糞菌移植對(duì)炎癥性腸病大鼠血清tnfα、il8的影響課件

1、糞菌移植對(duì)炎癥性腸病大鼠糞菌移植對(duì)炎癥性腸病大鼠 血清血清TNF-TNF-、IL8IL8的影響的影響 專專 業(yè)：普通外科業(yè)：普通外科 糞菌移植對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎糞菌移植對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎 大鼠血清大鼠血清TNF-TNF-、IL8IL8的影響的影響 潰瘍性結(jié)腸炎潰瘍性結(jié)腸炎(UC)(UC)是一種病因和患病機(jī)制還 未完全闡明，可能與微生態(tài)環(huán)境、黏膜的免疫應(yīng) 答、應(yīng)激、遺傳等因素有關(guān)的慢性腸道炎癥性疾 病，病變主要局限于結(jié)直腸粘膜及粘膜下層，可 累及整個(gè)結(jié)腸甚至末端回腸。目前研究發(fā)現(xiàn)，與 健康人相比，UC患者腸道中微生物的多樣性減少 約1/4，擬桿菌門與厚壁菌門在總菌群中所占比 例明顯減少，而放線菌門與變形

2、菌門的比例明顯 增加。腸道菌群是機(jī)體一個(gè)特殊器官，其調(diào)節(jié)機(jī) 體免疫、調(diào)控炎癥、參與物質(zhì)代謝等方面發(fā)揮重 要作用。 糞菌移植糞菌移植（fecal microbiota fecal microbiota transplantationtransplantation，F(xiàn)MTFMT），），是將健康人糞便中 的功能菌群移植到菌群分布異常的患者胃腸道 內(nèi)，重建其健康的菌群分布結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)腸道及 腸道外疾病恢復(fù)的一種治療方式?，F(xiàn)階段，F(xiàn)MT 研究大部分是關(guān)于FMT治療復(fù)發(fā)性難辨梭狀芽孢 桿菌感染（CDI）和炎癥性腸?。↖BD）的個(gè)案 或系列病例報(bào)道,但FMT導(dǎo)致患者腸道菌群具體 發(fā)生何種有益變化及其潛在的機(jī)制

3、仍不完全清 楚，但有待進(jìn)一步研究。對(duì)常規(guī)治療失敗或有 手術(shù)禁忌證的UC病人，F(xiàn)MT或許是不錯(cuò)的選擇。 腸道菌群的生理作用腸道菌群的生理作用 1.防御病原體的侵犯 2.物質(zhì)代謝作用 3.生長(zhǎng)與衰老 4.合成維生素 5.腸道的生物、免疫屏障作用 傳統(tǒng)的升階治療方案?jìng)鹘y(tǒng)的升階治療方案，序貫地應(yīng)用5-氨基水楊酸、糖皮 質(zhì)激素與免疫抑制劑，無疑最為安全易行、經(jīng)濟(jì)實(shí)用；然 而無限期地等待療效，可能錯(cuò)失治療良機(jī)，延誤緩解時(shí)間 ，使約50患者仍處于活動(dòng)狀態(tài)，導(dǎo)致失用或致殘的并發(fā) 癥，其療效費(fèi)用比反而降低。隨著新藥問世后治療經(jīng)驗(yàn)的 積累，專家們提出早期、強(qiáng)力治療，即降階治療方案降階治療方案。 這種看似昂貴、危險(xiǎn)

4、，實(shí)則經(jīng)濟(jì)、高效的治療方法已使相 當(dāng)多的IBD患者獲益，但降階治療藥物昂貴，又有一定風(fēng)險(xiǎn) ，如嚴(yán)重感染、藥物反應(yīng)等，對(duì)非選擇性病例也存在過度 治療之嫌，而且停藥或減藥后病情仍會(huì)發(fā)復(fù)發(fā)作，并表現(xiàn) 出一定的激素依賴性。對(duì)常規(guī)治療失敗或有手術(shù)禁忌證的 UC病人，F(xiàn)MT或許是不錯(cuò)的選擇。 目前目前FMTFMT應(yīng)用應(yīng)用最為廣泛的是治療復(fù)發(fā)性難治性難辨梭狀芽 胞桿菌感染(CDI)腸炎，其短期緩解率可達(dá)90以上。FMT 也在其他多種疾病中被用于試驗(yàn)性治療，都取得了良好的 效果，如IBD、IBS、肥胖、代謝綜合征、糖尿病等。還有 FMT被成功運(yùn)用于系統(tǒng)性硬化病、帕金森病、慢性疲勞綜 合征和特發(fā)性血小板減少性紫

5、癜等的個(gè)案報(bào)道。 1 1 3 3 2 2 4 4 1 潰瘍性潰瘍性性結(jié)腸炎大鼠模型建模成功評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)性結(jié)腸炎大鼠模型建模成功評(píng)判標(biāo)準(zhǔn) 研研究?jī)?nèi)內(nèi)容 擬擬解決決的關(guān)關(guān) 鍵問題鍵問題 1 2 3 研究目標(biāo)研究目標(biāo) l糞菌移植對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清糞菌移植對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清TNF-TNF-、 IL-8IL-8的影響的影響 l實(shí)驗(yàn)分組、建實(shí)驗(yàn)分組、建立潰瘍性結(jié)腸炎的大鼠模型立潰瘍性結(jié)腸炎的大鼠模型 l糞菌液的制備糞菌液的制備 l指標(biāo)檢測(cè)、指標(biāo)檢測(cè)、 Chiu Chiu氏氏6 6級(jí)評(píng)分法評(píng)估損傷程度級(jí)評(píng)分法評(píng)估損傷程度 （1 1）分組情況）分組情況 （2 2）模型建立）模型建立 （3 3）糞菌液的制備

6、）糞菌液的制備 （4 4）指標(biāo)檢測(cè)）指標(biāo)檢測(cè) （5 5） ChiuChiu氏氏6 6級(jí)評(píng)分法評(píng)估損傷程度級(jí)評(píng)分法評(píng)估損傷程度 （6 6）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 2 2 2.12.1分組情況分組情況 健康SD大鼠54只，雌雄各半，體重200-250g，由 山西醫(yī)科大學(xué)生理實(shí)驗(yàn)室提供。隨機(jī)分成3組：空 白對(duì)照組(A組)、模型對(duì)照組（B組）、糞菌液模 型組（C組），每組18只。其中A組為正常大鼠， 給予無菌生理鹽水保留灌腸，每天一次，自由飲 水、進(jìn)食。B、C兩組為潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠， 分別給予無菌生理鹽水、糞菌液保留灌腸，每天 一次，自由飲水、進(jìn)食。（生理鹽水量、糞菌液 量按體重?fù)Q算） 2.22.

7、2模型建立模型建立 大鼠造模前1 d禁食24 h，不禁水，稱重后，3 的戊巴比妥（1ml/kg）腹腔注射麻醉，52，4， 6-三硝基苯磺酸(TNBS W/V)按100 mg/kg加入等體 積50%乙醇溶液；體位為頭朝下，用聚丙烯管插入 肛門上段8 cm，注射器注人。再倒立15 min左 右，以防藥液溢出，一次性灌腸。 2.32.3糞菌液的制備糞菌液的制備 糞菌液制備流程糞菌液制備流程：將約5g供體（A組）新鮮糞便 樣本置于攪拌器中，加入25 mL無菌09NaCl溶 液進(jìn)行初步均質(zhì)加工；將糞便漿體經(jīng)不銹鋼濾 網(wǎng)過濾去除其中的大顆粒物質(zhì)；2 h內(nèi)將樣本在 氮?dú)馍锕こ虖N內(nèi)進(jìn)行稱重并在勻漿器中進(jìn)一步

8、 勻質(zhì)處理；漿體逐級(jí)經(jīng)過直徑2漿體逐級(jí)經(jīng)過直 徑20 mm、10 mm、05 mm和025 mm的不銹 鋼濾網(wǎng)過濾以去除未吸收的食物殘?jiān)托☆w粒物 質(zhì)；將再次過濾的樣本以6000轉(zhuǎn)/min的速率離 心15 min，并將沉淀再懸浮于09NaCl溶液中 ，得幾乎無色無味的糞菌液。獲得的新鮮糞菌液 可立即進(jìn)行移植，也可加入無菌甘油后置于一 80作為冰凍樣本保存18周。 2.42.4指標(biāo)檢測(cè)指標(biāo)檢測(cè) 2.5Chiu2.5Chiu氏氏6 6級(jí)評(píng)分法評(píng)估損傷程度級(jí)評(píng)分法評(píng)估損傷程度 分別于造模后3d、7d、11d每組各取6只大鼠，3戊 巴比妥鈉麻醉后開腹，使用一次性采血針穿刺門靜脈取全 血2ml，待低溫離

9、心后，再吸出上清液，置于一80冰箱中 保存?zhèn)溆茫捎妹嘎?lián)免疫法（ELISA）測(cè)定血清TNF-、 IL-8濃度。取肛門以上8cm腸段卷起，置10中性甲醛中固 定、石蠟包埋、切片、HE染色后顯微鏡下觀察。并且于取 材完畢后采用頸椎脫臼法處死相應(yīng)大鼠。 2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差表示，血清學(xué)指標(biāo)比較采用單因素方差分析，P 0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3 3 TNF-TNF-主要由脂多糖(LPS)激活的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，對(duì)免疫 反應(yīng)、機(jī)體代謝、炎癥反應(yīng)、抗腫瘤均有重要的調(diào)節(jié)介導(dǎo)作用。 1.1.潰瘍性結(jié)腸炎中TNF-分泌水平及其m

10、RNA表達(dá)高于正常組或未 受累結(jié)直腸粘膜。 2.2.TNF-不僅能刺激巨噬細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、上皮 細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌花生四烯酸代謝物、細(xì)胞因子和蛋白酶，還 能吞噬細(xì)胞產(chǎn)物和補(bǔ)體片段引起細(xì)胞壞死、間質(zhì)中蛋白質(zhì)破壞和 水腫的發(fā)生，從而促進(jìn)胃腸細(xì)胞的組織損害。 3.3.TNF-可使中性粒細(xì)胞聚集，內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子上調(diào)以及增加 上皮緊密連接的通透性和抑制上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)等，還可誘導(dǎo)結(jié)腸 上皮細(xì)胞凋亡，破壞腸粘膜屏障，同時(shí)血管系統(tǒng)也遭到破壞，通 過以上途徑導(dǎo)致一系列潰瘍性結(jié)腸炎典型的炎癥病變。 IL-8 IL-8 是一種強(qiáng)而有力的中性粒細(xì)胞趨化和活化 因子，由單核細(xì)胞、上皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、纖維

11、 母細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞在IL-1、TNF 和外源性因子細(xì) 菌多糖(LPS)的刺激下產(chǎn)生,其主要生物學(xué)作用是 1.趨化并激活中性粒細(xì)胞,促進(jìn)中性粒細(xì)胞的溶酶 體酶活性和吞噬作用,對(duì)嗜堿性粒細(xì)胞和T 細(xì)胞也 有一定的趨化作用。 2.臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IL-8 在UC 患者的腸黏膜上皮中 高表達(dá)并且IL-8 水平與結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度呈正相 關(guān)。 技技 術(shù)術(shù) 路路 線線 圖圖 SD大鼠大鼠 空白對(duì)照組空白對(duì)照組模型對(duì)照組模型對(duì)照組 血清血清TNF-、IL8IL8濃度并取結(jié)直腸組織濃度并取結(jié)直腸組織HE染色后光鏡觀察染色后光鏡觀察 數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析統(tǒng)計(jì)軟件分析 糞菌液模型組糞菌液模型組 3 3

12、、7 7、1111天各處死天各處死 6 6只大鼠只大鼠 1 1導(dǎo)師對(duì)此項(xiàng)課題有系統(tǒng)、導(dǎo)師對(duì)此項(xiàng)課題有系統(tǒng)、 全面的認(rèn)識(shí)與把握全面的認(rèn)識(shí)與把握 2.2.已初步掌握已初步掌握動(dòng)物飼養(yǎng)及動(dòng)物飼養(yǎng)及 實(shí)驗(yàn)操作的基本要領(lǐng)實(shí)驗(yàn)操作的基本要領(lǐng) 3.3.山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心 具備本實(shí)驗(yàn)相關(guān)條件具備本實(shí)驗(yàn)相關(guān)條件 4 現(xiàn)階段，現(xiàn)階段，F(xiàn)MTFMT研究大部分是研究大部分是 關(guān)于關(guān)于FMTFMT治療治療復(fù)發(fā)性、難治復(fù)發(fā)性、難治 性性炎癥性腸?。ㄑ装Y性腸?。↖BDIBD）的個(gè)）的個(gè) 案或系列病例報(bào)道案或系列病例報(bào)道, ,對(duì)常規(guī)對(duì)常規(guī) 治療失敗或有手術(shù)禁忌證治療失敗或有手術(shù)禁忌證 的的UCUC病人，

13、病人，F(xiàn)MTFMT或許是不錯(cuò)或許是不錯(cuò) 的選擇，但其作用機(jī)制尚的選擇，但其作用機(jī)制尚 不完全清楚不完全清楚 前期研究工作積累前期研究工作積累 （1 1） 導(dǎo)師武華教授有深厚的學(xué)術(shù)造詣和豐富導(dǎo)師武華教授有深厚的學(xué)術(shù)造詣和豐富 的臨床經(jīng)驗(yàn)，可為實(shí)驗(yàn)提供理論技術(shù)指的臨床經(jīng)驗(yàn)，可為實(shí)驗(yàn)提供理論技術(shù)指導(dǎo)。導(dǎo)。 （2）已參閱大量與課題相關(guān)的中英文文獻(xiàn)及與 本課題參考性較強(qiáng)的相關(guān)資料和理論。 硬件設(shè)施基本完備硬件設(shè)施基本完備 我校生理實(shí)驗(yàn)室具備完成本實(shí)驗(yàn)的基本條件：高速冷凍我校生理實(shí)驗(yàn)室具備完成本實(shí)驗(yàn)的基本條件：高速冷凍 離心機(jī)、均漿機(jī)、超低溫冰箱、氮?dú)獠僮鲝N、，可以滿離心機(jī)、均漿機(jī)、超低溫冰箱、氮?dú)獠僮鲝N

14、、，可以滿 足本課題的需求。足本課題的需求。動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室有飼養(yǎng)動(dòng)物的動(dòng)物房動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室有飼養(yǎng)動(dòng)物的動(dòng)物房 和飼養(yǎng)條件和飼養(yǎng)條件。 1. 1.給予糞菌水的UC大鼠與給予無菌生理鹽水的UC大鼠 相比，血清TNF-、IL-8檢測(cè)值較小，說明前者的腸道炎 癥反應(yīng)輕，通透性低，腸屏障功能相比后者較好。 2. 2.給予糞菌水的UC大鼠與給予無菌生理鹽水的UC大鼠 相比，結(jié)直腸損傷情況判定評(píng)分較低。 9月月-3月月4月月-8月月 3月月 文獻(xiàn)查閱； 資料收集； 資料分析； 撰寫報(bào)告。 動(dòng)物飼養(yǎng)， 做好實(shí)驗(yàn)； 收集實(shí)驗(yàn) 數(shù)據(jù)。 整理資料； 分析資料； 統(tǒng)計(jì)分析； 撰寫論文。 經(jīng)費(fèi)預(yù)算經(jīng)費(fèi)預(yù)算 支出科目支出

15、科目 金額金額 （萬元）（萬元） 計(jì)算根據(jù)及理由計(jì)算根據(jù)及理由 合計(jì)合計(jì)0.80.8 科研業(yè)務(wù)費(fèi)科研業(yè)務(wù)費(fèi)0.250.25查閱資料、發(fā)表論文查閱資料、發(fā)表論文 實(shí)驗(yàn)材料費(fèi)實(shí)驗(yàn)材料費(fèi) 0.50.5動(dòng)物飼養(yǎng)、化學(xué)試劑及耗材動(dòng)物飼養(yǎng)、化學(xué)試劑及耗材 0.05儀器設(shè)備使用費(fèi)儀器設(shè)備使用費(fèi) 主要參考文獻(xiàn)： 參考文獻(xiàn) 1邱新運(yùn),劉玉蘭. 糞菌移植在疾病治療中的應(yīng)用進(jìn)展.中華內(nèi)科雜志. 2014, 2Borody TJ，Khomts AFecal microbiota transplantation and emerging applicationJNat Rev Gastroenterol Hepatol

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17、ody TJ，Khoruts AFecal miembiota transplantation and emerging applicationsJNat Rev Gastroenteml Hepatol，20129(2)：88-96 6 Round JL，Mazmanian SKThe gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and diseaseJNat Rev Immunol。2009 ，9(5)：313-323 7 蘇獻(xiàn)恩，于文霞，王世宣中華內(nèi)科雜志，1993：12：842. 8 Ishignro

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