實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞器的活體染色

1、實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞器的活體染色活體染色是能使生活有機(jī)體的細(xì)胞或組織特異性著色但對(duì)活樣品沒有毒害 作用或毒害作用較小的一種活體染色方法。這種方法能夠顯示活體組織或細(xì)胞 內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)，但在短時(shí)間內(nèi)不影響細(xì)胞的生命活動(dòng)并且不會(huì)對(duì)活體細(xì)胞或組 織造成顯著的物理、化學(xué)變化以致引起細(xì)胞的死亡。活體染色技術(shù)可用來研究 生活狀態(tài)下的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理、病理狀態(tài)。根據(jù)所用染色劑的性質(zhì)和染色方法的不同，通常把活體染色分為體內(nèi)活體 染色與體外活體染色兩類。體內(nèi)活體染色是以膠體狀的染料溶液注入動(dòng)、植物 體內(nèi)，染料的膠粒固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊結(jié)構(gòu)里，達(dá)到易于識(shí)別的目 的。體外活體染色又稱超活染色，它是由活的動(dòng)、植物分離出部

2、分細(xì)胞或組織 小塊，以染料溶液浸染，染料被選擇固定在活細(xì)胞的某種結(jié)構(gòu)上而顯色?；铙w 染料之所以能固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊的部分，主要是靠染料的“電化學(xué) ”特性。堿性染料的膠粒表面帶陽離子，酸性染料的膠粒表面帶有陰離子，而被 染的部分本身也是具有陰離子或陽離子，這樣，它們彼此之間就發(fā)生了吸引作 用。但并非任何染料均可用于活體染色，理論上應(yīng)選擇那些對(duì)細(xì)胞無毒性或毒 性極小的染料，且使用時(shí)需要配成稀淡的溶液。一般說來，最為適用的是堿性 染料，這可能是因?yàn)樗哂腥芙庠陬愔|(zhì) （如卵磷脂、膽固醇等 ）的特性，易于被 細(xì)胞吸收。詹納斯綠 B（Janus green B和中性紅（neutral red）兩

3、種堿性染料是活體 染色劑中最重要的染料，對(duì)于線粒體和液泡系的染色分別具有專一性。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模ㄒ唬┱莆占?xì)胞器超活染色染料的選擇及作用原理。（二）學(xué)習(xí)細(xì)胞器的超活染色技術(shù)；并能對(duì)這一技術(shù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)和探索。二、實(shí)驗(yàn)原理線粒體是細(xì)胞進(jìn)行呼吸作用的場(chǎng)所，其形態(tài)和數(shù)量隨不同物種、不同組織 器官和不同的生理狀態(tài)而發(fā)生變化。詹納斯綠 B 是毒性較小的堿性染料，可專 一性地對(duì)線粒體進(jìn)行超活染色，這是由于線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素氧化酶系的作 用，使染料始終保持氧化狀態(tài) （即有色狀態(tài) ），呈藍(lán)綠色 ;而線粒體周圍的細(xì)胞質(zhì) 中，這些染料被還原為無色的色基 （即無色狀態(tài) ）中性紅是一種弱堿性 pH指示劑，變色范圍pH6

4、.48.0之間（由紅變 黃）。在中性或微堿性環(huán)境中，植物的活細(xì)胞能大量吸收中性紅并向液泡中排 泌，由于液泡在一般情況下呈酸性反應(yīng)，因此，進(jìn)入液泡的中性紅便解離出大 量陽離子而呈現(xiàn)櫻桃紅色，因而對(duì)活細(xì)胞的液泡系的染色有專一性，細(xì)胞核與 細(xì)胞質(zhì)則不著色。三、實(shí)驗(yàn)用品（一）（二）器材：顯微鏡、恒溫水浴鍋、解剖盤、剪刀、鑷子、雙面刀片、載玻片、凹面載 玻片、蓋玻片、表面皿、吸管、牙簽、吸水紙。材料：人口腔上皮細(xì)胞，洋蔥鱗莖，小麥或黃豆幼根根尖。（三）1. 試劑：Ringer 溶液：氯化鈉 0.85 g （變溫動(dòng)物用 0.65 g）氯化鉀 0.25 g氯化鉀 0.25 g氯化鈣 0.03 g蒸餾水 10

5、0 mL注：Ringer 溶液是生理學(xué)實(shí)驗(yàn)常用的生理鹽溶液。2.1%、中性紅溶液：稱取0.5 g中性紅溶于50 mL Ringer溶液，稍加熱（3040C ）使之很快溶解， 用濾紙過濾，即為 1%原液，裝入棕色瓶于暗處保存，否則易氧化沉淀，失去染 色能力。臨用前，取已配制的1%中性紅溶液1 mL,加入29 mL Ringer溶液混 勻，即為的中性紅溶液，裝入棕色瓶備用。3.1%、xx綠B溶液：稱取50 mg詹納斯綠B溶于5 mL Ringer溶液中，稍加微熱（3040C），使之 溶解，用濾紙過濾后，即為1%原液。取1%原液I mL加入49 mL Ringer溶液， 即成工作液裝入瓶中備用。最好

6、現(xiàn)用現(xiàn)配，以保持它的充分氧化能力。四、實(shí)驗(yàn)方法（一）人口腔粘膜上皮細(xì)胞線粒體的超活染色與觀察1. 取清潔載玻片放在37C恒溫水浴鍋的金屬板上，滴2滴詹納斯綠B染 液。2. 實(shí)驗(yàn)者用牙簽寬頭在自己口腔粘膜處稍用力刮取上皮細(xì)胞，將刮下的粘液 狀物放入載玻片的染液滴中，染色 1015 min（注意不可使染液干燥，必要時(shí)可 再加滴染液 ），3. 蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去四周溢出的染液，顯微鏡下觀察。4. 在低倍鏡下，選擇平展的口腔上皮細(xì)胞，換高倍鏡或油鏡進(jìn)行觀察，繪圖 顯示觀察結(jié)果。（二）植物根細(xì)胞液泡系的超活染色與觀察1. 實(shí)驗(yàn)前現(xiàn)將黃豆種子在培養(yǎng)皿內(nèi)發(fā)芽，待胚根長(zhǎng)到1 cm 以上后使用。2. 用刀

7、片切取0.5 cm左右根尖，用刀片縱切根尖，置于載玻片上。3加一滴中性紅染液，染色35 min,吸去染液，加一滴Rin ger液，再加 上蓋玻片。4. 用吸水紙包住載玻片和蓋玻片,拇指輕輕壓片,使根尖壓扁,利于觀察。 然后吸去多余的染液,切不可使載玻片和蓋玻片相對(duì)移動(dòng)。5 .壓好的片子先在低倍鏡下尋找根尖細(xì)胞,再換到高倍鏡下仔細(xì)觀察,繪圖 顯示液泡在根尖區(qū)的分布（三）植物表皮細(xì)胞液泡系的超活染色與觀察1.撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮或小麥葉片上表皮小塊若干,投入的中性紅溶液中染 色510 min,取出12片，在pH低于7.0的蒸餾水中稍加沖洗，在2.3.4.3. 載玻片上滴一滴蒸餾水,小心地將制片平展到載玻片上,加蓋玻片,在顯 微鏡下觀察,描述觀察到的染色部位。將步驟1中的活體染色制片取出幾片放入 pH略高于7.0的自來水中浸泡 1015 min,再置于載玻片上鏡檢，描述觀察到的染色部位。為了確證中性紅染色部位,可將上述洋蔥內(nèi)表皮染片浸入 1 mol/L 的硝酸鉀 溶液中浸泡 10 min 左右,然后取出觀察。由于硝酸鉀能使原生質(zhì)強(qiáng)烈膨脹,發(fā) 生“