基因工程第四章-工具酶課件

1、生物工程生物工程 Chapter Four Manipulative Enzymes 1基因工程第四章-工具酶 2021-7-2 2 Restriction Endonuclease Section one 2021-7-2 3 v 核酸酶：指通過切割相鄰的兩核酸酶：指通過切割相鄰的兩 個核苷酸之間的個核苷酸之間的35磷酸二酯磷酸二酯 鍵，而引發(fā)核酸分子發(fā)生水解鍵，而引發(fā)核酸分子發(fā)生水解 斷裂的酶。按水解斷裂核酸分斷裂的酶。按水解斷裂核酸分 子的方式不同，分為核酸內(nèi)切子的方式不同，分為核酸內(nèi)切 酶和外切酶。酶和外切酶。 v 核酸外切酶：從核酸分子的末核酸外切酶：從核酸分子的末 端開始，一個核苷

2、酸，一個核端開始，一個核苷酸，一個核 苷酸地消化降解多核苷酸的酶。苷酸地消化降解多核苷酸的酶。 v 核酸內(nèi)切酶：從核酸分子的內(nèi)核酸內(nèi)切酶：從核酸分子的內(nèi) 部，切割磷酸二酯鍵使之斷裂部，切割磷酸二酯鍵使之斷裂 并形成小分子片斷的酶。并形成小分子片斷的酶。 v 限制性內(nèi)切酶是核酸內(nèi)切酶的限制性內(nèi)切酶是核酸內(nèi)切酶的 一種。一種。 2021-7-2 4 The two different types of exonuclease It removes nucleotide from both strands of DNA It removes nucleotide only from the 3 te

3、rminus 2021-7-2 5 一、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)與種類：一、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)與種類： 1、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)：、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)： v 20世紀世紀60年代在研究細菌的限制和修飾現(xiàn)象時年代在研究細菌的限制和修飾現(xiàn)象時 被被Linn和和Arber發(fā)現(xiàn)，他們研究的是大腸桿菌。發(fā)現(xiàn)，他們研究的是大腸桿菌。 大腸桿菌細胞可以降解噬菌體的大腸桿菌細胞可以降解噬菌體的DNA入侵，也入侵，也 就是在生物體可識別外源就是在生物體可識別外源DNA，并將其降解，并將其降解， 而保護自身的而保護自身的DNA不被感染。不被感染。 W. Arber 2021-7-2 6 v 這就是在生物體內(nèi)普遍存在的限制

4、修飾現(xiàn)象。限制是這就是在生物體內(nèi)普遍存在的限制修飾現(xiàn)象。限制是 restriction,修飾修飾modification,所以書上把這一系統(tǒng)所以書上把這一系統(tǒng) 叫做：叫做：R/M體系。體系。 v 限制與修飾是由兩種酶引起的，一種是甲基轉(zhuǎn)移酶，一限制與修飾是由兩種酶引起的，一種是甲基轉(zhuǎn)移酶，一 種是核酸內(nèi)切酶。種是核酸內(nèi)切酶。 v 核酸有四個堿基，堿基排列有核酸有四個堿基，堿基排列有44個排列順序，內(nèi)切酶具個排列順序，內(nèi)切酶具 有識別位點，他的限制性體現(xiàn)在可以識別這些位點，并有識別位點，他的限制性體現(xiàn)在可以識別這些位點，并 進行切割，這樣外源的進行切割，這樣外源的DNA即使進入生物細胞，也可以即

5、使進入生物細胞，也可以 被降解，這就是限制被降解，這就是限制;修飾是由甲基化酶來完成的。在生修飾是由甲基化酶來完成的。在生 物內(nèi)部有甲基化酶，他們可以催化甲基從給體分子物內(nèi)部有甲基化酶，他們可以催化甲基從給體分子S酰酰 苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)移給可識別的序列（內(nèi)切酶），使之甲基苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)移給可識別的序列（內(nèi)切酶），使之甲基 化，這樣內(nèi)切酶無法識別甲基化的序列，就不能進行切化，這樣內(nèi)切酶無法識別甲基化的序列，就不能進行切 割，從而保全了自身的割，從而保全了自身的DNA。 2021-7-2 7 v限制與修飾存在兩方限制與修飾存在兩方 面的作用：一是保護面的作用：一是保護 自身的自身的DNA不受限制，不受限

6、制， 即不被切割；二是破即不被切割；二是破 壞外源壞外源DNA使之迅速使之迅速 降解。降解。 v如果沒有限制修飾，如果沒有限制修飾， DNA、基因到處都是，、基因到處都是， 順利進入任何生物順利進入任何生物,改改 變遺傳物質(zhì)，發(fā)生變變遺傳物質(zhì)，發(fā)生變 異。異。 2021-7-2 8 2. 限制性內(nèi)切酶的種類：限制性內(nèi)切酶的種類： v 有三種不同類型：有三種不同類型：型、型、型、型、型型 型、型、型在同一蛋白分子中兼有內(nèi)切和甲基化活性并且其依賴型在同一蛋白分子中兼有內(nèi)切和甲基化活性并且其依賴ATP， 作用時吸收能量。作用時吸收能量。 2021-7-2 9 v 型：其內(nèi)切酶活性和甲基化活性是分開的

7、，型：其內(nèi)切酶活性和甲基化活性是分開的， 只負責限制，因此叫限制性內(nèi)切酶。修飾由獨只負責限制，因此叫限制性內(nèi)切酶。修飾由獨 立的甲基酶完成。立的甲基酶完成。 而且核酸內(nèi)切作用具有序而且核酸內(nèi)切作用具有序 列的特異性，可識別回文序列，列的特異性，可識別回文序列，AGCT-，便，便 于操作，廣泛應(yīng)用。于操作，廣泛應(yīng)用。 v 特點：特點： 識別識別特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列，其長度為，其長度為4-6個堿基，甚至個堿基，甚至8個，個， 少數(shù)酶識別更長的序列。特定的序列：又叫識別序列或少數(shù)酶識別更長的序列。特定的序列：又叫識別序列或 識別位點。這些序列的一個共同特點是具有雙重螺旋對識別位點。這些序

8、列的一個共同特點是具有雙重螺旋對 稱的結(jié)構(gòu)形式，可以進行稱的結(jié)構(gòu)形式，可以進行180度的旋轉(zhuǎn)，呈回文結(jié)構(gòu)。度的旋轉(zhuǎn)，呈回文結(jié)構(gòu)。 2021-7-2 10 限制性內(nèi)切酶在識別序列后，對雙鏈限制性內(nèi)切酶在識別序列后，對雙鏈DNA進行切割，雙進行切割，雙 鏈鍛裂后，形成特定的酶切末端，叫鏈鍛裂后，形成特定的酶切末端，叫“粘性末端粘性末端”。粘。粘 性末端有三種形式：性末端有三種形式： 5”突出粘端：突出粘端：EcoRI切點切點 5-G AATTC-3 3-CTTAA G-5 3”突出粘端突出粘端：PstI切割位點切割位點 5-CTGCA G -3 3-G ACGTC -5 2021-7-2 11 平

9、端：平端： SmaI 切割位點切割位點 5-CCC GGG -3 3-GGG CCC-5 2021-7-2 12 二、限制性片斷末端的連接作用二、限制性片斷末端的連接作用: vDNA片斷經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后，可自然的重片斷經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后，可自然的重 新連接起來，或環(huán)化起來；新連接起來，或環(huán)化起來； 不同不同DNA片斷通過互不的粘性末端之間的堿基配對片斷通過互不的粘性末端之間的堿基配對 而彼此相連接，稱之為分子間連接。而彼此相連接，稱之為分子間連接。 同一同一DNA片斷通過互不的粘性末端的堿基配對連接片斷通過互不的粘性末端的堿基配對連接 成環(huán)狀形分子，成環(huán)狀形分子， 稱為分子內(nèi)連接。稱為分

10、子內(nèi)連接。 v對重新連接的對重新連接的DNA片斷經(jīng)加熱處理后，會重新片斷經(jīng)加熱處理后，會重新 線性化；線性化； v如果對連接或環(huán)化的分子用連接酶處理，形成的如果對連接或環(huán)化的分子用連接酶處理，形成的 DNA分子就是永久性的。分子就是永久性的。 2021-7-2 13 v限制性內(nèi)切酶識別的靶序列同限制性內(nèi)切酶識別的靶序列同DNA的來源無關(guān)，的來源無關(guān)， 也就是說不帶有種的特異性，對各種也就是說不帶有種的特異性，對各種DNA都普都普 遍適用。無論那種生物的遍適用。無論那種生物的DNA經(jīng)同一種酶作用經(jīng)同一種酶作用 切割后，形成的片斷都能連接再一起，來實現(xiàn)切割后，形成的片斷都能連接再一起，來實現(xiàn) DN

11、A重組。重組。 2021-7-2 14 三、限制性內(nèi)切酶的命名三、限制性內(nèi)切酶的命名: v1973年，年，Smith和和 Nathans提出了一個較系提出了一個較系 統(tǒng)的命名原則：統(tǒng)的命名原則： Hin d III Haemphilus influenzae 嗜血流桿菌嗜血流桿菌 D菌株菌株 第三個酶第三個酶 Eco R I Escherichi a coli 大腸桿菌大腸桿菌 R菌株菌株 第一個酶第一個酶 2021-7-2 15 四、影響酶活性的因素：四、影響酶活性的因素： 1、靶、靶DNA的純度：內(nèi)切酶的消化底物的速率很大的純度：內(nèi)切酶的消化底物的速率很大 程度上取決于使用的程度上取決于使

12、用的DNA樣品本身的純度。通樣品本身的純度。通 常我們從生物樣品中提取出的常我們從生物樣品中提取出的DNA容液中，含容液中，含 有許多物質(zhì)，如蛋白質(zhì)，多糖，酚、氯仿，酒精、有許多物質(zhì)，如蛋白質(zhì)，多糖，酚、氯仿，酒精、 乙二胺四乙酸（乙二胺四乙酸（EDTA）,SDS（十二烷基磺酸（十二烷基磺酸 納），高濃度的鹽離子。這些都是酶活性的鈍化納），高濃度的鹽離子。這些都是酶活性的鈍化 劑。酚的影響最大，他可以使蛋白質(zhì)變性，使酶劑。酚的影響最大，他可以使蛋白質(zhì)變性，使酶 失活。失活。 2021-7-2 16 v消除辦法：消除辦法： 盡量保證盡量保證DNA純度達到最大。酚抽提去蛋白；醇抽提純度達到最大。酚

13、抽提去蛋白；醇抽提 （氯仿、異戊醇的抽提）去酚，去多糖；乙醇抽提去多（氯仿、異戊醇的抽提）去酚，去多糖；乙醇抽提去多 元醇；沉淀（蛋白也沉，但元醇；沉淀（蛋白也沉，但DNA和蛋白能看的出來）；和蛋白能看的出來）； 干燥去乙醇。干燥去乙醇。 增加酶的用量，平均每增加酶的用量，平均每ug底物底物DNA的用量可達的用量可達10個單個單 位或更多。但有一個問題：商品化的酶均加入位或更多。但有一個問題：商品化的酶均加入50的甘的甘 油作為保護劑，在油作為保護劑，在20度保藏不會結(jié)凍。如果加入酶量度保藏不會結(jié)凍。如果加入酶量 過大，甘油濃度過高，會抑制酶活性。過大，甘油濃度過高，會抑制酶活性。 擴大酶切反

14、映的擴大酶切反映的(體積體積)體系體系,使?jié)撛诘囊种埔蛩乇幌鄳?yīng)的使?jié)撛诘囊种埔蛩乇幌鄳?yīng)的 稀釋。稀釋。 延長酶反映時間?？汕醒娱L酶反映時間?？汕?4小時。小時。 2021-7-2 17 2、DNA的甲基化程度：的甲基化程度： 核酸內(nèi)切酶是原核生物限制修飾的組成部分，因核酸內(nèi)切酶是原核生物限制修飾的組成部分，因 此，識別序列中特定核苷酸的甲基化作用，會強此，識別序列中特定核苷酸的甲基化作用，會強 烈的影響酶的活性，造成烈的影響酶的活性，造成DNA只能被局部消化。只能被局部消化。 為了避免這種問題，在基因克隆中使用的是失去為了避免這種問題，在基因克隆中使用的是失去 甲基化酶的大腸桿菌菌株來制備質(zhì)粒

15、甲基化酶的大腸桿菌菌株來制備質(zhì)粒DNA。 2021-7-2 18 3、酶切溫度：、酶切溫度： vDNA消化反應(yīng)的溫度是影響核酸內(nèi)切酶活性的消化反應(yīng)的溫度是影響核酸內(nèi)切酶活性的 另一個重要的因素。另一個重要的因素。 v不同內(nèi)切酶具有不同的最適反應(yīng)溫度，大多數(shù)酶不同內(nèi)切酶具有不同的最適反應(yīng)溫度，大多數(shù)酶 的反映溫度在的反映溫度在37，消化時溫度低于或高于最，消化時溫度低于或高于最 適溫度，都會影響酶的活性，比如溫度低切割時適溫度，都會影響酶的活性，比如溫度低切割時 之產(chǎn)生切口，而不能切斷之產(chǎn)生切口，而不能切斷DNA。 2021-7-2 19 4. DNA的分子結(jié)構(gòu)：的分子結(jié)構(gòu)： vDNA分子的結(jié)構(gòu)

16、有很多種，以質(zhì)粒分子的結(jié)構(gòu)有很多種，以質(zhì)粒DNA為例，為例， 他有三種存在方式，超螺旋、環(huán)狀帶切刻、線性。他有三種存在方式，超螺旋、環(huán)狀帶切刻、線性。 v往往切割超螺旋時用的酶量要比消化線性往往切割超螺旋時用的酶量要比消化線性DNA 的量高出許多倍，甚至的量高出許多倍，甚至20倍。倍。 2021-7-2 20 5、內(nèi)切酶對不同部位的切割位點，其切割效率有、內(nèi)切酶對不同部位的切割位點，其切割效率有 著明顯的差別。這主要是由于切割位點的側(cè)翼序著明顯的差別。這主要是由于切割位點的側(cè)翼序 列存在著差異的結(jié)果（通常切割效率的差異不會列存在著差異的結(jié)果（通常切割效率的差異不會 超過超過10倍）。倍）。 2

17、021-7-2 21 6、內(nèi)切酶的緩沖液：不同的酶使用不同的類型、內(nèi)切酶的緩沖液：不同的酶使用不同的類型 vBuffer 鹽：鹽：Mgcl,Nacl,Kcl提供離子環(huán)境。酶的活性提供離子環(huán)境。酶的活性 需要需要2價陽離子，價陽離子，“Mg”是最普遍的酶激活劑。是最普遍的酶激活劑。 Tris-Hcl:緩沖液，他可以創(chuàng)造出緩沖液，他可以創(chuàng)造出pH是是7.4的緩的緩 沖環(huán)境，保護酶分子，維持體系沖環(huán)境，保護酶分子，維持體系pH恒定。恒定。 巰基乙醇或二硫蘇糖醇（巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）: 巰基試劑巰基試劑 對于保護某些核酸限制性內(nèi)切酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性起對于保護某些核酸限制性內(nèi)切酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性起 著

18、很大作用，防止其失活變性。有效防止二硫鍵著很大作用，防止其失活變性。有效防止二硫鍵 形成。形成。 BSA：牛血清白蛋白，酶的穩(wěn)定性。：牛血清白蛋白，酶的穩(wěn)定性。 2021-7-2 22 7.非適宜環(huán)境包括：非適宜環(huán)境包括： v非適宜環(huán)境包括：高濃度的內(nèi)切酶（酶專一性變非適宜環(huán)境包括：高濃度的內(nèi)切酶（酶專一性變 化，產(chǎn)生無度切割，一個位點本來不能切割，但化，產(chǎn)生無度切割，一個位點本來不能切割，但 切割了，又叫切割了，又叫Star活性變化），高濃度的甘油，活性變化），高濃度的甘油， 低離子強度，低離子強度，Mg被被Mn取代，高取代，高pH。 8、酶切時間：通常酶切時間、酶切時間：通常酶切時間12小

19、時，但大多數(shù)小時，但大多數(shù) 酶的活性可維持很長時間，我們可以酶切過夜。酶的活性可維持很長時間，我們可以酶切過夜。 2021-7-2 23 五、雙酶切：五、雙酶切： v沒有不同的沒有不同的buffer :A /B/ H/ M/ K.注意選注意選 擇兩個酶通用的緩沖液擇兩個酶通用的緩沖液 2021-7-2 24 Ligases Section two 2021-7-2 25 DNA連接酶：連接酶： v DNA被限制性內(nèi)切酶消化后，單憑粘性末端是被限制性內(nèi)切酶消化后，單憑粘性末端是 不能彼此牢固的連接在一起的，需要進行連接不能彼此牢固的連接在一起的，需要進行連接 處理，這樣我們用到了處理，這樣我們用

20、到了DNA連接酶。連接酶。 1. 概念：能夠催化在概念：能夠催化在2條條DNA 鏈之間形成磷酸二鏈之間形成磷酸二 脂鍵的酶。條件是需要一條鏈的脂鍵的酶。條件是需要一條鏈的3末端具有一個末端具有一個 游離的羥基（游離的羥基（OH）,在另一條鏈的在另一條鏈的5端具有一端具有一 個磷酸基團（個磷酸基團（P），另外由于形成二脂鍵是一），另外由于形成二脂鍵是一 種吸能反映所以反應(yīng)中要有種吸能反映所以反應(yīng)中要有ATP（動物）和（動物）和 NAD（原核生物，氧化型）作為能源。（原核生物，氧化型）作為能源。 2021-7-2 26 2. 特性：特性： v DNA連接酶不能連接兩條單連接酶不能連接兩條單 鏈鏈D

21、NA分子或環(huán)化的單鏈分子或環(huán)化的單鏈 DNA分子，被連接的必須是分子，被連接的必須是 雙螺旋雙螺旋DNA的一部分。連接的一部分。連接 酶的來源有兩種，一種是大酶的來源有兩種，一種是大 腸桿菌染色體編碼的腸桿菌染色體編碼的DNA連連 接酶；另一種是大腸桿菌接酶；另一種是大腸桿菌T4 噬菌編碼的叫噬菌編碼的叫T4連接酶，這連接酶，這 種酶容易制備，直接從感染種酶容易制備，直接從感染 T4大腸桿菌的菌體中分離純大腸桿菌的菌體中分離純 化，而且他可以連接兩條平化，而且他可以連接兩條平 末端的末端的DNA片斷片斷 2021-7-2 27 v DNA連接酶只能連接連接酶只能連接DNA雙螺旋骨架上的切刻，而

22、不能雙螺旋骨架上的切刻，而不能 連接封閉缺口。連接封閉缺口。 v 反應(yīng)溫度：連接酶的最適反映溫度是反應(yīng)溫度：連接酶的最適反映溫度是37，但我們不能，但我們不能 采用這個溫度采用這個溫度？ 比如由內(nèi)切酶比如由內(nèi)切酶EcoRI 產(chǎn)生的粘性末端是產(chǎn)生的粘性末端是TTAA- ， 末端搭連后，作用力是由末端搭連后，作用力是由4個個A-T堿基對維持，堿基對維持，37度下，度下， 他們的作用并不牢靠。但溫度低末端連接慢。他們的作用并不牢靠。但溫度低末端連接慢。 我們在實驗室操作中往往采用我們在實驗室操作中往往采用415比較合適，這比較合適，這 個溫度是介于酶的作用速率和末端結(jié)合速率之間，一般個溫度是介于酶的

23、作用速率和末端結(jié)合速率之間，一般 認為認為4連接反應(yīng)進行較慢。連接反應(yīng)可以是連接反應(yīng)進行較慢。連接反應(yīng)可以是4連接連接24 小時，或小時，或15過夜（注意參照說明書）。過夜（注意參照說明書）。 2021-7-2 28 vDNA連接酶用法與用量：連接酶用法與用量： 平末端平末端DNA分子的連接最適反應(yīng)的酶量為分子的連接最適反應(yīng)的酶量為12 個單位，個單位， 粘末端的連接，酶量為粘末端的連接，酶量為0.1個單位較好。個單位較好。 2021-7-2 29 polymerase Section three 2021-7-2 30 vDNA聚合酶聚合酶 vDNA聚合酶聚合酶I Klenow大片段大片段 vT4 DNA聚合酶聚合酶 v反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶 vTaq酶酶 共同點：以一條共同點：以一條DNA（RNA）為模板，通）為模板，通 過聚合作用能夠把脫氧核糖核酸連續(xù)的加過聚合作用能夠把脫氧核糖核酸連續(xù)的加 到引物鏈的到引物鏈的3OH末端。末端。 2021-7-2 31 一、一、DNA聚合酶聚合酶I v大腸桿菌的大腸桿菌的DNA聚合酶聚合酶I是一條約是一條約1000個個aa 的多肽鏈的多肽鏈 形成的單亞基蛋白，分子量形成的單亞基蛋白，分子量109x103Da. 1. 三種活性：三種活性： 聚合活性