選修一5.3血紅蛋白的提取和分離

1、課題課題3 血紅蛋白的提取和分離血紅蛋白的提取和分離 2003年年4月月14日宣布人類基因組序列圖完成日宣布人類基因組序列圖完成 這標志著進入了后基因組時代。這標志著進入了后基因組時代。 人類基因組：指人類基因組：指DNA分子所攜帶的全部分子所攜帶的全部 遺傳信息。遺傳信息。 蛋白質(zhì)組：生物個體表達的蛋白質(zhì)分子的蛋白質(zhì)組：生物個體表達的蛋白質(zhì)分子的 總和。主要是對蛋白質(zhì)功能的研究總和。主要是對蛋白質(zhì)功能的研究 n n 新華網(wǎng)首爾月日電（記者新華網(wǎng)首爾月日電（記者 干玉蘭）韓國浦項工干玉蘭）韓國浦項工 業(yè)大學科學家日宣布，他們已查明可抑制艾滋病病毒感業(yè)大學科學家日宣布，他們已查明可抑制艾滋病病毒

2、感 染的染的“”蛋白質(zhì)核心部分的結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)核心部分的結(jié)構(gòu)。 n 浦項工業(yè)大學生物科學系教授吳秉夏等人，當天公開了浦項工業(yè)大學生物科學系教授吳秉夏等人，當天公開了 “”蛋白質(zhì)內(nèi)核心部分蛋白質(zhì)內(nèi)核心部分“” 的三維分子結(jié)構(gòu)，并稱已弄清楚這一結(jié)構(gòu)的正確位置及它與的三維分子結(jié)構(gòu)，并稱已弄清楚這一結(jié)構(gòu)的正確位置及它與 其他結(jié)構(gòu)之間的相互作用。研究成果發(fā)表在最新一期其他結(jié)構(gòu)之間的相互作用。研究成果發(fā)表在最新一期分子分子 細胞細胞雜志上。雜志上。 n 2年英國年英國自然自然雜志曾刊登論文說，雜志曾刊登論文說，“ ”蛋白質(zhì)可有效抑制艾滋病病毒的感染。此后，世界各蛋白質(zhì)可有效抑制艾滋病病毒的感染。此后，世界各

3、 地的很多科學家開始研究地的很多科學家開始研究“”蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，但蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，但 到目前為止尚未有人宣稱取得突破性進展。到目前為止尚未有人宣稱取得突破性進展。 我國對蛋白質(zhì)的現(xiàn)階段研究 n n 我國獨立主持國際我國獨立主持國際“人類肝臟蛋白質(zhì)組人類肝臟蛋白質(zhì)組 計劃計劃”，參加國際人類蛋白質(zhì)組研究計劃中的，參加國際人類蛋白質(zhì)組研究計劃中的 “大規(guī)模抗體制備大規(guī)?？贵w制備”項目項目 n 血血 每個肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團，每個肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團， 此基團可攜帶一分子氧或一分子二此基團可攜帶一分子氧或一分子二 氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而 呈紅色。呈紅色

4、。 凝膠色譜法凝膠色譜法 電泳法電泳法 緩沖溶液緩沖溶液 它們在血紅蛋白的提取中分別起到什么作用。它們在血紅蛋白的提取中分別起到什么作用。 凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理 電泳法分離樣品的原理電泳法分離樣品的原理 緩沖溶液的組成和作用機理緩沖溶液的組成和作用機理 思考思考1 分離生物大分子的基本思路是什么？分離生物大分子的基本思路是什么？ 選用一定的物理或化學的方法分離具有選用一定的物理或化學的方法分離具有 不同物理或化學性質(zhì)的生物大分子。不同物理或化學性質(zhì)的生物大分子。 思考思考2 蛋白質(zhì)的分離和提取的原理是什么？蛋白質(zhì)的分離和提取的原理是什么？ 根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差

5、異，如分子的根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的 形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、 溶解度和吸附的性質(zhì)和對其他分子的親溶解度和吸附的性質(zhì)和對其他分子的親 和力等等，可以用來分離不同蛋白質(zhì)。和力等等，可以用來分離不同蛋白質(zhì)。 一、基礎(chǔ)知識：一、基礎(chǔ)知識： 凝膠色譜法（分配色譜法）：凝膠色譜法（分配色譜法）： 2、凝膠：、凝膠： 一些微小多孔的球體（由多糖類構(gòu)成如一些微小多孔的球體（由多糖類構(gòu)成如 葡聚糖、瓊脂糖，內(nèi)含許多貫穿的通道葡聚糖、瓊脂糖，內(nèi)含許多貫穿的通道) 1、概念：根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對、概念：根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對 分子質(zhì)量的大小，利用具有

6、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝分子質(zhì)量的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝 膠來進行分離。膠來進行分離。 3、原理：、原理：當不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相當不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相 對（對（ ）的蛋白質(zhì)容易進入）的蛋白質(zhì)容易進入 凝膠內(nèi)部的通道，路程（凝膠內(nèi)部的通道，路程（ ），移動速），移動速 度（度（ ），而（），而（ ）的蛋白）的蛋白 質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在 （ ）移動，路程（）移動，路程（ ），移動速），移動速 度（度（ ），相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因），相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因 此得以分離。此得以分離。 4、具體過程、具體過程 相對分子質(zhì)量較小相對分子質(zhì)量較小 較長

7、較長 較慢較慢相對分子質(zhì)量較大相對分子質(zhì)量較大 凝膠外部凝膠外部 較短較短 較快較快 凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理 1、概念：、概念：在一定的范圍內(nèi)，能對抗外在一定的范圍內(nèi)，能對抗外 來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液 PH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具 有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。 緩沖溶液：緩沖溶液： 2、作用：、作用： 能夠抵制（能夠抵制（ ）的對溶液）的對溶液 的（的（ ）的影響，維持）的影響，維持PH基本不變基本不變。 外界的酸或堿外界的酸或堿 PH值值

8、 3、緩沖溶液的配制、緩沖溶液的配制 通常由（通常由（ ）種緩沖劑溶解于水）種緩沖劑溶解于水 中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的（中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的（ ） 就可以制得（就可以制得（ ）使用的）使用的 緩沖液。緩沖液。 12 使用比例使用比例 在不同在不同PH范圍內(nèi)范圍內(nèi) 思考：說出人體血液中緩沖液。思考：說出人體血液中緩沖液。 NaH2PO4 / Na2HPO4 H2CO3 / NaHCO3 電泳：電泳： 1、概念、概念：指帶電粒子在電場作用下發(fā)指帶電粒子在電場作用下發(fā) 生遷移的過程。生遷移的過程。 在血紅蛋白整個實驗室中用的緩沖在血紅蛋白整個實驗室中用的緩沖 液是液是磷酸緩沖液磷酸緩沖液，目的目

9、的是利用緩沖液模是利用緩沖液模 擬細胞內(nèi)的擬細胞內(nèi)的PHPH環(huán)境，保證血紅蛋白的正環(huán)境，保證血紅蛋白的正 常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察（紅色）（紅色）和材和材 料的科學研究（料的科學研究（活性）活性） 2、原理：許多重要的生物大分子，如、原理：許多重要的生物大分子，如 （ ）等都具有）等都具有( ) 在在( )下，這些基團會帶上下，這些基團會帶上 （ ） 。在電場的作用下，這些帶。在電場的作用下，這些帶 電分子會向著與其（電分子會向著與其（ ） 移動。電泳利用了待分離樣品中各種分子移動。電泳利用了待分離樣品中各種分子 （ ）以及分子本身）以及分子本身 （ ）、（）、（ ）的不同

10、使帶電分子）的不同使帶電分子 產(chǎn)生不同的（產(chǎn)生不同的（ ），從而實現(xiàn)樣），從而實現(xiàn)樣 品中各種分子的分離。品中各種分子的分離。 多肽、核酸多肽、核酸可解離的基團可解離的基團 正電或負電正電或負電 所帶電荷相反的電極所帶電荷相反的電極 帶電性質(zhì)的差異帶電性質(zhì)的差異 大小大小 形狀形狀 遷移速度遷移速度 一定的一定的PH 為了消除靜電荷對遷移率的影響可以在凝膠為了消除靜電荷對遷移率的影響可以在凝膠 中加入中加入( )。SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。 由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復合體在由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復合體在SDS的作用的作用 下會解聚成單條肽鏈下會解聚成單條肽鏈，因此測定

11、的結(jié)果只是因此測定的結(jié)果只是 ( )。SDS能與各種蛋白質(zhì)能與各種蛋白質(zhì) 形成蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)SDS復合物，復合物，SDS所帶所帶負電荷負電荷的的 量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因而因而 掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳 遷移率完全取決于遷移率完全取決于( )。 蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于 它所帶靜電荷的多少以及分子的大小等因素。它所帶靜電荷的多少以及分子的大小等因素。 SDS 單條肽鏈的分子量單條肽鏈的分子量 分子的大小分子的大小 分類：分類： 瓊脂糖凝膠電泳瓊

12、脂糖凝膠電泳和和聚丙稀酰胺凝膠電泳。聚丙稀酰胺凝膠電泳。 測定（測定（ ）通）通 常用十二烷基硫酸鈉（常用十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙稀聚丙稀 酰胺凝膠電泳酰胺凝膠電泳 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量 用用SDSSDS測定蛋白質(zhì)分子量的方法測定蛋白質(zhì)分子量的方法 電泳檢測結(jié)果電泳檢測結(jié)果 思考思考 人們用雞的紅細胞提取人們用雞的紅細胞提取DNA，用人，用人 的紅細胞提取血紅蛋白的原因是什么？的紅細胞提取血紅蛋白的原因是什么？ 雞的紅細胞具有細胞核，含有雞的紅細胞具有細胞核，含有DNA，便，便 于進行于進行DNA的提取，人的紅細胞無細胞的提取，人的紅細胞無細胞 核，結(jié)構(gòu)簡單，血紅蛋白含量豐

13、富便于核，結(jié)構(gòu)簡單，血紅蛋白含量豐富便于 提取血紅蛋白。提取血紅蛋白。 樣品處理樣品處理粗分離粗分離純化純化純度鑒定純度鑒定 蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步： 二二 實驗操作實驗操作 1.樣品樣品 血血 液液 血漿血漿 水分水分 固體物質(zhì)固體物質(zhì) 血漿蛋白血漿蛋白 無機鹽無機鹽 磷脂磷脂 葡萄糖等葡萄糖等 血細胞血細胞 白細胞白細胞 血小板血小板 紅細胞紅細胞 （最多）（最多） 血紅血紅 蛋白蛋白 （ ） 兩個兩個a a肽鏈肽鏈 兩個兩個一肽鏈肽鏈 共四條肽鏈共四條肽鏈90 n每條肽鏈環(huán)繞一個每條肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素亞鐵血紅素基團，可攜帶基團，可攜帶一一 分子

14、氧或一分子二氧化碳分子氧或一分子二氧化碳。血紅蛋白因含。血紅蛋白因含血紅血紅 素素而呈現(xiàn)紅色。而呈現(xiàn)紅色。 （一）樣品處理（一）樣品處理 n1、紅細胞的洗滌：、紅細胞的洗滌： n目的是去除雜蛋白。要加入檸檬酸鈉防止血液凝目的是去除雜蛋白。要加入檸檬酸鈉防止血液凝 固；離心將血液分層，用膠頭吸管吸出黃色血漿；固；離心將血液分層，用膠頭吸管吸出黃色血漿； 用生理鹽水洗滌。用生理鹽水洗滌。 n2、血紅蛋白的釋放：、血紅蛋白的釋放： n在蒸餾水和甲苯作用下，紅細胞破裂釋放在蒸餾水和甲苯作用下，紅細胞破裂釋放 n3、分離血紅蛋白溶液：、分離血紅蛋白溶液： n離心分層；濾紙過濾去除脂溶性沉淀層；分液漏離心

15、分層；濾紙過濾去除脂溶性沉淀層；分液漏 斗分出紅色透明液體。斗分出紅色透明液體。 n4、透析：、透析： 紅細胞的洗滌紅細胞的洗滌 分離血紅蛋白溶液分離血紅蛋白溶液 有機溶劑有機溶劑 無色透明的甲苯層無色透明的甲苯層 脂類物質(zhì)脂類物質(zhì) 白色薄層固體（脂溶性物質(zhì)沉淀層）白色薄層固體（脂溶性物質(zhì)沉淀層） 血紅蛋白溶液血紅蛋白溶液 紅色透明液體紅色透明液體 紅細胞破碎物沉淀紅細胞破碎物沉淀 暗紅色沉淀暗紅色沉淀 物物 （一）樣品處理（一）樣品處理 n1、紅細胞的洗滌：、紅細胞的洗滌： n目的是去除雜蛋白。要加入檸檬酸鈉防止血液凝目的是去除雜蛋白。要加入檸檬酸鈉防止血液凝 固；離心將血液分層，用膠頭吸管

16、吸出黃色血漿；固；離心將血液分層，用膠頭吸管吸出黃色血漿； 用生理鹽水洗滌。用生理鹽水洗滌。 n2、血紅蛋白的釋放：、血紅蛋白的釋放： n在蒸餾水和甲苯作用下，紅細胞破裂釋放在蒸餾水和甲苯作用下，紅細胞破裂釋放 n3、分離血紅蛋白溶液：、分離血紅蛋白溶液： n離心分層；濾紙過濾去除脂溶性沉淀層；分液漏離心分層；濾紙過濾去除脂溶性沉淀層；分液漏 斗分出紅色透明液體。斗分出紅色透明液體。 n4、透析：、透析： n裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中（裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中（PH為為7.0）透）透 析。析。 透析過程 視頻（3.38） （二）凝膠色譜操作（二）凝膠色譜操作 取長取長40厘米，內(nèi)徑厘米，

17、內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。兩端需用砂紙磨平。底塞的制作：底塞的制作： 打孔打孔挖出凹穴挖出凹穴安裝移液管頭部安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，目尼龍紗包好， 插到玻璃管的一端插到玻璃管的一端。：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮 塞的凹穴底面，否則難以鋪實尼龍網(wǎng)，還會導致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不塞的凹穴底面，否則難以鋪實尼龍網(wǎng)，還會導致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不 徹底。徹底。頂塞的制作：頂塞的制作：打孔打孔安裝玻璃管安裝玻璃管。組裝：組裝：將上述三者按相應(yīng)位將上述三者按相應(yīng)位 置組裝成一個整體置組裝成

18、一個整體。安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。 A、材料：、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。）。 B、代表意義：、代表意義：“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度 及分離范圍及分離范圍。75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹 時吸水時吸水7.5克。克。 配置凝膠懸浮液：配置凝膠懸浮液：計算并稱取一定計算并稱取一定 量的凝膠浸泡于蒸餾水中充分溶脹后，配成凝膠懸浮量的凝膠浸泡于蒸餾水中充分溶脹后，配成凝膠懸浮 液。液。 A、固定：、固定：將色譜柱裝置將色譜柱裝置 固定在支架上。固定在支架上。B、裝填：、裝填：將凝膠懸浮液一次性

19、的裝將凝膠懸浮液一次性的裝 填入色譜柱內(nèi)，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝 均勻。均勻。注意注意裝填凝膠柱時不得有氣泡存在：裝填凝膠柱時不得有氣泡存在：因為氣泡因為氣泡 會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。 視頻（2.14） 裝填完畢后，裝填完畢后， 立即用緩沖液洗脫瓶，在立即用緩沖液洗脫瓶，在 50cm高的操作壓下，用高的操作壓下，用 300ml的的20mmol/l的的磷酸磷酸 緩沖液（緩沖液（pH為為7.0）充分充分 洗滌平衡洗滌平衡12小時，使凝膠小時，使凝膠 裝填緊密裝填緊密。1、液、液

20、 面不要低于凝膠表面，否面不要低于凝膠表面，否 則可能有氣泡混入，影響則可能有氣泡混入，影響 液體在柱內(nèi)的流動與最終液體在柱內(nèi)的流動與最終 生物大分子物質(zhì)的分離效生物大分子物質(zhì)的分離效 果。果。2、不能發(fā)生洗脫液、不能發(fā)生洗脫液 流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn) 象象。 打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降 到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。 吸管吸吸管吸1ml1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品加到色譜柱的頂端，滴加 樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞 凝膠

21、面。凝膠面。 加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝 膠床內(nèi)，等樣品完全進入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。膠床內(nèi)，等樣品完全進入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。 小心加入小心加入pH=7.0 pH=7.0 的的20mmol/l20mmol/l的磷酸緩沖液到適當?shù)牧姿峋彌_液到適當 高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進行洗脫。高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進行洗脫。 待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集 流出液，每流出液，每5ml5ml收集一試管，連續(xù)收集。收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過程中，如（在分離過程中，如 果紅色區(qū)帶均勻

22、一致的移動，說明色譜柱制作成功）果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功） 正確的加樣操作：正確的加樣操作：1 1、不要觸及并破壞凝膠面。、不要觸及并破壞凝膠面。2 2、 使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。 視頻（6.30） （三）純度鑒定（三）純度鑒定 n使用最多的是使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝膠電聚丙烯酰胺凝膠電 泳。泳。 二、實驗操作二、實驗操作 n蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步： n（1）樣品處理：包括洗滌紅細胞；血紅蛋）樣品處理：包括洗滌紅細胞；血紅蛋 白的釋放；離心等操作收集血紅蛋白溶液。白的釋放；離心等操作收集血紅蛋白溶液。 n（2）粗分離：透析除去分子較小的雜質(zhì)。）粗分離：透析除去分子較小的雜質(zhì)。 n（3）純化：通過凝膠色譜法將分子量較大）純化：通過凝膠色譜法將分子量較大 的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去。的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去。 n（4）純度鑒定：通過）純度鑒定：通過SDS聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝 膠電泳鑒定。膠電泳鑒定。 視頻（2.14） 練習鞏固 1、隨著人類跨入蛋白質(zhì)組時代，對蛋、隨著人類跨入蛋白質(zhì)組時代，對蛋 白質(zhì)的研究和應(yīng)用越來越深入，首先要白質(zhì)的研究和應(yīng)用越來越深入，首先要 做的一步是做的一步是 A 弄清各種蛋白質(zhì)的空間結(jié)