1.6二磷酸果糖對大鼠腦缺血再灌損傷后凋亡細(xì)胞及REF1.P38的研究

1、文章來源 畢業(yè)論文網(wǎng) 1.6二磷酸果糖對大鼠腦缺血再灌損傷后凋亡細(xì)胞及ref-1.p38的研究文章來源 畢業(yè)論文網(wǎng) 畢業(yè)論文 【摘要】目的 探討1、62磷酸果糖（fdp）對大鼠腦缺血/再灌注（i/r）損傷的作用及其機(jī)制。方法 雄性sd大鼠90只，隨機(jī)分為3組：假手術(shù)對照組（c組）、腦缺血組（i組）、果糖組（f組），每組30只。i組和f組大鼠在凝斷雙側(cè)推動脈24小時后夾閉雙側(cè)頸總動脈5分鐘后重新開放，制作全腦缺血模型，c組只暴露不凝斷錐動脈和不夾閉頸總動脈，f組再灌注開始時靜脈注射1、6-2磷酸果糖1.5ml/kg，i組及c組分別靜脈注射生理鹽水1.5ml/kg。各組在再灌注后2h、6h、12h

2、、24h、48h、72h時取標(biāo)本，測定血sod、mda含量，并制備腦組織病理切片，采用免疫組織化學(xué)染色方法及tunel細(xì)胞原位凋亡檢測法測定p38蛋白和ref-1蛋白的表達(dá)和凋亡細(xì)胞數(shù)目。結(jié)果 與c組的比較，i組在再灌注后各時點(diǎn)sod活性明顯降低，mda含量明顯升高（p<0.05），f組變化不明顯，但較i組比較均有顯著差異（p<0.05）；與c組比較，i組凋亡細(xì)胞顯著增多（p<0.05）；免疫組化染色顯示：與c組比較，i組在再灌注后各時點(diǎn)p38、ref-1表達(dá)均顯著增強(qiáng)（p<0.05），f組較c組表達(dá)增強(qiáng)但較i組表達(dá)顯著減弱（p<0.05）。結(jié)論 1、6-2磷酸果

3、糖對全腦i/r損傷有保護(hù)作用，其機(jī)理可能與其參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)減弱p38、ref-1蛋白表達(dá)強(qiáng)度有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 1、6-2磷酸果糖；腦；缺血/再灌注損傷 the protective effects of fdpagainst ischemia reperfusion injury in rat brains xue li, cai ying min xue rongliang anesthetic department, the second hospital of xian jiao tong university 710004 china abstract objective to o

4、bserve the protective effects of fdp on ischemia reperfusion in rat brains and study its mechanism. method healthy 90 rats were randomly divided into 3 groups: sham (group c), is-rs(group i), fdp(group f). 30 in one group. the rats two carotis were closed after two vertebralis were cut for 24h and o

5、pened for 5 minutes in group i and f, the global cerebral ischemia reperfusion model of rats were made. the rats vertebralis werent cat and carotis communis werent closed, fdp 1.5ml/kg was injected into veins when is-re began, sodium chloride 1.5ml/kg was injecteo into veins in group i and group c.

6、the samples were picked up at the points of 2h, 6h, 12h, 24h, 48h, 72h after reperfusion, sod and mda were measured with immunohistochemical methods, the expression of p38 and ref-1 and numbers of apoptosis cells were measured with tunel. result: compared with group c, the activity of sod at each po

7、int decreased mda increased obviously(p<0.05) after reperfusion in guoup i. the change in group f wasnt obviously, but compared with group i, there was great difference (p<0.05), immunohistochemical method showed: compared with group c, the expression of p38、ref-1 increased after reperfusion i

8、n group i (p<0.05), the expression increased in group f compared with c, but decreased compared with group i (p<0.05), conclusion: fdp has pretective effects on global ischemia reperfusion jnjury in rats. the mechanism of which might be its decreasing the expression of p38、ref-1 by participati

9、ng in cell signal transduction. key words fdp; brain; i/r 1、6-2磷酸果糖是細(xì)胞代謝賦活劑，可維持細(xì)胞正常極化狀態(tài)，增加無氧代謝時atp含量，通過提供離子泵能量，阻止ca2+內(nèi)流，防止活性氧族產(chǎn)生以及維持細(xì)胞內(nèi)ca2+和na+正常范圍。大量文獻(xiàn)報道，其對心肌缺血有明確保護(hù)作用，但對腦缺血損傷是否有保護(hù)作用以及其作機(jī)理尚無定論。近年研究表明，mapk信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與腦缺血再灌注損傷，p38、ref-1是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的兩個蛋白，其表達(dá)的改變能間接反映腦缺血再灌注損傷的程度，故本研究擬觀察1、6-2磷酸果糖對大鼠腦缺血再灌注損傷過氧化物歧

10、化酶活性（sod）、丙2醛（mda）含量及凋亡細(xì)胞數(shù)目、p38蛋白、氧還因子-1（ref-1）表達(dá)的影響，旨在探討1、6-2磷酸果糖對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。 材料與方法 90只雄性sd大鼠，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供，體重275325g，隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組（c組）、缺血組（i組）、1、6-2磷酸果糖組（f組），每組30只，每組又分6個時點(diǎn)，每個時點(diǎn)隨機(jī)取5只大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 i組和f組大鼠凝斷雙側(cè)椎動脈24h后，夾閉雙側(cè)頸總動脈5min后重新開放，用4血管法（4-vo）1制備全腦i/r損傷模型。c組只解剖暴露雙側(cè)椎動脈及頸總動脈。大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉40mg/kg，再

11、灌注開始f組經(jīng)舌下靜脈注射1、6-2磷酸果糖1.5mg/kg（h20040307，浙江浙北藥業(yè)有限公司），c、i組注射生理鹽水1.5ml/kg。密切觀察生命體征，觀察瞳孔有無變化，呼吸有無增快及神經(jīng)功能有無異常。瞳孔無變化者予以剔除。 再灌注2、6、12、24、48、72h，1部分取新鮮腦組織檢測sod、mda，1部分以4%多聚甲醛200ml心臟灌注處死，取出完整大腦，固定于4%多聚甲醛中，制備石蠟切片，用于he染色、凋亡細(xì)胞檢測和免疫組化染色。免疫組化采用sp法，p38、ref-1試劑盒均購于美國santa gruz公司，sp試劑盒購于福州邁新生物工程公司，tunel凋亡試劑盒購于美國onc

12、ogene公司。陽性細(xì)胞為棕黃色。 腦組織切片中顯示細(xì)胞漿或細(xì)胞核有明顯的黃色、棕褐色顆?；虬咂瑺顬閜38和ref-1蛋白陽性。采用德國leica-q550e高清晰度彩色圖文分析計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對陽性結(jié)果進(jìn)行半定量測定其灰度值。 再灌注損傷后1h、2h、6h、12h、24h、48h，用4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注固定，斷頭取腦，制備石蠟切片，he染色觀察細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)變化。正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰可見，細(xì)胞核為蘭色，核膜完整，核仁明顯。 原位末端標(biāo)記細(xì)胞凋亡試劑盒由美國oncogene試劑公司提供。標(biāo)本切片常規(guī)脫蠟至水，dab顯色、酒精脫水、2甲苯透明、中性樹膠封片。顯微鏡下細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，即凋

13、亡細(xì)胞。定量分析方法為：切片中免疫組化顯色陽性細(xì)胞定量采用顯微鏡計(jì)數(shù)法（10目鏡40物鏡），每只動物隨機(jī)兩張切片，每張切片隨機(jī)觀察5個視野。 計(jì)量資料以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（ s）表示，采用spss11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，組間比較采用單因素方差分析，p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié) 果 腦組織sod含量的變化，與c組比較，i組在再灌注各時點(diǎn)均降低（p<0.05），f組在各時點(diǎn)較i組明顯升高（p<0.05）。mda含量的變化，與c組比較，i組再灌注各時點(diǎn)均升高。見表1。 表1 3組大鼠再灌注各時點(diǎn)腦組織sod和mda含量的比較 （ n=5, s， umgprot-1） 指標(biāo) 組別

14、2h 6h 12h 24h 48h 72h sod c組 86.25.8* 86.25.7* 87.24.0* 88.06.3* 86.95.5* 87.07.2* i組 70.310.3 38.92.7 58.113.1 66.313.0 71.910.6 70.88.3 f組 85.55.5* 79.37.5* 74.98.2* 76.34.4* 82.99.8* 73.210.6* mda c組 5.30.9* 5.30.8* 5.40.7* 5.40.9* 5.30.8* 5.40.7* i組 10.11.2 7.11.5 12.91.7 13.83.6 6.01.1 5.92.0 f

15、組 8.71.9* 6.91.1 10.41.2* 8.51.8* 5.41.4* 5.51.3 與c組比較p<0.05 p<0.01 與i組比較，* p<0.05 * p<0.01 腦病理學(xué)改變he染色顯示：c組細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰完整；i組細(xì)胞排列紊亂，間質(zhì)水腫，神經(jīng)元數(shù)目減少，核膜界限不清，結(jié)構(gòu)模糊；f組僅少數(shù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞。 腦p38和ref-1蛋白表達(dá)的變化：p38、ref-1表達(dá)陽性細(xì)胞在胞漿及胞核著色，呈棕黃色顆粒，其灰度值見表2，i組及f組較c組表達(dá)增強(qiáng)，但f組較i組明顯減弱 。 表2 3組大鼠再灌注不同時點(diǎn)p38和ref-1表達(dá)的灰度變化（n=5， s） 指標(biāo)

16、組別 2h 6h 12h 24h 48h 72h p38 c組 197.37.4* 203.211.0* 205.58.9* 204.512.7* 200.910.5* 198.16.4* i組 142.521.8 110.48.7 99.92.8 105.06.8 114.310.6 126.09.5 f組 173.915.8* 143.28.2* 108.27.9* 127.42.7* 139.15.5* 155.44.0 * ref-1 c組 176.94.1* 177.44.1* 182.55.1* 190.59.1* 179.72.5* 175.03.6* i組 150.51.8 1

17、31.02.4 106.34.0 117.62.7 126.62.8 140.43.7 f組 159.22.8* 146.24.0* 116.24.8* 130.86.2* 132.67.5* 151.03.9* 與c組比較p<0.05 p<0.01; 與i組比較* p<0.05, * p<0.01 凋亡細(xì)胞數(shù)目變化：再灌注后2h即可見凋亡細(xì)胞，各時間點(diǎn)，f組較i組明顯減少，見表3。 表3 大鼠腦缺血再灌注損傷各組凋亡細(xì)胞數(shù)的變化（n=5, s） 組別 2h 6h 12h 24h 48h 72h i組 26.01.5 48.21.4 53.42.4 53.61.8 48

18、.21.3 33.22.3 f組 21.62.0 34.21.3 44.82.3 36.42.5 32.21.3 21.82.1 與i組比較p<0.05 p<0.01 討 論 全腦缺血再灌注損傷是多種病理生理機(jī)制共同作用的結(jié)果，但其具體機(jī)制尚不明確，腦缺血可導(dǎo)致1系列的功能和代謝紊亂，而再灌注可引起更加嚴(yán)重的腦組織損傷，即再灌注損傷或遲發(fā)性神經(jīng)元損傷2。最新研究表明，腦i/r損傷引起的細(xì)胞死亡還有另1種重要形式細(xì)胞凋亡，腦缺血后促凋亡基因和抗凋亡3基因表達(dá)會發(fā)生改變3，4。 p38和ref-1是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的兩個蛋白，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖與死亡，參與細(xì)胞凋亡的發(fā)生5，但其

19、具體機(jī)制尚不明確。有研究認(rèn)為腦缺血時可能存在由鈣離子介導(dǎo)的興奮性氨基酸（eaa）與活性氧分子（ros）的惡性循環(huán)，ros可激活p38mapk通路參與靶細(xì)胞的損傷。 本研究發(fā)現(xiàn)，腦i/r損傷時p38過度表達(dá)，參與細(xì)胞凋亡的發(fā)生，fdp則可通過減低p38的表達(dá)，起到腦保護(hù)作用，ref-1蛋白是維持轉(zhuǎn)錄因子還原態(tài)的細(xì)胞氧還調(diào)節(jié)因子，參與細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、分化、神經(jīng)元興奮生理過程，可倍增p53的轉(zhuǎn)錄激活功能，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時還可調(diào)控ckii激酶導(dǎo)致的磷酸化修飾。與凋亡負(fù)相關(guān)6，7。本研究結(jié)果表明，全腦i/r損傷時，其過度表達(dá)參與了細(xì)胞凋亡，fdp可通過減弱其表達(dá)保護(hù)受損神經(jīng)細(xì)胞。 fdp保護(hù)作用的

20、機(jī)制可能與其增加糖酵解減緩atp的耗竭，激活磷酸戊糖旁路，防止活性氧族產(chǎn)生，維持細(xì)胞內(nèi)ca2+、na+正常范圍，防止腦細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷而改善腦功能。 綜上所述，fdp可阻止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，提高sod活性，減少mda含量，同時參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，減弱p38及ref-1蛋白的表達(dá)，從而產(chǎn)生腦保護(hù)作用，但是其確切機(jī)制尚待進(jìn)1步研究。 參考文獻(xiàn) 1 dulsinelli w, brierly j b. a new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat. strodk. 10; 267,1979 2 small dl, morley p, bachan am. biology of ischemic arebral cell death. prog cardiovosc dis, 1999, 42(3):185-207. 3 babu pp, yoshida y, su m, et al. immunohistochemical expression of bcl-2, bax and cytochrome c following focal cerebral ischemia and effect of hypothermia in rat neurosci lett. 2000,291:19