原核表達(dá)操作步驟及注意事項

1、參考醫(yī)學(xué)原核表達(dá)操作步驟及注意事項時間：2010-03-03 14:05:01 來源： 作者： 點擊： 1046次 將克隆化基因插入合適載體后導(dǎo)入大腸桿菌用于表達(dá)大量蛋白質(zhì)的方法一般稱為原核表達(dá)。這種方法在蛋白純化、定位及功能分析等方面都有應(yīng)用。大腸桿菌用于表達(dá)重組蛋白有以下特點：易于生長和控制；用于細(xì)菌培養(yǎng)的材料不及哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)的材料昂貴；有各種各樣的大腸桿菌菌株及與之匹配的具各種特性的質(zhì)粒可供選擇。但是，在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白由于缺少修飾和糖基化、磷酸化等翻譯后加工，常形成包涵體而影響表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性及構(gòu)象。表達(dá)載體在基因工程中具有十分重要的作用，原核表達(dá)載體通常為質(zhì)粒，典型的表達(dá)

2、載體應(yīng)具有以下幾種元件：（1）選擇標(biāo)志的編碼序列；（2）可控轉(zhuǎn)錄的啟動子；（3）轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(轉(zhuǎn)錄終止子，核糖體結(jié)合位點)；（4）一個多限制酶切位點接頭；（5）宿主體內(nèi)自主復(fù)制的序列。原核表達(dá)一般程序如下：獲得目的基因準(zhǔn)備表達(dá)載體將目的基因插入表達(dá)載體中（測序驗證）轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌誘導(dǎo)靶蛋白的表達(dá)表達(dá)蛋白的分析擴(kuò)增、純化、進(jìn)一步檢測一、試劑準(zhǔn)備1、LB培養(yǎng)基。2、100mM IPTG（異丙基硫代-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中，0.22m濾膜抽濾，-20保存。二、操作步驟（一）獲得目的基因1、通過PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計一對引物（

3、在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點），PCR循環(huán)獲得所需基因片段。2、通過RT-PCR方法：用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。（二）構(gòu)建重組表達(dá)載體1、載體酶切：將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶（同引物的酶切位點）進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。（三）獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種1、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，根據(jù)重組載體的標(biāo)志（抗Amp或藍(lán)白斑）作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步

4、鑒定。2、測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確，進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆，重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。3、以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。（四）誘導(dǎo)表達(dá)1、挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml LB（含Amp50g/ml）中37過夜培養(yǎng)。2、按150比例稀釋過夜菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中，37震蕩培養(yǎng)至OD600 0.4-1.0（最好0.6，大約需3hr）。3、取部分液體作為未誘導(dǎo)的對照組，余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.4mM作為實驗組，兩組繼續(xù)37震蕩培養(yǎng)3hr。4、分別取菌體1ml，離心12000g30s收獲沉淀，用

5、100l 1%SDS重懸，混勻，7010min。5、離心12000g1min，取上清作為樣品，可做SDS-PAGE等分析。三、注意事項1、選擇表達(dá)載體時，要根據(jù)所表達(dá)蛋白的最終應(yīng)用考慮。如為方便純化，可選擇融合表達(dá)；如為獲得天然蛋白，可選擇非融合表達(dá)。2、融合表達(dá)時在選擇外源DNA同載體分子連接反應(yīng)時，對轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯過程中密碼結(jié)構(gòu)的閱讀不能發(fā)生干擾。如何做原核表達(dá)（prokaryotic expression）2010-03-26 22:54:25 來源：易生物實驗 瀏覽次數(shù)：673 網(wǎng)友評論 0 條 首先來一些大腸桿菌表達(dá)的基本概念：一個完整的表達(dá)系統(tǒng)通常包括配套的表達(dá)載體和表達(dá)菌株，如果是特

6、殊的誘導(dǎo)表達(dá)還包括誘導(dǎo)劑，如果是融合表達(dá)還包括純化系統(tǒng)或者Tag檢測等等。選擇表達(dá)系統(tǒng)通常要根據(jù)實驗?zāi)康膩砜紤]，比如表達(dá)量高低，目標(biāo)蛋白的活性，表達(dá)產(chǎn)物的純化方法等等。主要歸結(jié)在表達(dá)載體的選擇上。關(guān)鍵詞：原核原核表達(dá)prokaryoticexpression人們合成與生物相關(guān)的物質(zhì)是從尿素開始的，1828年，德國化學(xué)家維勒人工合成了存在于生物體的這種有機(jī)物。在1960年我國科學(xué)家采用化學(xué)方法首次成功地合成了具有生物活性的蛋白質(zhì)胰島素。隨著內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)用各種不同的載體在原核、真核系統(tǒng)中進(jìn)行蛋白表達(dá)更為行之有效。而這其中大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展得最為迅速、成熟。原核表達(dá)具

7、有操作方便、快捷，需時較短，表達(dá)量大，適合工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點。雖然也有缺少糖基化和表達(dá)后加工等問題，當(dāng)有了其它多種表達(dá)系統(tǒng)后，原核系統(tǒng)仍是我們合成外源蛋白的首選。在網(wǎng)上看到有人把原核表達(dá)技術(shù)分成四個等級：初次嘗試掃盲、亂棍打棗入門、系統(tǒng)優(yōu)化中級和自成一體高手，覺得十分有意思。但是根據(jù)筆者自己的經(jīng)驗以及耳聞目睹的一些經(jīng)歷告訴我：做表達(dá)？那是謀事在人，成事在天。有時候你把克隆做出來了，雙酶切鑒定沒問題，測序沒問題，可是就是看不到表達(dá)帶。原因當(dāng)然可以分析，實驗也是可以改進(jìn)，但是竄改一下戈爾泰的話：“成功的實驗都是一樣的，失敗的實驗各有各的不幸。”在實驗遇到瓶頸的時候要如何進(jìn)行分析，找到問題的癥結(jié)是我們

8、的實驗關(guān)鍵所在。在準(zhǔn)備進(jìn)行原核表達(dá)的時候需要考慮的因素很多，市面上可供選擇的載體、菌株也很多，要如何進(jìn)行正確的選擇，找到適合自己的載體是十分重要的。所以，現(xiàn)在要對目前常用的一些載體進(jìn)行介紹，讓我們對其相關(guān)產(chǎn)品及其表達(dá)原理進(jìn)行了解，以方便實驗設(shè)計。首先來一些大腸桿菌表達(dá)的基本概念：一個完整的表達(dá)系統(tǒng)通常包括配套的表達(dá)載體和表達(dá)菌株，如果是特殊的誘導(dǎo)表達(dá)還包括誘導(dǎo)劑，如果是融合表達(dá)還包括純化系統(tǒng)或者Tag檢測等等。選擇表達(dá)系統(tǒng)通常要根據(jù)實驗?zāi)康膩砜紤]，比如表達(dá)量高低，目標(biāo)蛋白的活性，表達(dá)產(chǎn)物的純化方法等等。主要歸結(jié)在表達(dá)載體的選擇上。 表達(dá)載體：我們關(guān)心的質(zhì)粒上的元件包括啟動子，多克隆位點，終止密

9、碼，融合Tag（如果有的話），復(fù)制子，篩選標(biāo)記/報告基因等。通常，載體很貴，我們可以通過實驗室之間交換得到免費(fèi)的載體。但是要小心，輾轉(zhuǎn)多個實驗室和多個實驗室成員之手的載體是否保持原來的遺傳背景？MCS是否還是原來那個MCS？是我們要特別注意的。復(fù)制子：通常表達(dá)載體都會選用高拷貝的復(fù)制子。pSC101類質(zhì)粒是嚴(yán)謹(jǐn)方式復(fù)制，拷貝數(shù)低，pCoE1，pMBI(pUC)類的復(fù)制子的拷貝數(shù)高達(dá)500以上，是表達(dá)載體常用的。通常情況下質(zhì)?？截悢?shù)和表達(dá)量是非線性的正相關(guān)，當(dāng)然也不是越多越好，超過細(xì)胞的承受范圍反而會損害細(xì)胞的生長。如果碰巧需要2個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化，就要考慮復(fù)制元是否相容的問題。篩選標(biāo)記和報告基因：氨

10、芐青霉素抗性是最常見的篩選標(biāo)記，卡那霉素或者是新霉素次之，通常是另一個載體的篩選標(biāo)記用。四環(huán)素，紅霉素和氯霉素等已經(jīng)日漸式微?？剐曰虻倪x擇要注意是否會對研究對象產(chǎn)生干擾，比如代謝研究中要留意抗性基因編碼的酶是否和代謝物相互作用。在表達(dá)篩選中要注意的問題應(yīng)該就是LB倒板前加抗生素的溫度，溫度過高容易導(dǎo)致抗生素失效。今天耐青霉素的超級細(xì)菌泛濫，不知道是否有我們實驗人員的功勞呢？大家“隨便倒掉”已經(jīng)獲得氨芐抗性的大腸桿菌之前有沒有經(jīng)過煮沸或者消毒等處理呢？從以前的一針50萬單位到現(xiàn)在100多萬個單位，青霉素劑量似乎越來越大了。對于做表達(dá)來說，如果不是要研究啟動子的強(qiáng)弱，通常比較少關(guān)心或者用到報告基

11、因吧。綠色熒光蛋白是最常用的報告基因了（注意選擇適用原核表達(dá)版本的GFP），其他還有半乳糖苷酶啊，熒光素酶啊等等。一些融合表達(dá)Tag也有報告基因的功能。啟動子、終止子和核糖體結(jié)合位點啟動子：啟動子的強(qiáng)弱是對表達(dá)量有決定性影響的因素之一。從轉(zhuǎn)錄模式上看有組成型表達(dá)和誘導(dǎo)調(diào)控型表達(dá)。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的啟動子。組成型表達(dá)：表達(dá)載體的啟動子為組成型啟動子，也就是一直努力不停表達(dá)目的蛋白的啟動子，如pMAL系統(tǒng)。持續(xù)性表達(dá)通常表達(dá)量比較高，成本低，但是不適合表達(dá)一些對宿主細(xì)菌生長有害的蛋白。因為過量或者有害的表達(dá)產(chǎn)物會影響細(xì)菌的生長，反過來影響表達(dá)量的積累。誘導(dǎo)調(diào)控型表達(dá)：表達(dá)載

12、體采用誘導(dǎo)型啟動子，只有在誘導(dǎo)劑存在的條件下才能表達(dá)目的產(chǎn)物。這種方法有助于避免菌體生長前期高表達(dá)對菌體生長的影響，又可減少菌體蛋白酶對目標(biāo)產(chǎn)物的降解。特別適合解決有毒蛋白的表達(dá)。另外也有啟動子是組成型的，但是啟動子所依賴的轉(zhuǎn)錄酶是誘導(dǎo)表達(dá)的，也屬于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。融合表達(dá)：表達(dá)載體的多克隆位點上有一段融合表達(dá)標(biāo)簽（Tag），表達(dá)產(chǎn)物為融合蛋白（有分N端或者C端融合表達(dá)），方便后繼的純化步驟或者檢測。對于特別小的分子建議用較大的Tag（如GST）以獲得穩(wěn)定表達(dá)；而一般的基因多選擇小Tag以減少對目的蛋白的影響。His-Tag是最廣泛采用的Tag。分泌表達(dá)：在起始密碼和目的基因之間加入信號肽，可以

13、引導(dǎo)目的蛋白穿越細(xì)胞膜，避免表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的過度累積而影響細(xì)胞生長，或者形成包含體，而且表達(dá)產(chǎn)物是可溶的活性狀態(tài)不需要復(fù)性。通常這種分泌只是分泌到細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間的周質(zhì)空間。可溶性表達(dá)：大腸桿菌表達(dá)效率很高，特別是強(qiáng)啟動子，目的蛋白來不及折疊而形成不溶的包含體顆粒，包含體容易純化但是復(fù)性效率不高。分泌表達(dá)可以得到可溶的產(chǎn)物，也有部分融合Tag有助于提高產(chǎn)物的可溶性，比如Thio，pMAL系統(tǒng)。轉(zhuǎn)錄終止子對外源基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)有重要作用控制轉(zhuǎn)錄的RNA長度提高穩(wěn)定性，避免質(zhì)粒上異常表達(dá)導(dǎo)致質(zhì)粒穩(wěn)定性下降。放在啟動子上游的轉(zhuǎn)錄終止子還可以防止其他啟動子的通讀，降低本底。轉(zhuǎn)錄終止子有兩

14、類，Rho因子作用下使轉(zhuǎn)錄終止 mRNA和根據(jù)模版上的對稱序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)而終止mRNA。常見的是rrnBrRNA操縱子的T1T2串連轉(zhuǎn)錄終止子。核糖體結(jié)合位點：啟動子下游從轉(zhuǎn)錄起始位點開始延伸的一段堿基序列，其中能與rRNA16S亞基3端互補(bǔ)的 SD序列對形成翻譯起始復(fù)合物是必需的，多數(shù)載體啟動子下游都有SD序列，也有些載體沒有，適合自帶SD序列的基因表達(dá)，要留意。表達(dá)菌株：我們往往最容易忽視的一點。不同的表達(dá)載體對應(yīng)有不同的表達(dá)菌株，一些特別設(shè)計的菌株更有助于解決一些表達(dá)難題，這一點生物通會有專門的介紹。同樣的，交換獲得的免費(fèi)菌株，要小心其遺傳背景是否已經(jīng)發(fā)生改變？當(dāng)心。注：以上各種特性是

15、可以相互組合的，不是排他的！首先來一些大腸桿菌表達(dá)的基本概念：一個完整的表達(dá)系統(tǒng)通常包括配套的表達(dá)載體和表達(dá)菌株，如果是特殊的誘導(dǎo)表達(dá)還包括誘導(dǎo)劑，如果是融合表達(dá)還包括純化系統(tǒng)或者Tag檢測等等。選擇表達(dá)系統(tǒng)通常要根據(jù)實驗?zāi)康膩砜紤]，比如表達(dá)量高低，目標(biāo)蛋白的活性，表達(dá)產(chǎn)物的純化方法等等。主要歸結(jié)在表達(dá)載體的選擇上。關(guān)鍵詞：原核原核表達(dá)prokaryoticexpression幾個常用的啟動子和誘導(dǎo)調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)最早應(yīng)用于的表達(dá)系統(tǒng)是Lac乳糖操縱子，由 啟動子Plac + 操縱基因lacO +結(jié)構(gòu)基因組成。其轉(zhuǎn)錄受CAP正調(diào)控和lacI負(fù)調(diào)控。lacUV5突變能夠在沒有CAP的存在下更有效地起

16、始轉(zhuǎn)錄，該啟動子在轉(zhuǎn)錄水平上只受lacI 的調(diào)控，因而隨后得到了更廣泛采用。lacI產(chǎn)物是一種阻遏蛋白，能結(jié)合在操縱基因lacO上從而阻遏轉(zhuǎn)錄起始。乳糖的類似物IPTG可以和 lacI產(chǎn)物結(jié)合，使其構(gòu)象改變離開lacO，從而激活轉(zhuǎn)錄。這種可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控成為了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)載體構(gòu)建的常用元件。tac啟動子是trp啟動子和lacUV5的拼接雜合啟動子，且轉(zhuǎn)錄水平更高，比lacUV5更優(yōu)越。trc啟動子是trp啟動子和lac啟動子的拼合啟動子，同樣具有比trp更高的轉(zhuǎn)錄效率和受lacI阻遏蛋白調(diào)控的強(qiáng)啟動子特性。在常規(guī)的大腸桿菌中，lacI阻遏蛋白表達(dá)量不高，僅能滿足細(xì)胞自身的lac操縱子，無法

17、應(yīng)付多拷貝的質(zhì)粒的需求，導(dǎo)致非誘導(dǎo)條件下較高的本底表達(dá)，為了讓表達(dá)系統(tǒng)嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控產(chǎn)物表達(dá)，能過量表達(dá)lacI阻遏蛋白的lacIq突變菌株常被選為 Lac/Tac/trc表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)菌株。現(xiàn)在的Lac/Tac/trc載體上通常還帶有l(wèi)acIq 基因，以表達(dá)更多l(xiāng)acI阻遏蛋白實現(xiàn)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼T導(dǎo)調(diào)控。IPTG廣泛用于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，但是IPTG有一定毒性，有人認(rèn)為在制備醫(yī)療目的的重組蛋白并不合適，因而也有用乳糖代替IPTG作為誘導(dǎo)物的研究。另外一種研究方向是用lacI的溫度敏感突變體，30度下抑制轉(zhuǎn)錄，42度開發(fā)。熱誘導(dǎo)不用添加外來的誘導(dǎo)物，成本低，但是由于發(fā)酵過程中加熱升溫比較慢而影響誘導(dǎo)效果，而且熱

18、誘導(dǎo)本身會導(dǎo)致大腸桿菌的熱休克蛋白激活，一些蛋白酶會影響產(chǎn)物穩(wěn)定。以 噬菌體再起轉(zhuǎn)錄啟動子PL、PR 構(gòu)建的載體也為大家所熟悉。這兩個強(qiáng)啟動子受控于噬菌體cI基因產(chǎn)物。cI基因的溫度敏感突變體cI857(ts)常常被用于調(diào)控PL、PR啟動子的轉(zhuǎn)錄。同樣也是30度下阻遏啟動子轉(zhuǎn)錄，42度下解除抑制開發(fā)轉(zhuǎn)錄。同樣的，PL、PR表達(dá)載體需要攜帶cI857(ts)菌株作為表達(dá)載體，現(xiàn)在更常見的做法是在載體上攜帶cI857(ts)基因，所以可以有更大的宿主選擇范圍。另外一種思路是通過嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控cI產(chǎn)物來間接調(diào)控PL、PR啟動子的轉(zhuǎn)錄。比如Invitrogen的PL表達(dá)系統(tǒng)，就是將受trp啟動子嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控的c

19、I基因溶源化到宿主菌染色體上，通過加入酪氨酸誘導(dǎo)抑制trp啟動子，抑制cI 基因的表達(dá)，從而解除強(qiáng)大的PL啟動子的抑制。T7啟動子是當(dāng)今大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的主流，這個功能強(qiáng)大兼專一性高的啟動子經(jīng)過巧妙的設(shè)計而成為原核表達(dá)的首選，尤其以Novagen公司的pET系統(tǒng)為杰出代表。強(qiáng)大的T7啟動子完全專一受控于T7 RNA 聚合酶，而高活性的T7 RNA 聚合酶合成mRNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍當(dāng)二者同時存在時，宿主本身基因的轉(zhuǎn)錄競爭不過T7表達(dá)系統(tǒng)，幾乎所有的細(xì)胞資源都用于表達(dá)目的蛋白；誘導(dǎo)表達(dá)后僅幾個小時目的蛋白通?？梢哉嫉郊?xì)胞總蛋白的50%以上。由于大腸桿菌本身不含T7RNA 聚合酶

20、，需要將外源的T7 RNA 聚合酶引入宿主菌，因而T7 RNA聚合酶的調(diào)控模式就決定了T7系統(tǒng)的調(diào)控模式非誘導(dǎo)條件下，可以使目的基因完全處于沉默狀態(tài)而不轉(zhuǎn)錄，從而避免目的基因毒性對宿主細(xì)胞以及質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響；通過控制誘導(dǎo)條件控制T7 RNA 聚合酶的量，就可以控制產(chǎn)物表達(dá)量，某些情況下可以提高產(chǎn)物的可溶性部分。有何高招？且看我為你一一道來：有幾種方案可用于調(diào)控T7 RNA 聚合酶的合成，從而調(diào)控T7表達(dá)系統(tǒng)。1.噬菌體DE3是lambda噬菌體的衍生株，含有l(wèi)acI抑制基因和位于lacUV5啟動子下的T7 RNA 聚合酶基因。DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)就是最常用的表達(dá)菌株，構(gòu)建好

21、的表達(dá)載體可以直接轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株中，誘導(dǎo)調(diào)控方式和lac一樣都是 IPTG誘導(dǎo)。2.另一種策略是用不含T7RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可完全避免因目的蛋白對宿主細(xì)胞的潛在毒性而造成的質(zhì)粒不穩(wěn)定。然后用CE6噬菌體侵染宿主細(xì)胞CE6是lambda噬菌體含溫度敏感突變(cI857ts)和pL/pR啟動子控制T7RNA 聚合酶的衍生株，在熱誘導(dǎo)條件下可以激活T7 RNA 聚合酶的合成。此了噬菌體之外，還可以通過共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒提供T7 RNA 聚合酶。比如有人用受溶氧濃度控制的啟動子調(diào)控T7 RNA聚合酶合成，據(jù)說這比較適合工業(yè)化發(fā)酵的條件控制。由于T7 RNA 聚合酶的調(diào)控方式仍有可能有痕量的本底

22、表達(dá)，控制基礎(chǔ)表達(dá)的手段之一是培養(yǎng)基外加葡萄糖，有助于控制本底表達(dá)水平。二是采用帶有T7lac啟動子的載體 在緊鄰T7 啟動子的下游有一段lacI操縱子序列編碼表達(dá)lac 阻遏蛋白(lacI)，lac阻遏蛋白可以作用于宿主染色體上T7 RNA 聚合酶前的lacUV5 啟動子并抑制其表達(dá)，也作用于載體T7 lac 啟動子，以阻斷任何T7RNA聚合酶導(dǎo)致的目的基因轉(zhuǎn)錄。pLacI工轉(zhuǎn)化也是同樣的原理。如果這還不夠，更為嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控手段還有在宿主菌中表達(dá)另一個可以結(jié)合并抑制T7 RNA聚合酶的基因T7融菌酶，降低本底。常用的帶溶菌酶質(zhì)粒有pLysS和pLysE，相容的ori都不會影響后繼的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，

23、前者表達(dá)的溶菌酶的水平要比后者低得多，對細(xì)胞生長影響小，而pLysE會明顯降低宿主菌的生長水平，容易出現(xiàn)過度調(diào)節(jié)，增加蛋白表達(dá)的滯后時間，從而降低表達(dá)水平。通過幾種不同方法來巧妙調(diào)控T7聚合酶合成，T7啟動子發(fā)展出了史上功能最強(qiáng)大，最豐富的表達(dá)系統(tǒng)。 真核表達(dá)載體和原核表達(dá)載體的區(qū)別 瀏覽次數(shù)：456次懸賞分：30 | 提問時間：2010-7-22 19:52 | 提問者：紫云鳩 | 問題為何被關(guān)閉 越詳細(xì)越全面越好推薦答案 主要是因為原核和真核表達(dá)系統(tǒng)所需的表達(dá)元件不同。比如說啟動子，終止子在兩種表達(dá)系統(tǒng)中是不一樣的。帶有真核表達(dá)元件的是真核載體，能在真核生物內(nèi)表達(dá)；帶有原核表達(dá)元件的是原核

24、載體，能在原核生物內(nèi)表達(dá)。兩者都具有的為穿梭載體。1)真核表達(dá)載體和原核表達(dá)載體就是能在真核生物或原核生物中表達(dá)的載體,它們一般都帶有能在真核生物或原核生物中表達(dá)的必需表達(dá)元件;2)真核表達(dá)和原核表達(dá)的目的都是為了能夠大量獲得自己所需要的目的基因的表達(dá)產(chǎn)物,最好有生物活性,以便下一步的實驗需要.3)原核表達(dá)載體一般只能在原核生物中表達(dá)外源基因,但有些穿梭載體可以分別在真核和原核生物中表達(dá)它們的表達(dá)元件.原核表達(dá)原核表達(dá)將克隆化基因插入合適載體后導(dǎo)入大腸桿菌用于表達(dá)大量蛋白質(zhì)的方法一般稱為原核表達(dá)。這種方法在蛋白純化、定位及功能分析等方面都有應(yīng)用。大腸桿菌用于表達(dá)重組蛋白有以下特點：易于生長和控

25、制；用于細(xì)菌培養(yǎng)的材料不及哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)的材料昂貴；有各種各樣的大腸桿菌菌株及與之匹配的具各種特性的質(zhì)?？晒┻x擇。但是，在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白由于缺少修飾和糖基化、磷酸化等翻譯后加工，常形成包涵體而影響表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性及構(gòu)象。表達(dá)載體在基因工程中具有十分重要的作用，原核表達(dá)載體通常為質(zhì)粒，典型的表達(dá)載體應(yīng)具有以下幾種元件：（1）選擇標(biāo)志的編碼序列；（2）可控轉(zhuǎn)錄的啟動子；（3）轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(轉(zhuǎn)錄終止子，核糖體結(jié)合位點)；（4）一個多限制酶切位點接頭；（5）宿主體內(nèi)自主復(fù)制的序列。原核表達(dá)一般程序如下：獲得目的基因準(zhǔn)備表達(dá)載體將目的基因插入表達(dá)載體中（測序驗證）轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌誘導(dǎo)靶蛋白的表

26、達(dá)表達(dá)蛋白的分析擴(kuò)增、純化、進(jìn)一步檢測。一、試劑準(zhǔn)備1、LB培養(yǎng)基。2、100mM IPTG（異丙基硫代-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22m濾膜抽濾，-20保存。二、操作步驟（一）獲得目的基因1、通過PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計一對引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點），PCR循環(huán)獲得所需基因片段。2、通過RT-PCR方法：用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。（二）構(gòu)建重組表達(dá)載體1、載體酶切：將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶（同引

27、物的酶切位點）進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。（三）獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種1、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，根據(jù)重組載體的標(biāo)志（抗Amp或藍(lán)白斑）作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。2、測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆，重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。3、以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。（四）誘導(dǎo)表達(dá)1、挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml LB（含Amp50g/ml）中37過夜培養(yǎng)。2、按150比例稀釋過夜

28、菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中,37震蕩培養(yǎng)至OD6000.4-1.0（最好0.6，大約需3hr）。3、取部分液體作為未誘導(dǎo)的對照組,余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.4mM作為實驗組,兩組繼續(xù)37震蕩培養(yǎng)3hr。4、分別取菌體1ml,離心12000g30s收獲沉淀，用100l 1%SDS重懸，混勻,7010min。5、離心12000g1min，取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。三 、注意事項1、選擇表達(dá)載體時，要根據(jù)所表達(dá)蛋白的最終應(yīng)用考慮。如為方便純化，可選擇融合表達(dá)；如為獲得天然蛋白，可選擇非融合表達(dá)。2、融合表達(dá)時在選擇外源DNA同載體分子

29、連接反應(yīng)時，對轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯過程中密碼結(jié)構(gòu)的閱讀不能發(fā)生干擾。原核表達(dá)的原理與實驗方案Time：2010-01-31 AM 09:32Author:bioerHits: 388 times 一、原核表達(dá)的原理1、 E . coli 表達(dá)系統(tǒng) E . coli 是重要的原核表達(dá)體系。在重組基因轉(zhuǎn)化入E . coli 菌株以后，通過溫度的控制，誘導(dǎo)其在宿主菌內(nèi)表達(dá)目的蛋白質(zhì)，將表達(dá)樣品進(jìn)行SDS-PAGE 以檢測表達(dá)蛋白質(zhì)。2、 外源基因的誘導(dǎo)表達(dá) 提高外源基因表達(dá)水平的基本手段之一，就是將宿主菌的生長與外源基因的表達(dá)分成兩個階段，以減輕宿主菌的負(fù)荷。常用的有溫度誘導(dǎo)和藥物誘導(dǎo)。本實驗采用異丙基硫代-

30、D-半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)外源基因表達(dá)。 不同的表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)方法并不完全相同，因啟動子不同，誘導(dǎo)表達(dá)要根據(jù)具體情況而定。二、原核表達(dá)的材料1、誘導(dǎo)表達(dá)材料( 1 ) LB （Luria-Bertani）)培養(yǎng)基 酵母膏 (Yeast extract)5g 蛋白胨 (Peptone) 10g NaCl 10g 瓊脂 (Agar) 1-2% 蒸餾水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0 適用范圍：大腸桿菌( 2 ) IPTG 貯備液： 2 g IPTG溶于10 mL 蒸餾水中，0 . 22 m 濾膜過濾除菌，分裝成1 mL /份，-20 保存。( 3 ) l 凝膠電泳加

31、樣緩沖液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 ) 50 mmol / L DTT 2 % SDS （電泳級） 0.1% 溴酚藍(lán) 10% 甘油2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白純化材料1 ）酶溶法（1）裂解緩沖液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 ) 1 mmol / L EDTA 100 mmol / LNaCI（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。（3）10 mg / mL 溶菌酶。（4）脫氧膽酸。（5）1 mg / mL DNase I。2 ）超聲破碎法( 1 ) TE 緩沖液。( 2 ) 2SDS -PAGE 凝膠電

32、泳加樣緩沖液： 100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 ) 100 mmol / L DTT 4 %SDS 0.2%溴酚藍(lán) 20%甘油三、實驗方案1、外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)( 1 )用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶消化載體DNA 和目的基因。( 2 )按連接步驟連接目的基因和載體，并轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的宿主菌。( 3 )篩選出含重組子的轉(zhuǎn)化菌落，提取質(zhì)粒DNA 作限制性內(nèi)切核酸酶圖譜，DNA 序列測定，確定無誤后進(jìn)行下一步。( 4)如果表達(dá)載體的原核啟動子為PL 啟動子，則在30-32 培養(yǎng)數(shù)小時，使培養(yǎng)液的OD600達(dá)0.4-0.6 ，迅速使溫度升至42 繼續(xù)培養(yǎng)3-5h ；如果表達(dá)載

33、體的原核啟動子為tac 等，則37 培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)小時達(dá)到對數(shù)生長期后加IPTG 至終濃度為1 mmol / L。繼續(xù)培養(yǎng)3-5h 。( 5)取上述培養(yǎng)液1 mL，1000g 離心，1 min ，沉淀，加100 L 聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣緩沖液后，作SDS -PAGE 檢測。2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白質(zhì)純化1 ）細(xì)菌的裂解 常用方法有： 高溫珠磨法； 高壓勻漿； 超聲破碎法； 酶溶法； 化學(xué)滲透等。前三種方法屬機(jī)械破碎法，并且方法 、 已在工業(yè)生產(chǎn)中得到應(yīng)用，后三種方法在實驗室研究中應(yīng)用較為廣泛。下面介紹酶溶法和超聲破碎法的實驗步驟。（1）酶溶法常用的溶解酶有溶菌酶、-1,3 -葡聚糖酶、-1

34、,6 -葡聚糖酶、蛋白酶、殼多糖酶、糖苷酶等。溶菌酶主要對細(xì)菌類有作用，而其他幾種酶對酵母作用顯著。主要步驟為： 4 ，5000rpm 離心，15 min ，收集誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌培養(yǎng)液（100 mL ）。棄上清，約每克濕菌加3 mL 裂解緩沖液，懸浮沉淀。 每克菌加8LPMSF及80L 溶菌酶，攪拌20 min ；邊攪拌邊每克菌加4 mg 脫氧膽酸（在冷室中進(jìn)行）。 37 ，玻棒攪拌，溶液變得粘稠時每克菌加20L DNase I。室溫放置至溶液不再粘稠。（2 ）超聲破碎法聲頻為15-20 kHz 的超聲波在高強(qiáng)度聲能輸入下可以進(jìn)行細(xì)胞破碎，在處理少量樣品時操作簡便，液體量損失較少，同時還可對染色

35、體DNA 進(jìn)行剪切，大大降低液體的粘稠度。 收集1 L 誘導(dǎo)表達(dá)的工程菌，40 ，5000r pm 離心，15 min ；棄上清，約每克濕菌加3 mLTE 緩沖液。 按超聲處理儀廠家提供的功能參數(shù)進(jìn)行破菌；10 000g 離心，15min ，分別收集上清液和沉淀。 分別取少量上清和沉淀，加入等體積的2 凝膠電泳加樣緩沖液，進(jìn)行SDS -PAGE 。注意事項：超聲破碎與聲頻、聲能、處理時間、細(xì)胞濃度、菌種類型等因素有關(guān)，應(yīng)根據(jù)具體情況掌握；超聲波破菌前，標(biāo)本經(jīng)3 -4 次凍溶后更容易破碎。2 ）包涵體的分離蛋白質(zhì)在細(xì)菌中的高水平表達(dá)，常形成相差顯微鏡下可見的細(xì)胞質(zhì)顆粒，即為包涵體，經(jīng)離心沉淀后可

36、用Triton-X100 / EDTA 或尿素洗滌，若為獲取可溶性的活性蛋白，須將洗滌過的包涵體重新溶解并進(jìn)行重折疊。（1）試劑與配制 洗滌液I：0.5 % Triton X -100 10 mmol / L EDTA ( pH 8 . 0 )溶于細(xì)胞裂解液中。 2凝膠電泳加樣緩沖液。（2）細(xì)胞裂解混合物12 000g 離心，15 min , 4 ；棄上清，沉淀用9 洗滌液l 懸??；室溫放置5 min ; 12 000g 離心15 min , 4 ；吸出上清，用100 L 水重新懸浮沉淀；分別取10 L上清和重新懸浮的沉淀，加10 L 2 凝膠電泳加樣緩沖液，進(jìn)行SDS-PAGE 。3 ）包涵

37、體的溶解和復(fù)性（1）試劑與配制 緩沖液I： 1 mmol / L PMSF 8mol /L 尿素 10 mmol / L DTT 溶于前述裂解緩沖液中。 緩沖液： 50 mmol / L KH2PO4 1 mmol / L EDTA ( pH 8 . 0 ) 50 mmol / L NaCI 2 mmol / L 還原型谷胱甘肽 1 mmol / L 氧化型谷胱甘肽 KOH 和HCI 2凝膠電泳加樣緩沖液。（2）用100 L 緩沖液I 溶解包涵體；室溫放置lh ；加9緩沖液，室溫放置30 min ，用KOH 調(diào)pH 到10.7 ；用HCI 調(diào)至pH 8 . 0 ，在室溫放置至少30 min ；

38、1000g 離心，15 min ，室溫；吸出上清液并保留，用100 L 2凝膠電泳加樣緩沖液溶解沉淀；取10 L 上清，加10 L 2 凝膠電泳加樣緩沖液，與20 L 重新溶解的沉淀進(jìn)行SDS-PAGE 。四、注意事項（1）不同的大腸桿菌表達(dá)載體帶有不同的啟動子和誘導(dǎo)成分。實驗者必須根據(jù)特定系統(tǒng)和用途決定相應(yīng)的實驗方案。（2）表達(dá)和檢測時，應(yīng)設(shè)置對照組，如轉(zhuǎn)化載體和非誘導(dǎo)細(xì)胞。（3）由于大腸桿菌中表達(dá)的重組蛋白質(zhì)缺少哺乳動物細(xì)胞特異的翻譯后加工，所以，其生物活性無法與天然蛋白質(zhì)相提并論原核表達(dá)目錄1 定義 2 原核表達(dá)系統(tǒng) 1. 2.1 表達(dá)載體 2. 2.2 表達(dá)菌株1 定義 2 原核表達(dá)系

39、統(tǒng) 1. 2.1 表達(dá)載體 2. 2.2 表達(dá)菌株展開編輯本段1 定義廣義的原核表達(dá)，是指發(fā)生在原核生物內(nèi)的基因表達(dá)。 狹義的原核表達(dá)，常出現(xiàn)于生物工程中。是指通過基因克隆技術(shù)，將外源目的基因，通過構(gòu)建表達(dá)載體并導(dǎo)入表達(dá)菌株的方法，使其在特定原核生物或細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。 編輯本段2 原核表達(dá)系統(tǒng)一個完整的表達(dá)系統(tǒng)通常包括配套的表達(dá)載體和表達(dá)菌株。如果是特殊的誘導(dǎo)表達(dá)還包括誘導(dǎo)劑，如果是融合表達(dá)還包括純化系統(tǒng)或者Tag檢測等等。選擇表達(dá)系統(tǒng)通常要根據(jù)實驗?zāi)康膩砜紤]，比如表達(dá)量高低，目標(biāo)蛋白的活性，表達(dá)產(chǎn)物的純化方法等等。 2.1 表達(dá)載體為了獲得高水平的基因表達(dá)產(chǎn)物，人們通過綜合考慮控制轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋

40、白質(zhì)穩(wěn)定性及向胞外分泌等諸多方面的因素，設(shè)計出了許多具有不同特點的表達(dá)載體，以滿足表達(dá)不同性質(zhì)、不同要求的目的基因的需要。 通常關(guān)心的表達(dá)載體質(zhì)粒上的元件包括：啟動子、多克隆位點、終止密碼、融合Tag（如果有的話）、復(fù)制子、篩選標(biāo)記或報告基因等。 復(fù)制子：通常表達(dá)載體都會選用高拷貝的復(fù)制子。pSC101類質(zhì)粒是嚴(yán)謹(jǐn)方式復(fù)制，拷貝數(shù)低，pCoE1，pMBI(pUC)類的復(fù)制子的拷貝數(shù)高達(dá)500以上，是表達(dá)載體常用的。通常情況下質(zhì)?？截悢?shù)和表達(dá)量是非線性的正相關(guān)，當(dāng)然也不是越多越好，超過細(xì)胞的承受范圍反而會損害細(xì)胞的生長。如果碰巧需要2個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化，就要考慮復(fù)制元是否相容的問題。 篩選標(biāo)記和報告基

41、因：氨芐青霉素抗性是最常見的篩選標(biāo)記，卡那霉素或者是新霉素次之，通常是另一個載體的篩選標(biāo)記用。四環(huán)素，紅霉素和氯霉素等已經(jīng)日漸式微?？剐曰虻倪x擇要注意是否會對研究對象產(chǎn)生干擾，比如代謝研究中要留意抗性基因編碼的酶是否和代謝物相互作用。在表達(dá)篩選中要注意的問題應(yīng)該就是LB倒板前加抗生素的溫度，溫度過高容易導(dǎo)致抗生素失效。對于做表達(dá)來說，如果不是要研究啟動子的強(qiáng)弱，通常比較少關(guān)心或者用到報告基因吧。綠色熒光蛋白是最常用的報告基因了。其他還有半乳糖苷酶、熒光素酶等。一些融合表達(dá)Tag也有報告基因的功能。 啟動子：啟動子的強(qiáng)弱是對表達(dá)量有決定性影響的因素之一。從轉(zhuǎn)錄模式上看有組成型表達(dá)和誘導(dǎo)調(diào)控型表

42、達(dá)。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的啟動子。 終止子：轉(zhuǎn)錄終止子對外源基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)有重要作用，即控制轉(zhuǎn)錄的RNA長度提高穩(wěn)定性，避免質(zhì)粒上異常表達(dá)導(dǎo)致質(zhì)粒穩(wěn)定性下降。放在啟動子上游的轉(zhuǎn)錄終止子還可以防止其他啟動子的通讀，降低本底。轉(zhuǎn)錄終止子有兩類，Rho因子作用下使轉(zhuǎn)錄終止mRNA和根據(jù)模版上的對稱序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)而終止mRNA。常見的是rrnB rRNA操縱子的T1T2串連轉(zhuǎn)錄終止子。 核糖體結(jié)合位點：啟動子下游從轉(zhuǎn)錄起始位點開始延伸的一段堿基序列，其中能與rRNA16S亞基3端互補(bǔ)的SD序列對形成翻譯起始復(fù)合物是必需的，多數(shù)載體啟動子下游都有SD序列，也有些載體沒有

43、。 2.2 表達(dá)菌株表達(dá)菌株是我們往往最容易忽視的一點。目前絕大多數(shù)重要的目的基因都是在大腸桿菌中表達(dá)的。不同的表達(dá)載體對應(yīng)有不同的表達(dá)菌株，一些特別設(shè)計的菌株更有助于解決一些表達(dá)難題。 yhbdxs:實驗思路是這樣的，將目的基因連接到含有GFP的表達(dá)載體上，得到GFP和目的基因的融合蛋白，再純化。我現(xiàn)在還沒有選定用哪個載體，請你們幫幫我，太多不清楚的地方了。E.coli:通常在進(jìn)行原核表達(dá)實驗時，選擇使用pET系列載體居多。但是pET系列載體不帶有GFP基因，其上的His Tag標(biāo)簽是專門用于分離純化的。通常情況下，目的基因與GFP蛋白融合，用于真核表達(dá)的實驗較多。yhbdxs:謝謝E.co

44、li的回答，我愛E.coli！希望給我?guī)砗眠\(yùn)氣！由于時間緊迫，真核表達(dá)周期長，只能選擇原核表達(dá)了。1、用clontech的pGFP載體可以做原核表達(dá)嗎？2、先把目標(biāo)基因連接到GFP載體上，切下來，連接到pET載體上，可以嗎？3、為什么pET系列載體不帶有GFP基因?。縀.coli:clontech的pGFP載體是原核表達(dá)載體，應(yīng)該符合你的實驗要求，但是我沒有使用過，因此對其具體操作注意不是很了解。如果你一定要求使用pET載體表達(dá)帶有GFP報告基因的目的基因，在進(jìn)行載體構(gòu)建時，加入GFP報告基因與目的基因融合應(yīng)該是可行的。不過這樣構(gòu)建起來也是挺麻煩的，不如使用商品化載體方便些。yhbdxs:在

45、進(jìn)行載體構(gòu)建時，加入GFP報告基因與目的基因融合應(yīng)該是可行的。如果這樣的話，是不是要用到一個輔助載體啊，就是說我一共要用三個載體：目的基因先克隆到T載體送去測序，然后亞克隆到含有GFP的載體融合，最后再把融合基因連接到pET載體上，進(jìn)行表達(dá)，是這樣的思路嗎？我很急，一直在這里等著看結(jié)果呢，謝謝E.coliE.coli:我認(rèn)為在進(jìn)行載體構(gòu)建時，需要根據(jù)你的實驗要求選擇實驗步驟：1.如果在進(jìn)行目的基因與GFP基因融合時，中間有酶切位點可以滿足你的實驗要求，可以：1).將目的基因擴(kuò)增后克隆至中間載體上測序。（目的基因去除終止密碼子）2).將1).測序好的片段通過酶切位點克隆至pET載體上。3).如果

46、你現(xiàn)有的GFP基因兩側(cè)的酶切位點滿足已克隆目的基因的pET載體MCS的要求，可以直接將GFP基因克隆至2).構(gòu)建好的載體上。但是這樣在目的基因與GFP基因間會存在有酶切位點，至少一個。并且在進(jìn)行GFP基因克隆時，需要嚴(yán)格考查讀碼框的準(zhǔn)確性，不可以移碼。2.如果在進(jìn)行目的基因與GFP基因融合時，中間必須緊密相連，不允許有其它堿基，可以：1).將目的基因擴(kuò)增后克隆至中間載體上測序。（目的基因去除終止密碼子）2).克隆GFP基因，T載體即可。3).使用1)./2).質(zhì)粒為模板，設(shè)計引物搭鏈擴(kuò)增目的基因與GFP基因，兩側(cè)加入與pET MCS相匹配的酶切位點。并克隆至T載體，測序。4).將3).測序好的

47、片段通過酶切位點克隆至pET載體上。3.如果在進(jìn)行目的基因與GFP基因融合表達(dá)后，你需要進(jìn)一步將GFP融合蛋白切除，那么依據(jù)2.所示步驟，在進(jìn)行第3).步搭鏈擴(kuò)增時，還需要在搭鏈引物上設(shè)計蛋白酶識別位點，其余相同。以便在進(jìn)行蛋白表達(dá)后，可以使用蛋白酶將GFP融合蛋白切除。具體的蛋白酶識別位點設(shè)計情況，你可以參照pET Vector manual.亂七八糟的，希望可以對你的實驗有所幫助。yhbdxs:今天下午和老板商量了一下，最終決定用clontech的pGFP載體，雖然還沒有把握，現(xiàn)在我只能祈求自己好運(yùn)氣了！wangjiali:你好：為什么不直接連在載體上酶切測序，還要連接在中間載體上測序？E

48、.coli:目的基因在進(jìn)行擴(kuò)增時，有可能會產(chǎn)生突變。將目的基因克隆至中間載體后，如果測序發(fā)現(xiàn)有突變，進(jìn)行突變修復(fù)時比較容易操作。而且PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆的難度遠(yuǎn)比酶切后克隆至表達(dá)載體的難度要小，陽性克隆率高，也比較有利于實驗。pET原核表達(dá)金標(biāo)準(zhǔn)作者： 轉(zhuǎn)載：admin 來源：生物吧 點擊數(shù)：5975 更新時間：2008年03月23日 pET載體中，目標(biāo)基因克隆到T7噬菌體強(qiáng)轉(zhuǎn)錄和翻譯信號控制之下，并通過在宿主細(xì)胞提供T7RNA聚合酶來誘導(dǎo)表達(dá)。Novagen的pET系統(tǒng)不斷擴(kuò)大，提供了用于表達(dá)的新技術(shù)和選擇，目前共包括36種載體類型、15種不同宿主菌和設(shè)計用于有效檢測和純化目標(biāo)蛋白的許多其

49、它相關(guān)產(chǎn)品。優(yōu)點是原核蛋白表達(dá)引用最多的系統(tǒng)在任何大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，基礎(chǔ)表達(dá)水平最低真正的調(diào)節(jié)表達(dá)水平的“變阻器”控制提供各種不同融合標(biāo)簽和表達(dá)系統(tǒng)配置可溶性蛋白生產(chǎn)、二硫鍵形成、蛋白外運(yùn)和多肽生產(chǎn)等專用載體和宿主菌許多載體以LIC載體試劑盒提供，用于迅速定向克隆PCR產(chǎn)物許多宿主菌株以感受態(tài)細(xì)胞形式提供，可立即用于轉(zhuǎn)化陽性pFORCETM克隆系統(tǒng)具有高效克隆PCR產(chǎn)物、陽性選擇重組體和高水平表達(dá)目標(biāo)蛋白等特點。pET系統(tǒng)概述pET系統(tǒng)是在大腸桿菌中克隆和表達(dá)重組蛋白的最強(qiáng)大系統(tǒng)。根據(jù)最初由Studier等開發(fā)的T7啟動子驅(qū)動系統(tǒng)，Novagen的pET系統(tǒng)已用于表達(dá)成千上萬種不同蛋白。控制

50、基礎(chǔ)表達(dá)水平pET系統(tǒng)提供6種載體-宿主菌組合，能夠調(diào)節(jié)基礎(chǔ)表達(dá)水平以優(yōu)化目標(biāo)基因的表達(dá)。沒有單一策略或條件適用于所有目標(biāo)蛋白，所以進(jìn)行優(yōu)化選擇是必要的。宿主菌株質(zhì)粒在非表達(dá)宿主菌中構(gòu)建完成后，通常轉(zhuǎn)化到一個帶有T7RNA聚合酶基因的宿主菌（DE3溶原菌）中表達(dá)目標(biāo)蛋白。在DE3溶原菌中，T7RNA聚合酶基因由lacUV5啟動子控制。未誘導(dǎo)時便有一定程度轉(zhuǎn)錄，因此適合于表達(dá)其產(chǎn)物對宿主細(xì)胞生長無毒害作用的一些基因。而宿主菌帶有pLysS和pLyE時調(diào)控會更嚴(yán)緊。pLys質(zhì)粒編碼T7溶菌酶，它是T7RNA聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未誘導(dǎo)細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄目標(biāo)基因的能力。pLysS宿主菌產(chǎn)生低量T

51、7溶菌酶，而pLysE宿主菌產(chǎn)生更多酶，因此是最嚴(yán)緊控制的DE3溶原菌。有11種不同DE3溶原化宿主菌。使用最廣泛的為BL21及其衍生菌株，它的優(yōu)點在于缺失lon和ompT蛋白酶。B834菌株為甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型，因此可用35S-甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸對目標(biāo)蛋白進(jìn)行高特異活性標(biāo)記。BLR為recA-衍生菌株，改善了質(zhì)粒單體產(chǎn)量，有助于穩(wěn)定含有重復(fù)序列的目標(biāo)質(zhì)粒。兩個硫氧還蛋白還原酶(trxB)突變菌株(AD494,BL21trxB)，有利于大腸桿菌胞漿中二硫鍵形成。OrigamiTM和OrigamiB菌株為trxB/gor雙突變，這兩個酶是主要還原途徑的關(guān)鍵酶。Origami和OrigamiB

52、宿主菌的主要優(yōu)點是能形成正確折迭的含有二硫鍵的蛋白。新的RosettaTM菌株補(bǔ)充了四種大腸桿菌稀有密碼子的tRNA，改善了由于密碼子使用頻率不同而引起的一些真核蛋白低表達(dá)。其它菌株背景包括K-12菌株HMS174和NovaBlue，象BLR一樣為recA-。這些菌株可穩(wěn)定表達(dá)其產(chǎn)物可能導(dǎo)致DE3噬菌體丟失的某些目標(biāo)基因。由于存在F附加體編碼的高親和力lacIq阻遏蛋白，NovaBlue為一個有用的嚴(yán)緊型宿主菌。此外，Novagen提供了DE3溶原化試劑盒，用于制備其它遺傳背景的新表達(dá)宿主菌。表達(dá)高毒性基因或制備新的DE3溶原菌的另一替代方法是通過lCE6感染提供T7RNA聚合酶。雖然不如用I

53、PTG誘導(dǎo)DE3溶原菌方便，這種策略也被優(yōu)先用于一些應(yīng)用中。高嚴(yán)緊性T7lac啟動子除了在宿主菌水平選擇三種基本的表達(dá)嚴(yán)緊性，pET系統(tǒng)中T7啟動子本身提供了兩種不同的嚴(yán)緊性選擇：普通T7啟動子和T7lac啟動子。T7lac啟動子在啟動子區(qū)下游17bp處含有一個25bp的lac操縱序列。該位點結(jié)合lac阻遏蛋白能夠有效降低T7RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄，這樣提供了在DE3溶原菌中抑制基礎(chǔ)表達(dá)的第二種基于lacI的機(jī)制（除了抑制lacUV5）。含T7lac啟動子的pET質(zhì)粒還具有它們自己的lacI，確保足夠的阻遏蛋白結(jié)合到操縱基因位點上。BR在實際應(yīng)用中，為了獲得最高產(chǎn)量的蛋白，通常應(yīng)該測試多種不同的載

54、體/宿主菌組合。控制誘導(dǎo)的表達(dá)水平在許多情況下，表達(dá)活性可溶性最好的蛋白依賴于宿主細(xì)胞的背景、培養(yǎng)條件和合適的載體配置。通常，目標(biāo)蛋白活性最高的條件與產(chǎn)量最高的條件不一致。除了根據(jù)載體/宿主菌組合控制T7RNA聚合酶的基礎(chǔ)表達(dá)提供不同嚴(yán)緊性，pET系統(tǒng)還根據(jù)誘導(dǎo)物（IPTG）濃度，對目標(biāo)蛋白表達(dá)提供了真正的“變阻器”控制。Tuner和OrigamiB宿主菌的lacY突變使這種控制成為可能。選擇pET載體所有的pET載體均來自pBR322，但彼此間先導(dǎo)序列、表達(dá)信號、融合標(biāo)簽、相關(guān)限制性位點和其它特點有所不同。有兩大類pET質(zhì)粒，即轉(zhuǎn)錄載體和翻譯載體：轉(zhuǎn)錄載體（包括pET-21、pET-23和pET-24）表達(dá)目標(biāo)RNA，但不提供翻譯信號。它們用于從自身帶有細(xì)菌翻譯信號的目標(biāo)基因表達(dá)蛋白。（注意：轉(zhuǎn)錄載體通過命名后面的一個缺失字母后綴加以區(qū)分）翻譯載體含有設(shè)計用于蛋白表達(dá)的有效翻譯起始信號。許多載體在讀碼框a、b和c中帶有克隆位點，分別對應(yīng)于BamHI位點的GGA、GAT和ATC三聯(lián)體。選擇要點選擇用于表達(dá)的pET載體通常涉及多種因素?？紤]以下三個主要因素：所表達(dá)