒有被酶解到,最終會(huì)導(dǎo)致總黃酮含量偏低,而料液比太大,不僅浪費(fèi)水資源,也不利于試驗(yàn)的進(jìn)行.因此恰當(dāng)?shù)牧弦罕群苤匾?從圖5中可以看出最佳料液比在1:12左右.3.2正

14、交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)3.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì),根據(jù)以上單因素的試驗(yàn)所確定的范圍,以山楂果總黃酮含量為考察指標(biāo)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)來確定最優(yōu)方案,即采用i_9(3s)的正交表來安排試驗(yàn).3.2.2數(shù)據(jù)處理由表3可以看出,正交試驗(yàn)所考察因素的總體趨65.5咖l托5驤4.s,43.51:81:101:121:l51:20料液比圖5料液比對(duì)總黃酮含量的影響fig.5effectoftheratioofsolidtoliquidonthecontentofthetotalflavonoids表2因素水平設(shè)計(jì)table2levelsofexperimentfactors.一因素.a濃度/(mg/ml)b溫度,cphdun/mi

15、ne料液t/(g:g)勢(shì)與單因素時(shí)的趨勢(shì)基本一致,每個(gè)因素的對(duì)酶解的提取效果的影響的大小為:ph>酶濃度>酶解溫度>料液比>酶解時(shí)間.因此,從正交表中可以得出最佳提取工藝為a,b2cd.e:.但是,從實(shí)際的角度來看,酶的濃度越大,酶解出來的總黃酮也會(huì)越多,帶出來的雜質(zhì)也越多,后面的處理也越難,也不太經(jīng)濟(jì),而其濃度達(dá)到一定值后,它會(huì)處于一個(gè)水平狀態(tài).因此,選擇abc2de為最佳方案,即酶質(zhì)量濃度0.15mg/ml,酶解ph值5.0,酶解溫度55,酶解時(shí)間90min,料液比1:12m拍565665666.:.渤肌.2.一一436;3,.:599337624986962&am

16、p;&dj9jbll16650卯,&&ja.4k基礎(chǔ)研究食品研究與開發(fā)2010年8月第31卷第8期4效果表征顯色結(jié)果如下表4所示.表4酶解提取物顯色試驗(yàn)結(jié)果table4theresultsofenzymaticbydrolisextractioncolortest從中可以看出提取的黃酮與fec1,溶液反應(yīng)顯墨綠色,與鎂鹽反應(yīng)在紫外光下顯天藍(lán)色熒光,與鋁鹽試劑反應(yīng)明顯地表現(xiàn)出黃酮類化的性質(zhì),因此可以得出結(jié)論:經(jīng)過酶解后,山楂中黃酮類化合物的活性依然存在.5結(jié)論采用酶解法提取山楂總黃酮,經(jīng)過正交試驗(yàn)得出最佳提取工藝條件為:酶質(zhì)量濃度0.15mg/ml,酶解ph值5.0,酶解

17、溫度55,酶解時(shí)間90rain,料液比1:12.試驗(yàn)證明,使用酶解法可以使果肉中的黃酮類物(上接第39頁)表3統(tǒng)計(jì)優(yōu)選方法預(yù)測(cè)提取率大于5.8%的頻數(shù)分布ilable3frequencydistributionoftheextractionrategreaterthan5.8%項(xiàng)目水平頻數(shù)一210l,加權(quán)平均值標(biāo)準(zhǔn)誤95%置信區(qū)間相應(yīng)試驗(yàn)措施乙醇用量,倍液固比,(m)時(shí)間/ii溫度00o5001512916l9l8l0l5190.6739i.06521.21740.13920.ii380.1li70.393伽.95430.8360-1.29440.9921.44243.4-4.038.3m_4

18、3.0ml/g3.4h3.9h0o0163o1.65220.07li.5092i.795295.1一97.5發(fā)現(xiàn)乙醇用量為3.4倍4.0倍,液固比為38.3:143.0:1(ml),提取時(shí)間為3.4h3.9h和溫度在95.1-975oc時(shí),多糖提取率有95%的可能性高于5.8%.3結(jié)論i)通過二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合建立回歸的方程,排列出了四因素之間主次關(guān)系的順序,依次為溫度>液固比>乙醇用量>時(shí)間.2)在試驗(yàn)范圍內(nèi),溫度和時(shí)間的交互效應(yīng)以及溫度和液固比的交互效應(yīng)均達(dá)到極顯著(p(0.0001).因此,高溫,短時(shí),低液固比的組合,或者低溫,長(zhǎng)時(shí),高液固比的組合,都能夠達(dá)到同等水平

19、的多糖提取率.59=i質(zhì)充分地釋放出來,其提取率與未經(jīng)酶解的相比較,酶解法可較顯著提高山楂黃酮的提取收率,且提取出的黃酮的活性依然存在.參考文獻(xiàn):.fl】劉榮華,邵峰,鄧雅瓊,等.山楂化學(xué)成分研究進(jìn)展【j.中藥材,2008,5(7):732劉武.山楂的營(yíng)養(yǎng)化學(xué)成分及保健作用明.食品研究與開發(fā),2002,23(5):65-66313劉北林,董繼生,霍紅.山楂黃酮最佳提取工藝探討【j.食品科學(xué),2007,8(6):167f4張黎明,張小利.酶解一吸附澄清法提取山楂葉總黃酮的工藝研究j.化學(xué)工程,2007,13(8):85-875徐禮焱.中草藥有效性成分分析法(下冊(cè))m.北京:人民衛(wèi)生出版社,1984:69716】何改.山楂葉黃酮類化合物最佳提取工藝研究j】.食品研究與開發(fā),2002,23(1):1517【7林啟壽.中草藥成分化學(xué)【m】.北京:科學(xué)出版社,1997:305收稿日期:20091221lih】3)金頂側(cè)耳多糖得率的最優(yōu)條件適用范圍為乙醇用量為3.4倍一4.0倍,液固比為38.3:143.0:1(mljg),提取時(shí)間為3-4h3.9