人外周血單核細(xì)胞分離技術(shù)

1、外周血單核細(xì)胞分離 技術(shù) 本頁(yè)僅作為文檔封面，使用時(shí)可以刪除 This document is for reference only-rar21 year.March 人外周血單核細(xì)胞分離 1 抗凝血的預(yù)離心分別取正常人新鮮抗凝全血 A: 20 mL J 50 mL離心管中,以2 000 r/min離心20 min吸棄上層血漿,獲得下層 沉淀細(xì)胞約1012.5 mL。 2. 沉淀細(xì)胞的稀釋與離心分離在所獲取沉淀 A中的細(xì)胞中加入Hank s液（不含Ca?+、Mg2+, pH 7.27.6）體積比仍未1:1,混勻， 制成細(xì)胞懸液。 B:無(wú)菌抗凝血與Hank s液或PBS以1:1體積在試管中混勻。

2、 另取一離心管，加入LTS1077淋巴細(xì)胞分層液，然后用毛細(xì)吸管距分層液上icm處將 細(xì)胞懸液小心而緩慢地加于其上面，使稀釋血液重疊于分層液上。此時(shí)稀釋后的細(xì)胞懸液 分離液淋巴細(xì)胞體積為：1:1-與用水平離心機(jī)以2000 r/min離心20min,離心結(jié)束后，取 出離心管，可見(jiàn)管中液體已經(jīng)分層。 管內(nèi)可見(jiàn)分為4層：最上層是血漿，含部分血小板：第二層為薄薄的白膜層，主要臺(tái) 單個(gè)核細(xì)胞，還混雜有少疑血小板：第三層為分離液層；第四層為粒細(xì)胞及紅細(xì)胞，紅細(xì) 胞沉于管底，而粒細(xì)胞則緊貼在壓積紅細(xì)胞上呈一層很薄的白膜 3. 單個(gè)核細(xì)胞的提取、洗滌與懸浮、貼壁 吸去最上層的血漿，收集血漿層和淋巴細(xì)胞分藹液交

3、界而的單個(gè)核細(xì)胞，盡量全部吸 出PBMCo加34倍以上體積Hanks或PBS液于所得的單個(gè)核細(xì)胞中，用毛細(xì)吸管輕輕吹 判均勻，避免產(chǎn)小氣泡，液柱高度不超過(guò)離心管的2/3o混勻后離心1500r/min離心 lOmin,低速離心有利于去除細(xì)胞懸液中留存的血小板，去上淸液。 注意：還可以先用吸管把霧狀層上而的液體吸走，注意不要碰到霧狀層，然后在把要的部 分慢慢吸岀來(lái)。第二種方法，比較簡(jiǎn)單一些。 再用同樣洗滌液洗滌細(xì)胞2次，1500r/min離心lOmin,洗去殘留的淋巴細(xì)胞分離 液。再以RPMI-1640培養(yǎng)基離心洗滌2次，吸盡上淸，以充分去除血小板等雜質(zhì)。按每亳 升血液標(biāo)本加0.2 mL含20%小牛血淸的Hank s液（或含10%胎牛血淸及25 mmol/L hepas 的RPMI-1640液34 mL）重新混懸細(xì)胞37C、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)23 h后去除上淸, 得到貼壁的單核細(xì)胞。于各培瓶中分別加入含10%胎牛血淸的RPMI-1640液34 mL,按 需調(diào)左細(xì)胞密度，于37C、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)備用。 4. 單核細(xì)胞的純度與細(xì)胞活力的鑒左 取一泄體積的細(xì)胞懸液送做流式細(xì)胞CD14. CD56等檢査以測(cè)左所得細(xì)胞的純度。取 1滴細(xì)胞懸液登于血細(xì)胞汁數(shù)板內(nèi)計(jì)數(shù)。以臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞活力。取1