生物化學(xué)：16-1_分子生物學(xué)技術(shù)和基因工程

1、 目錄目錄 常用分子生物學(xué)技術(shù)的常用分子生物學(xué)技術(shù)的 原理及應(yīng)用原理及應(yīng)用 The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology 科學(xué)的安全第一！科學(xué)的安全第一！ 目錄目錄 第一節(jié)第一節(jié) 分子雜交與印跡技術(shù)分子雜交與印跡技術(shù) Molecular Hybridization and Blotting Technique 目錄目錄 n分子雜交（分子雜交（molecular hybridization） 1. 核酸分子雜交核酸分子雜交 (nucleic acid hybridization) 在在DN

2、A復(fù)性過程中，如果把不同復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈單鏈 分子放在同一溶液中，或把分子放在同一溶液中，或把DNA與與RNA放放 在一起，只要在在一起，只要在DNA或或RNA的單鏈分子之的單鏈分子之 間有一定的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的間有一定的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的 分子之間形成雜化雙鏈分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex) 。 2. 蛋白質(zhì)雜交蛋白質(zhì)雜交 抗原抗體抗原抗體反應(yīng)反應(yīng) 一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理 目錄目錄 復(fù)性復(fù)性 RNADNA 目錄目錄 （一）印跡技術(shù)（一）印跡技術(shù) 利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子利用各種物理方法使電泳

3、膠中的生物大分子 轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移到NC等各種膜上，使之成為固相化分子。等各種膜上，使之成為固相化分子。 這一技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因這一技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因 此稱之為此稱之為“blotting”，譯為印跡技術(shù)。，譯為印跡技術(shù)。 目錄目錄 用放射性核素、生物素或熒光染料標(biāo)記其用放射性核素、生物素或熒光染料標(biāo)記其 末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為 “探針探針”，探針可以與固定在，探針可以與固定在NC膜上的核苷膜上的核苷 酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。 （二）探針技術(shù)（二）探針技

4、術(shù) 目錄目錄 二、印跡技術(shù)二、印跡技術(shù)的主要類別的主要類別及應(yīng)用及應(yīng)用 （一）（一）DNA印跡印跡 (Southern blotting) （二）（二）RNA印跡印跡 (Northern blotting) （三）蛋白質(zhì)的印跡（三）蛋白質(zhì)的印跡 (Western blotting) 用于基因組用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。 用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。 用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。 （四）蛋白質(zhì)修飾的（四）蛋白質(zhì)修飾的印跡印跡 (Eastern blotting) 用于用于蛋白質(zhì)翻譯后修飾（比如酯酰

5、化，糖基化，蛋白質(zhì)翻譯后修飾（比如酯?；?，糖基化， 磷酸化等）的研究磷酸化等）的研究。 目錄目錄 幾種印跡幾種印跡技術(shù)的比較技術(shù)的比較 分子雜交實(shí)驗(yàn)分子雜交實(shí)驗(yàn) 目錄目錄 放放 射射 自自 顯顯 影影 照照 片片 目錄目錄 n其他：其他： 斑點(diǎn)印跡斑點(diǎn)印跡 (dot blotting) 原位雜交原位雜交 (in situ hybridization) DNA點(diǎn)陣點(diǎn)陣 (DNA array) DNA芯片技術(shù)芯片技術(shù) (DNA chip) 目錄目錄 5 Primer 1 5 Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5 5 5 5 5 5 Template DNA 一、一、PCR技術(shù)的工作

6、原理技術(shù)的工作原理 5 5 5 5 5 5 5 5 目錄目錄 Cycle 3 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循環(huán)后，模板次循環(huán)后，模板DNA的含量的含量 可以擴(kuò)大可以擴(kuò)大100萬倍以上。萬倍以上。 目錄目錄 PCR技術(shù)原理示意圖技術(shù)原理示意圖 目錄目錄 n PCR的基本反應(yīng)步驟的基本反應(yīng)步驟 變性變性 9595 C C 延伸延伸 72C 退火退火 Tm-5C 目錄目錄 模板模板DNA 特異性引物特異性引物 耐熱耐熱DNA聚合酶聚合酶 dNTPs Mg2+ n PCR體系基本組成成分體系基本組成成分 目錄目錄 利用特異性引物以利用特異性引物以cDNA

7、或基因組或基因組DNA為模板獲為模板獲 得已知目的基因片段得已知目的基因片段, 或與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直或與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直 接以組織和細(xì)胞的接以組織和細(xì)胞的mRNA為模板獲得目的片段；為模板獲得目的片段； 利用簡并引物從利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中獲得文庫或基因組文庫中獲得 序列相似的基因片段；序列相似的基因片段； 利用隨機(jī)引物從利用隨機(jī)引物從cDNA文庫或基因組文庫中克隆文庫或基因組文庫中克隆 基因。基因。 二、二、PCR技術(shù)技術(shù)的主要用途的主要用途 （一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆 目錄目錄 利用利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體 外對目的

8、基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突外對目的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突 變等改造。變等改造。 PCR技術(shù)高度敏感，對模板技術(shù)高度敏感，對模板DNA的的 量要求很低，是量要求很低，是DNA和和RNA微量分析的微量分析的 最好方法。最好方法。 （三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分析 （二）基因突變（二）基因突變 目錄目錄 將將PCR技術(shù)引入技術(shù)引入DNA序列測定，使測序序列測定，使測序 工作大為簡化，也提高了測序的速度；工作大為簡化，也提高了測序的速度； 待測待測DNA片段既可克隆到特定的載體后片段既可克隆到特定的載體后 進(jìn)行序列測定，也可直接測定。進(jìn)行序列測定，也可直接測定。 PCR與其他技

9、術(shù)的結(jié)合可以大大提高基與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基 因突變檢測的敏感性因突變檢測的敏感性 。 （四）（四）DNA序列測定序列測定 （五）基因突變分析（五）基因突變分析 目錄目錄 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RT- PCR)是將是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)聯(lián)合反應(yīng)聯(lián)合 應(yīng)用的一種技術(shù)。應(yīng)用的一種技術(shù)。 RT-PCR是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因 以及對已知序列的以及對已知序列的RNA進(jìn)行定性及半定量分進(jìn)行定性及半定量分 析的最有效方法。析的最有效方法。 （一）逆轉(zhuǎn)錄（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)技術(shù) 三、

10、幾種重要的三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)衍生技術(shù) 目錄目錄 原位原位PCR(in situ PCR)是在組織切片或細(xì)胞涂片是在組織切片或細(xì)胞涂片 上的單個(gè)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的上的單個(gè)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的PCR反應(yīng)，然后用特異反應(yīng)，然后用特異 性探針進(jìn)行原位雜交，即可檢出待測性探針進(jìn)行原位雜交，即可檢出待測DNA或或 RNA是否在該組織或細(xì)胞中存在。是否在該組織或細(xì)胞中存在。 原位原位PCR方法彌補(bǔ)了方法彌補(bǔ)了PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)技術(shù)和原位雜交技術(shù) 的不足，是將目的基因的擴(kuò)增與定位相結(jié)合的的不足，是將目的基因的擴(kuò)增與定位相結(jié)合的 一種最佳方法。一種最佳方法。 （二）原位（二）原位PCR技術(shù)技術(shù) 目錄目錄 （三

11、）實(shí)時(shí)（三）實(shí)時(shí)PCR技術(shù)技術(shù) 實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PCR(real-time PCR)技術(shù)通過動(dòng)態(tài)技術(shù)通過動(dòng)態(tài) 監(jiān)測反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積監(jiān)測反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積 對定量分析的干擾，亦被稱為定量對定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。 目錄目錄 n實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理技術(shù)原理 Q R 3 3 5 5 上游上游 引物引物 下游下游 引物引物 熒光標(biāo)記引物熒光標(biāo)記引物 R Q 3 3 5 5 目錄目錄 n實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PCRPCR分類：分類： 實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PRC 非探針類非探針類 探針類探針類 1. TaqMan1. TaqMan探針法探針法 2. 2. 分子信標(biāo)探針法分子信標(biāo)探針法 3.

12、FRET3. FRET探針法探針法 目錄目錄 圖20-3 TaqMan探針法實(shí)時(shí)PCR原理示意圖 A PCR song for better Scientists A group of crazy scientific nerds from BioRad 1. There was a time when to amplify DNA,2. You had to grow tons and tons of tiny cells.3. (Oooh) Then along came a guy named Dr. Kary Mullis,4. Said you can amplify in vitr

13、o just as well.5. Just mix your template with a buffer and some primers,6. Nucleotides and polymerases too.7. Denaturing, annealing, and extending,8. Well its amazing what heating and cooling and heating will do.9. PCR when you need to detect mutation (detect mutation)10. PCR when you need to recomb

14、ine (recombine). 11. PCR when you need to find out who the daddy is (whos your daddy?)12. PCR when you need to solve a crime (solve a crime) 總結(jié)，這些應(yīng)用中總結(jié)，這些應(yīng)用中最重要的，恐怕要數(shù)最重要的，恐怕要數(shù): “PCR, when you need to find out who the daddy is” 目錄目錄 第三節(jié)第三節(jié) 基因文庫基因文庫 Gene Library 目錄目錄 基因組基因組DNA文庫文庫 (genomic DNA library

15、) cDNA文庫文庫(cDNA library) n基因文庫基因文庫( (gene library) 是指一個(gè)包含了某一生物體全部是指一個(gè)包含了某一生物體全部DNADNA序列序列 的克隆群體。的克隆群體。 目錄目錄 一、基因組一、基因組DNA文庫文庫 基因組基因組DNADNA文庫是指生物的文庫是指生物的基因組基因組DNA的的 信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNA 片段形式貯存的克隆群體。片段形式貯存的克隆群體。 用于構(gòu)建基因組文庫的載體有用于構(gòu)建基因組文庫的載體有 噬菌體、噬菌體、 粘粒和酵母人工染色體等。粘粒和酵母人工染色體等。 目錄目錄 n基因組文

16、庫和基因組文庫和cDNA文庫的構(gòu)建和篩選文庫的構(gòu)建和篩選 目錄目錄 第一輪篩選第一輪篩選 第二輪篩選第二輪篩選第三輪篩選第三輪篩選 n基因組文庫篩選結(jié)果舉例基因組文庫篩選結(jié)果舉例 目錄目錄 cDNA文庫是包含某一組織細(xì)胞在一定條文庫是包含某一組織細(xì)胞在一定條 件下所表達(dá)的全部件下所表達(dá)的全部mRNAmRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的 cDNA序列序列的克隆群體，它以的克隆群體，它以cDNA片段的形片段的形 式貯存著該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息。式貯存著該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息。 二、二、cDNA文庫文庫 目錄目錄 第四節(jié)第四節(jié) 高通量技術(shù)高通量技術(shù) High Throughput Techn

17、ique 目錄目錄 是指將許多特定的是指將許多特定的DNADNA片段有規(guī)律地緊密排片段有規(guī)律地緊密排 列固定于單位面積的支持物上，然后與待測的熒列固定于單位面積的支持物上，然后與待測的熒 光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，雜交后用熒光檢測系統(tǒng)等光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，雜交后用熒光檢測系統(tǒng)等 對芯片進(jìn)行掃描，通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對每一位點(diǎn)的對芯片進(jìn)行掃描，通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對每一位點(diǎn)的 熒光信號做出檢測、比較和分析，從而迅速得出熒光信號做出檢測、比較和分析，從而迅速得出 定性和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被稱作定性和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被稱作DNA微陣列微陣列 (DNA microarray)。 一、基因芯片一、基因芯片 n基因芯

18、片基因芯片(gene chip) 目錄目錄 DNA芯片芯片 技術(shù)技術(shù) 目錄目錄 n基因芯片工作流程示意圖基因芯片工作流程示意圖 目錄目錄 是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn) 陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測蛋白樣品反陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測蛋白樣品反 應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng) 對靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。對靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。 二、蛋白質(zhì)芯片二、蛋白質(zhì)芯片 蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng)蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng) n蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片(protein chip) n蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)

19、芯片作用原理作用原理 目錄目錄 目錄目錄 NGS vs. microarray 1.應(yīng)用成熟度應(yīng)用成熟度 2.單價(jià)單價(jià) 3.期望的輸出數(shù)據(jù)期望的輸出數(shù)據(jù) 4.研究總體目標(biāo)（如發(fā)現(xiàn)新基因還是了解概況）研究總體目標(biāo)（如發(fā)現(xiàn)新基因還是了解概況） 目錄目錄 第五節(jié)第五節(jié) 生物大分子相互作用研究技術(shù)生物大分子相互作用研究技術(shù) The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study 目錄目錄 一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù) 酵母雙雜交酵母雙雜交 各種親和分析（標(biāo)簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等）各種親和分析（標(biāo)簽蛋白沉淀

20、、免疫共沉淀等） 熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析 噬菌體顯示系統(tǒng)篩選噬菌體顯示系統(tǒng)篩選 n常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù) 目錄目錄 標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)是一個(gè)基于親和色譜標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)是一個(gè)基于親和色譜 原理的、分析蛋白質(zhì)體外直接相互作用的方法。原理的、分析蛋白質(zhì)體外直接相互作用的方法。 （一）標(biāo)簽蛋白沉淀（一）標(biāo)簽蛋白沉淀 標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)主要用于證明兩種蛋標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)主要用于證明兩種蛋 白分子是否存在直接物理結(jié)合、分析兩種分子結(jié)白分子是否存在直接物理結(jié)合、分析兩種分子結(jié) 合的具體結(jié)構(gòu)部位及篩選細(xì)胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位

21、及篩選細(xì)胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié) 合的未知分子。合的未知分子。 目錄目錄 標(biāo)簽融合標(biāo)簽融合 蛋白沉淀蛋白沉淀 實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)流程 示意圖示意圖 目錄目錄 （二）酵母雙雜交技術(shù)的基本原理（二）酵母雙雜交技術(shù)的基本原理和用途和用途 目錄目錄 n酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用 證明兩種已知基因序列的蛋白質(zhì)可以相互作用證明兩種已知基因序列的蛋白質(zhì)可以相互作用 的生物信息學(xué)推測。的生物信息學(xué)推測。 分析已知存在相互作用的兩種蛋白質(zhì)分子的的分析已知存在相互作用的兩種蛋白質(zhì)分子的的 相互作用功能結(jié)構(gòu)域或關(guān)鍵的氨基酸殘基。相互作用功能結(jié)構(gòu)域或關(guān)鍵的氨基酸殘基。 將擬研究的蛋白質(zhì)的編碼基因與將擬研究的蛋白質(zhì)的

22、編碼基因與BD基因融合成基因融合成 為為“誘餌誘餌”表達(dá)質(zhì)粒，可以篩選表達(dá)質(zhì)粒，可以篩選AD基因融合的基因融合的 “獵物獵物”基因表達(dá)文庫，篩選未知的相互作用基因表達(dá)文庫，篩選未知的相互作用 蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)。 目錄目錄 電泳遷移率變動(dòng)測定電泳遷移率變動(dòng)測定( (electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或稱凝膠遷移變動(dòng)實(shí)驗(yàn)或稱凝膠遷移變動(dòng)實(shí)驗(yàn)( (gel shift assay)最初用于研究最初用于研究DNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)結(jié)合蛋白與相應(yīng) DNA序列間的相互作用，可用于定性和定量分析，序列間的相互作用，可用于定性和定量分析， 已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方

23、法。目前這一技已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法。目前這一技 術(shù)也被用于研究術(shù)也被用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定結(jié)合蛋白和特定RNA序列間序列間 的相互作用。的相互作用。 二、二、DNA-蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù)蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù) （一）電泳遷移率變動(dòng)測定（一）電泳遷移率變動(dòng)測定 目錄目錄 放放 射射 自自 顯顯 影影 未結(jié)合探針未結(jié)合探針 結(jié)合有蛋白的探針結(jié)合有蛋白的探針 標(biāo)記探針標(biāo)記探針1X1X1X1X 核蛋白提取物核蛋白提取物1X10X10X 未標(biāo)記探針未標(biāo)記探針 10X n凝膠遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖凝膠遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖 目錄目錄 染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromati

24、n immunoprecipitation assay, ChIP)是目前可是目前可 以研究體內(nèi)以研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的與蛋白質(zhì)相互作用的 主要方法。主要方法。 （二）染色質(zhì)免疫沉淀法（二）染色質(zhì)免疫沉淀法 目錄目錄 n染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)流程及結(jié)果示意圖染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)流程及結(jié)果示意圖 目錄目錄 DNA重組和重組重組和重組DNA技術(shù)技術(shù) DNA Recombination and Recombinant DNA technology 目錄目錄 nDNA重組重組（DNA recombination）是指不）是指不 同同DNA分子斷裂和連接而產(chǎn)生分子斷裂和連接而產(chǎn)生DNA片段片段 的交

25、換并重新組合形成新的交換并重新組合形成新DNA分子的過程。分子的過程。 n重組重組DNA技術(shù)技術(shù)（recombinant DNA technology）是指在體外將兩個(gè)或兩個(gè)以）是指在體外將兩個(gè)或兩個(gè)以 上上DNA分子重新組合并在適當(dāng)細(xì)胞中增殖分子重新組合并在適當(dāng)細(xì)胞中增殖 形成新形成新DNA分子的過程。分子的過程。 目錄目錄 第一節(jié)第一節(jié) 自然界自然界DNA重組和基因轉(zhuǎn)移重組和基因轉(zhuǎn)移 DNA Recombination and Gene Transfer in Nature 目錄目錄 DNA重組重組 同源重組同源重組 (homologous recombination) 位點(diǎn)特異的重組位點(diǎn)

26、特異的重組(site-specific recombination) 轉(zhuǎn)座重組轉(zhuǎn)座重組(transposition recombination) 接合作用接合作用 (conjugation) 轉(zhuǎn)化作用轉(zhuǎn)化作用 (transformation) 轉(zhuǎn)導(dǎo)作用轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 (transduction) 目錄目錄 發(fā)生在同源序列間的重組稱為發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組同源重組 (homologous recombination)，又稱又稱基本重組基本重組 （general recombination）。是最基本的。是最基本的 DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在

27、兩個(gè)兩個(gè)DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片 段的交換。段的交換。 以以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機(jī)制的同源重組為例，了解同源重組機(jī)制 的的Holliday模型模型 一、同源重組是最基本的一、同源重組是最基本的DNA重組方式重組方式 目錄目錄 nHolliday模型的模型的4個(gè)關(guān)鍵步驟：個(gè)關(guān)鍵步驟： 兩個(gè)同源染色體兩個(gè)同源染色體DNA排列整齊；排列整齊； 片段重組體片段重組體(patch recombinant) 拼接重組體拼接重組體(splice recombinant) 一個(gè)一個(gè)DNA的一條鏈斷裂、并與另一個(gè)的一條鏈斷裂、并與另一個(gè)DNA 對應(yīng)的

28、鏈連接，形成對應(yīng)的鏈連接，形成Holliday中間體；中間體； 通過分支移動(dòng)產(chǎn)生異源雙鏈通過分支移動(dòng)產(chǎn)生異源雙鏈DNA； Holliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈中間體切開并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈 重組體重組體DNA，分別為：，分別為： 目錄目錄 n參與細(xì)菌參與細(xì)菌DNA同源重組的酶有數(shù)十種，其中最同源重組的酶有數(shù)十種，其中最 關(guān)鍵的是關(guān)鍵的是RecA蛋白蛋白、RecBCD復(fù)合物復(fù)合物和和RuvC蛋蛋 白白。 nRecBCD復(fù)合物復(fù)合物具有三種酶活性，即依賴于具有三種酶活性，即依賴于ATP 的核酸外切酶活性、可被的核酸外切酶活性、可被ATP增強(qiáng)的核酸內(nèi)切增強(qiáng)的核酸內(nèi)切 酶活性以及需要酶活性以

29、及需要ATP的解螺旋酶活性。的解螺旋酶活性。 nRecA蛋白蛋白可結(jié)合單鏈可結(jié)合單鏈DNA（ssDNA），形成），形成 RecA-ssDNA復(fù)合物。復(fù)合物。 nRuvC有內(nèi)切酶活性，能專一性識別有內(nèi)切酶活性，能專一性識別Holliday連連 接點(diǎn)，并有選擇地切開同源重組體的中間體。接點(diǎn)，并有選擇地切開同源重組體的中間體。 目錄目錄 二、位點(diǎn)特異重組是發(fā)生在特異位點(diǎn)二、位點(diǎn)特異重組是發(fā)生在特異位點(diǎn) 間的間的DNA整合整合 位點(diǎn)特異重組位點(diǎn)特異重組(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在兩個(gè)是由整合酶催化，在兩個(gè)DNA序列的特異序列的特異 位點(diǎn)間發(fā)生的整合。位

30、點(diǎn)間發(fā)生的整合。 目錄目錄 噬菌體的整合酶識別噬菌體和宿主染噬菌體的整合酶識別噬菌體和宿主染 色體的特異靶位點(diǎn)發(fā)生選擇性整合；反轉(zhuǎn)色體的特異靶位點(diǎn)發(fā)生選擇性整合；反轉(zhuǎn) 錄病毒整合酶可特異地識別、整合反轉(zhuǎn)錄錄病毒整合酶可特異地識別、整合反轉(zhuǎn)錄 病毒病毒cDNA的的長末端重復(fù)序列長末端重復(fù)序列(long terminal repeat, LTR)。 。 （一）（一）噬菌體噬菌體DNA的整合的整合 目錄目錄 （二）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組（二）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組 沙門氏菌沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變。片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變。 目錄目錄 （三）免疫球蛋白基因的重排（三）免疫球蛋白基因的重排 免疫球蛋白免

31、疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈，由兩條輕鏈(L鏈鏈)和兩條重和兩條重 鏈鏈(H鏈鏈)組成，分別由三個(gè)獨(dú)立的基因族編碼，組成，分別由三個(gè)獨(dú)立的基因族編碼， 其中兩個(gè)編碼輕鏈其中兩個(gè)編碼輕鏈( 和和 )，一個(gè)編碼重鏈。，一個(gè)編碼重鏈。 輕鏈的基因片段：輕鏈的基因片段： 重鏈的基因片段：重鏈的基因片段： L V J C L V D J C 目錄目錄 重鏈重鏈(IgH)基因的基因的V-D-J重排和輕鏈重排和輕鏈(IgL)基基 因的因的V-J重排均發(fā)生在特異位點(diǎn)上。在重排均發(fā)生在特異位點(diǎn)上。在V片片 段的下游，段的下游，J片段的上游以及片段的上游以及D片段的兩側(cè)片段的兩側(cè) 均存在保守的重組信號序列均存在保

32、守的重組信號序列(recombination signal sequence, RSS)。此重排的重組酶基。此重排的重組酶基 因因rag (recombination activating gene)共有共有 兩個(gè)，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)兩個(gè)，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)RAG1和和RAG2。 CACAGTG(12/23)ACAAAAACC GTGTCCAC TGTTTTTGG 重組信號序列重組信號序列基因片段基因片段 目錄目錄 免疫球蛋白基因重排過程免疫球蛋白基因重排過程 目錄目錄 三、轉(zhuǎn)座重組三、轉(zhuǎn)座重組可使基因移位可使基因移位 由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重 排稱為排

33、稱為轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座(transposition)。 大多數(shù)基因在基因組內(nèi)的位置是固定的，大多數(shù)基因在基因組內(nèi)的位置是固定的， 但有些基因可以從一個(gè)位置移動(dòng)到另一位但有些基因可以從一個(gè)位置移動(dòng)到另一位 置。這些可移動(dòng)的置。這些可移動(dòng)的DNA序列包括插入序序列包括插入序 列和轉(zhuǎn)座子。列和轉(zhuǎn)座子。 目錄目錄 插入序列插入序列(insertion sequences, IS)組成：組成： IRTransposase GeneIR （一）插入序列轉(zhuǎn)座（一）插入序列轉(zhuǎn)座 二個(gè)分離的反向重復(fù)二個(gè)分離的反向重復(fù)(inverted repeats, IR)序列序列 特有的正向重復(fù)序列特有的正向重復(fù)序列 一個(gè)轉(zhuǎn)座酶（一

34、個(gè)轉(zhuǎn)座酶（transposase)編碼基因編碼基因 目錄目錄 轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子(transposons) 可從一個(gè)染色體可從一個(gè)染色體 位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一位點(diǎn)的分散重復(fù)序列。位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一位點(diǎn)的分散重復(fù)序列。 IRIRTransposase Gene有用基有用基 因因 （二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座 轉(zhuǎn)座子組成：轉(zhuǎn)座子組成： 反向重復(fù)序列反向重復(fù)序列 轉(zhuǎn)座酶編碼基因轉(zhuǎn)座酶編碼基因 抗生素抗性等有用的基因抗生素抗性等有用的基因 目錄目錄 由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座 目錄目錄 四、原核細(xì)胞可通過接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)四、原核細(xì)胞可通過接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo) 進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移或重組進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移或重組 （一）接合

35、作用（一）接合作用 當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過菌毛相互當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過菌毛相互 接觸時(shí)，質(zhì)粒接觸時(shí)，質(zhì)粒DNA從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn) 移至另一細(xì)胞（細(xì)菌）的移至另一細(xì)胞（細(xì)菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為轉(zhuǎn)移稱為接接 合作用合作用(conjugation)。 目錄目錄 可接合質(zhì)粒如可接合質(zhì)粒如 F 因子因子(F factor) 細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。分子。 質(zhì)粒質(zhì)粒 目錄目錄 （二）轉(zhuǎn)化作用（二）轉(zhuǎn)化作用 通過自動(dòng)獲取或人為地供給外通過自動(dòng)獲取或人為地供給外 源源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞 獲得新的遺傳表型，稱為

36、獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化作用轉(zhuǎn)化作用 (transformation)。 目錄目錄 例：例：溶菌時(shí)，裂解的溶菌時(shí)，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。片段被另一細(xì)菌攝取。 目錄目錄 （三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放 出來、再次感染另一（供體）細(xì)胞時(shí)，發(fā)出來、再次感染另一（供體）細(xì)胞時(shí)，發(fā) 生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移 及基因重組即為及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)。 目錄目錄 噬菌體的生活史噬菌體的生活史 溶菌生長途徑溶菌生長途徑 (lysis pathway) 溶源

37、菌生長途徑溶源菌生長途徑 (lysogenic pathway) 目錄目錄 第二節(jié)第二節(jié) 重組重組DNA技術(shù)技術(shù) Recombinant DNA Technology 目錄目錄 重組重組DNA技術(shù)的發(fā)展史技術(shù)的發(fā)展史 1865年年 G.J.Mendel的豌豆雜交試驗(yàn)。的豌豆雜交試驗(yàn)。 1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。 1973年年 美國斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個(gè)重組美國斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個(gè)重組DNA分子。分子。 1977年年 美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳 工程公司，專門應(yīng)用重組工程

38、公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的 藥物。藥物。 1980年年 開始建造第一家應(yīng)用重組開始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠。技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠。 1997年年 英國羅林研究所成功的克隆了多莉。英國羅林研究所成功的克隆了多莉。 目錄目錄 重組重組DNA技術(shù)相關(guān)概念技術(shù)相關(guān)概念 克隆克隆(clone):來自同一始祖的相同副本或拷來自同一始祖的相同副本或拷 貝的集合。貝的集合。 獲取同一拷貝的過程稱為克隆化獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)， 即無性繁殖。即無性繁殖。 DNA克隆克隆 目錄目錄 技術(shù)水平：技術(shù)水平：分子克隆分子克隆(molecu

39、lar clone) （即（即DNA 克隆）克?。?細(xì)胞克隆細(xì)胞克隆 個(gè)體克?。▌?dòng)物或植物）個(gè)體克隆（動(dòng)物或植物） 目錄目錄 其主要過程包括：在體外將目的其主要過程包括：在體外將目的DNA片段片段 與能自主復(fù)制的遺傳元件（又叫載體）連接，與能自主復(fù)制的遺傳元件（又叫載體）連接， 形成重組形成重組DNA分子，進(jìn)而在受體細(xì)胞中復(fù)制、分子，進(jìn)而在受體細(xì)胞中復(fù)制、 擴(kuò)增，從而獲得單一擴(kuò)增，從而獲得單一DNA分子的大量拷貝。分子的大量拷貝。 重組重組DNA技術(shù)，又稱分子克?。夹g(shù)，又稱分子克?。╩olecular cloning）或）或DNA克隆（克?。―NA cloning）或基因工）或基因工 程（程

40、（genetic engineering）技術(shù)）技術(shù) 目錄目錄 目的：目的： 分離獲得某一感興趣的基因或分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)） 目錄目錄 一、重組一、重組DNA技術(shù)中常用的工具酶技術(shù)中常用的工具酶 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 DNA聚合酶聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 T4DNA連接酶連接酶 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶 重組重組DNA技術(shù)中常用的工具酶技術(shù)中常用的工具酶 工工 具具 酶酶功功 能能 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割識別特異序列，切割DNA

41、 DNA連接酶連接酶催化催化DNA中相鄰的中相鄰的5 磷酸基和磷酸基和3 羥基末端之間形成磷酸羥基末端之間形成磷酸 二酯鍵，使二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接分子或片段連接 DNA聚合酶聚合酶合成雙鏈合成雙鏈cDNA分子或片段連接；分子或片段連接；缺口平移制作高比缺口平移制作高比 活探針；活探針； DNA序列分析；序列分析；填補(bǔ)填補(bǔ)3 末端末端 Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而無外切活性，而無53 外切活性。常用于外切活性。常用于 cDNA第二鏈合成，

42、雙鏈第二鏈合成，雙鏈DNA 3 末端標(biāo)記等末端標(biāo)記等 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶合成合成cDNA；替代替代DNA聚合酶聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或 DNA序列分析序列分析 多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針 末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶在在3 羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾 堿性磷酸酶堿性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基 目錄目錄 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease) 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease,

43、 RE)是一類核酸內(nèi)切酶，能識別雙鏈?zhǔn)且活惡怂醿?nèi)切酶，能識別雙鏈DNA分子分子 內(nèi)部的特異序列內(nèi)部的特異序列, 并裂解磷酸二酯鍵。并裂解磷酸二酯鍵。 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G Bam H 定義：定義： 目錄目錄 與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾 系統(tǒng)，限制外源系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身，保護(hù)自身DNA。 、（基因工程技術(shù)中常用（基因工程技術(shù)中常用型）型） 分類：分類： 作用：作用： 目錄目錄 第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫； 第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第二、第

44、三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫； 第四個(gè)字母代表株；第四個(gè)字母代表株； 用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。 命名：命名： Hin d 屬屬 系系 株株 序序 Haemophilus influenzae d株株 流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d株的第三種酶株的第三種酶 目錄目錄 類酶識別序列特點(diǎn)類酶識別序列特點(diǎn) 回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)(palindrome) 切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口 目錄目錄 Bam H GTC CAG G CCTAG GATCC G GGATCC CCTAGG Hind GTCGAC CAGCTG GAC CTG 平端切口平端切口 黏端切

45、口黏端切口 目錄目錄 有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全 相同，但切割相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，后，產(chǎn)生相同的粘性末端， 稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配 伍末端伍末端(compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGA G CCTAG GATCC G A TCTAG GATCT A 同尾酶同尾酶 目錄目錄 來源不同的限制酶，但能識別和切割來源不同的限制酶，但能識別和切割 同一位點(diǎn)，這些酶稱同一位點(diǎn)，這些酶稱同裂酶或同功異源酶同裂酶或同功異源酶。 GGATCC C

46、CTAGG G CCTAG GATCC G Bam H GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G Bst 同裂酶：同裂酶： 名稱名稱 識別序列及切割位點(diǎn)識別序列及切割位點(diǎn)名稱識別序列及切割點(diǎn)名稱識別序列及切割點(diǎn) 切割后產(chǎn)生切割后產(chǎn)生突出末端突出末端: BamH 5GGATCC.3GATCC.3 Bgl 5AGATCT.3GATCT.3 EcoR EcoR 5GAATTC.3AATTC.3 Hind Hind 5AAGCTT.3AGCTT.3 Hpa Hpa 5CCGG.3CGG.3 Mbo Mbo 5GATC.3GATC.3 Nde Nde 5GATATG.3TATG.3 切

47、割后產(chǎn)生切割后產(chǎn)生3突出末端突出末端: Apa 5GGGCCC.3C.3 Hae 5PuGCGCPy.3Py.3 Kpn 5GGTACC.3C.3 Pst 5CTGCAG.3G.3 Sph 5GCATGC.3C.3 切割后產(chǎn)生平末端切割后產(chǎn)生平末端: Alu 5AGCT.3CT.3 EcoR 5GATATC.3ATC.3 Hae Hae 5GGCC.3CC.3 Pvu Pvu 5CAGCTG.3CTG.3 Sma Sma 5CCCGGG.3GGG.3 限制性內(nèi)切核酸酶限制性內(nèi)切核酸酶 目錄目錄 二、重組二、重組DNADNA技術(shù)中常用的載體技術(shù)中常用的載體 定義定義 為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁

48、殖為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖 或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些 DNA分子。分子。 載體按功能分為載體按功能分為 克隆載體克隆載體(cloning vector) 表達(dá)載體表達(dá)載體(expression vector) 目錄目錄 克隆載體克隆載體(cloning vector) 為使插入的外源為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意序列被擴(kuò)增而特意 設(shè)計(jì)的載體稱為設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體克隆載體。 表達(dá)載體表達(dá)載體(expression vector) 為使插入的外源為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成 多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的

49、載體稱為表達(dá)載體表達(dá)載體。 目錄目錄 （一）克隆載體（一）克隆載體 至少有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)使載體在宿主細(xì)胞中進(jìn)行至少有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)使載體在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)制自主復(fù)制， 并能使克隆的外源并能使克隆的外源DNA片段得到同步擴(kuò)增；片段得到同步擴(kuò)增； 至少有至少有一個(gè)選擇標(biāo)志一個(gè)選擇標(biāo)志（selection marker）：選擇標(biāo)志是）：選擇標(biāo)志是 區(qū)分含與不含載體的細(xì)胞所必需的，包括抗生素抗性基區(qū)分含與不含載體的細(xì)胞所必需的，包括抗生素抗性基 因、因、-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（lacZ）、營養(yǎng)缺陷耐受基因等。）、營養(yǎng)缺陷耐受基因等。 有適宜的有適宜的RE的單一切點(diǎn)的單一切點(diǎn)：載體中一般都構(gòu)建

50、有一段特異：載體中一般都構(gòu)建有一段特異 性核苷酸序列，在這段序列中包含了多個(gè)性核苷酸序列，在這段序列中包含了多個(gè)RE的單一切點(diǎn)，的單一切點(diǎn)， 可供外源基因插入時(shí)選擇，叫多克隆位點(diǎn)（可供外源基因插入時(shí)選擇，叫多克隆位點(diǎn)（multiple cloning sites，MCS）。）。 1. 1. 克隆載體應(yīng)具備的基本特點(diǎn)克隆載體應(yīng)具備的基本特點(diǎn) 目錄目錄 （1 1）質(zhì)粒）質(zhì)粒 (plasmid) 特點(diǎn)特點(diǎn): : 能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺 傳信息傳信息, , 會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。 2. 常用的克隆載體常用的克隆載體

51、 pUC18質(zhì)粒載體圖譜質(zhì)粒載體圖譜 目錄目錄 噬菌體噬菌體DNA改造系統(tǒng)改造系統(tǒng) gt系列（插入型，適用系列（插入型，適用cDNA克隆）克?。?EMBL系列（置換型，適用基因組克隆）系列（置換型，適用基因組克隆） （2 2）噬菌體）噬菌體(phage) M13噬菌體噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含改造系統(tǒng)（含lacZ基因）基因） M13mp系列系列 pUC系列系列 目錄目錄 柯斯質(zhì)?？滤官|(zhì)粒（cosmid）載體（又稱黏粒載體）載體（又稱黏粒載體） 酵母人工染色體酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC) 細(xì)菌人工染色體細(xì)菌人工染色體 (bacterial a

52、rtificial chromosome, BAC) 動(dòng)物病毒動(dòng)物病毒DNA改造的載體改造的載體 （如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒） （3）其他克隆載體）其他克隆載體 目錄目錄 （二）表達(dá)載體（二）表達(dá)載體 表達(dá)載體是指用來在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源基因表達(dá)載體是指用來在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源基因 的載體。的載體。 根據(jù)宿主細(xì)胞分為：根據(jù)宿主細(xì)胞分為： 原核表達(dá)載體原核表達(dá)載體 真核表達(dá)載體真核表達(dá)載體 目錄目錄 1. 1. 原核表達(dá)載體原核表達(dá)載體 原核表達(dá)載體的基本組成原核表達(dá)載體的基本組成 R R：調(diào)節(jié)序列；：調(diào)節(jié)序列；P P：啟動(dòng)子；：啟動(dòng)子；SDS

53、D：SDSD序列；序列；TTTT：轉(zhuǎn)錄終止序列：轉(zhuǎn)錄終止序列 目錄目錄 2. 2. 真核表達(dá)載體真核表達(dá)載體 真核表達(dá)載體的基本組成真核表達(dá)載體的基本組成 OriPro：原核復(fù)制起始序列；P：啟動(dòng)子；MCS：多克隆位點(diǎn)； TT：轉(zhuǎn)錄終止序列；orieuk：真核復(fù)制起始序列。 目錄目錄 第三節(jié)第三節(jié) 重組重組DNA技術(shù)基本原理技術(shù)基本原理 和操作步驟和操作步驟 目錄目錄 基本原理基本原理 目的基因的獲取目的基因的獲取 DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞外源基因與載體的連接外源基因與載體的連接 克隆載體的選擇和構(gòu)建克隆載體的選擇和構(gòu)建 重組體的篩選重組體的篩選 克隆基因的表達(dá)克隆基因的表達(dá) 以以 質(zhì)質(zhì)

54、 粒粒 為為 載載 體體 的的 DNA 克克 隆隆 過過 程程 目錄目錄 （一）目的基因的分離獲?。ㄒ唬┠康幕虻姆蛛x獲取分分 1. 1.化學(xué)合成法化學(xué)合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn) 物的氨基酸序列物的氨基酸序列 。 2. 2.從基因組從基因組DNADNA文庫和文庫和cDNAcDNA文庫中獲取目文庫中獲取目 的的DNA (DNA (見第見第2020章章) ) 3. 3.PCRPCR法法 ( (見第見第2020章章) ) 4. 4.其他方法其他方法 ( (見第見第2020章章) ) 目錄目錄 化學(xué)合成法獲取目的基因化學(xué)合成法獲取目的基因 由已知氨

55、基酸序列推測可能的由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列。序列。 組織或細(xì)胞染色體組織或細(xì)胞染色體DNA 基因片斷基因片斷 克隆載體克隆載體 重組重組DNA分子分子 含重組分子的轉(zhuǎn)化菌含重組分子的轉(zhuǎn)化菌 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶 受體菌受體菌 基因組基因組DNA文庫文庫 存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi) 由克隆載體所攜帶的所由克隆載體所攜帶的所 有基因組有基因組DNA的集合的集合 從基因組從基因組DNA文文 庫獲取目的基因庫獲取目的基因 限制酶切位點(diǎn)限制酶切位點(diǎn) 限制酶消化限制酶消化 除去中間片段除去中間片段 cos L R cos cos L 左臂左臂 R cos 右臂右臂 真核生物染真核生物

56、染 色體色體DNA 限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA與載體與載體DNA混合混合 連接反應(yīng)連接反應(yīng) 體外包裝體外包裝 用重組噬菌體用重組噬菌體 感染大腸桿菌感染大腸桿菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文庫基因文庫 用隨機(jī)切割的真核生物染色體用隨機(jī)切割的真核生物染色體DNA片段構(gòu)建基因文庫片段構(gòu)建基因文庫 mRNA cDNA 雙鏈雙鏈cDNA 重組重組DNA分子分子 cDNA文庫文庫 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶 載體載體 受體菌受體菌 復(fù)制復(fù)制 從從cDNA文庫獲取目的基因文庫獲取目的基因 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 A A A A T T

57、T T AAAA SISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶 堿水解堿水解 T T T T 目錄目錄 （二）載體的選擇與構(gòu)建（二）載體的選擇與構(gòu)建選選 目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，載目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，載 體的選擇和改建方法也不同。體的選擇和改建方法也不同。 目的：目的： 獲得某一目的基因或獲得某一目的基因或DNA片段片段 獲得目的獲得目的DNA片段所編碼的蛋白質(zhì)片段所編碼的蛋白質(zhì) 目錄目錄 載體載體插入插入DNA片段片段宿主細(xì)胞宿主細(xì)胞 質(zhì)粒質(zhì)粒510kb細(xì)菌，酵母細(xì)菌，酵母 噬菌體載體噬菌體載體20kb細(xì)菌細(xì)菌 黏粒黏粒50 kb細(xì)菌細(xì)菌 BAC400kb細(xì)菌細(xì)菌 YAC3 Mb

58、酵母酵母 不同載體的克隆容量及適宜宿主細(xì)胞不同載體的克隆容量及適宜宿主細(xì)胞 目錄目錄 （三）目的（三）目的DNA與載體連接與載體連接接接 方式：（方式：（1）單一相同黏端連接單一相同黏端連接 （2 2）不同黏端連接不同黏端連接 （3）通過其他措施產(chǎn)生黏端進(jìn)行連接通過其他措施產(chǎn)生黏端進(jìn)行連接 1. 黏端連接黏端連接 Bam H切割反應(yīng)切割反應(yīng) GGATCC CCTAGG T4 DNA連接酶連接酶 15C GATCC G G CCTAG 目的基因用目的基因用 Bam H切割切割 G CCTAG G CCTAG G CCTAG G CCTAG GATCC G GATCC G GATCC G GATC

59、C G 載體載體DNA用用Bam H切割切割 G CCTAG G CCTAG G CCTAG G CCTAG GATCC G GATCC G GATCC G GATCC G 重組體重組體 G CCTAG G CCTAG GATCC G GATCC G G CCTAG G CCTAG GATCC G GATCC G 載體自連載體自連 目的基因自連目的基因自連 單一相同黏端連接單一相同黏端連接 不同黏端連接（定向克?。┎煌ざ诉B接（定向克?。?G CTTAA A TCTAG AATTC G GATCT A GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA Eco R切割位點(diǎn)切割位點(diǎn)Bg l切

60、割位點(diǎn)切割位點(diǎn) AATTC G A TCTAG AATTC G GATCT A AATTC G A TCTAG EcoR+ Bg l 雙酶切雙酶切 Eco R+ Bg l 雙酶切雙酶切 G CTTAA A TCTAG AATTC G GATCT A T4 DNA連接酶連接酶 15C 重組體重組體 目錄目錄 由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制 酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。 人工接頭人工接頭(linker)連接連接 通過其他措施產(chǎn)生黏端進(jìn)行連接通過其他措施產(chǎn)生黏端進(jìn)行連接 目錄目錄 人工接頭及其應(yīng)用人工接頭及其應(yīng)用 CCGAA