酶聯(lián)免疫吸附實驗

1、 掌握酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）的原理 熟悉酶聯(lián)免疫吸附實驗的操作方法 了解其他免疫標記技術(shù) 一、實驗目的一、實驗目的 二、實驗原理二、實驗原理 免疫學分析方法發(fā)展很快，特別是在使用 標記了的抗原和抗體的分析技術(shù)以后，使原來 許多經(jīng)典的分析方法在敏感性和特異性方面都 不能相比。繼50年代的免疫熒光免疫熒光（IF）和60年 代的放射免疫放射免疫(RIA)(RIA)分析技術(shù)之后，在70年代 初期又建立了用酶來標記抗原或抗體的分析技 術(shù)（酶免疫技術(shù)）。（酶免疫技術(shù)）。 是指用熒光素、放射性同位素、酶、發(fā)光劑或 電子致密物質(zhì)等作為示蹤劑，標記抗體或抗原進行 的抗原抗體反應。 特點：高度靈敏、特異、

2、快速，定性、定量、定位 分類：免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)、 免疫電鏡技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)和發(fā)光免疫測定。 免疫標記技術(shù)（免疫標記技術(shù)（immunolabelling technique） 免疫標記技術(shù) = 免疫標記技術(shù)的主要特點：免疫標記技術(shù)的主要特點： 高度特異性高度特異性、高度靈敏性高度靈敏性 是將抗原和抗體的特異性免疫反應與酶的催化反 應相結(jié)合而建立的一種免疫檢測技術(shù)。 就是利用酶標記抗體或抗原，以檢測相應抗原 或抗體的一種免疫學標記技術(shù)。 Ag + AbAg + AbE E AgAb AgAbE E + + 底物底物 呈色反應呈色反應 酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)(enzyme i

3、mmunoassay) 是一類常用的酶免疫技術(shù)。是將已知的抗原或抗體吸附在固 相載體表面，使抗原抗體反應在固相表面進行。 ELISA法是免疫診斷中的一項新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應用于多種 病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面 的免疫診斷。也已應用于大分子抗原和小分子抗原的定量 測定。 ELISA法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩(wěn)定及易于自動化操 作等特點。不僅適用于臨床標本的檢查，而且由于一天之 內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標本,因此，也適合于血清流行 病學調(diào)查。 本法不僅可以用來測定抗體，而且也可用于測定體液中的循環(huán) 抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。 酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗

4、ELISA（enzyme linked immunosorbent assay） ELISAELISA的基本原理有三條：的基本原理有三條： （1）抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，是 蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，并保 持其免疫學活性； （2）抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結(jié)合物， 而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學和酶學活性； （3）酶結(jié)合物與相應抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底 物的顏色反應來判定是否有免疫反應的存在，而且顏 色反應的深淺是與標本中相應抗原或抗體的量成正比 例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗結(jié)果。 ELISA過程包括：抗原吸附在固相載體上，這個過程

5、 稱為包被，加待測抗體, 再加相應酶標記抗體，生成抗 原-待測抗體-酶標記抗體的復合物，再與該酶的底物 反應生成有色產(chǎn)物。借助分光光度計的光吸收計算抗 體的量。待測抗體的量與有色產(chǎn)物成正比。同理也可 包被抗體，測定抗原含量。 由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應效果， 從而使測定方法達到很高的敏感度。 常用酶及其底物常用酶及其底物 1.1.辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶(HRP)(HRP) 常用底物：常用底物： (1)(1)鄰苯二胺鄰苯二胺(OPD)(OPD)：反應顯橙黃色，應避光，致癌性。反應顯橙黃色，應避光，致癌性。 (2)(2)四甲基聯(lián)苯胺四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(TMB)：反應后呈藍

6、色，無需避光，無致癌反應后呈藍色，無需避光，無致癌 性性, , 但水溶性差。但水溶性差。酶反應用HCL或H2SO4終止后，TMB產(chǎn)物由藍色呈黃色， 最適吸收波長為 450nm。 2.2.堿性磷酸酶堿性磷酸酶(AP)(AP) 常用底物常用底物 對硝基苯磷酸酯對硝基苯磷酸酯(p-NPP)(p-NPP)：產(chǎn)物為黃色。產(chǎn)物為黃色。 APAP靈敏性高與靈敏性高與HRPHRP，但不易獲得純品，穩(wěn)定性較，但不易獲得純品，穩(wěn)定性較HRPHRP差，且價差，且價 高，故應用不如高，故應用不如HRPHRP普及。普及。 peroxidase (POD) Colorimetric ELISA Substrates EL

7、ISA常用的幾種方法 (一)測定抗原的，主要有四種方法 1.競爭法 2.雙抗體夾心法 3.改良的雙抗體夾心法 4.抑制性測定法。 (二)測定抗體方面：所用的方法稱為間接法， 也 是目前最常用的方法. 三、實驗步驟三、實驗步驟 乙肝病毒存在三對抗原抗體系統(tǒng)乙肝病毒存在三對抗原抗體系統(tǒng) 1.即表面抗原（即表面抗原（HbsAg）和表面抗體（抗）和表面抗體（抗-HBs）、）、 2.e抗原（抗原（HBeAg）和）和e抗體（抗抗體（抗-HBe）、）、 3.核心抗原（核心抗原（HBcAg）和核心抗體（抗）和核心抗體（抗-HBc） 因核心抗原主要存在于肝細胞中，血清中不能表達，檢測困難，因核心抗原主要存在于肝

8、細胞中，血清中不能表達，檢測困難， 故只能檢測二對半而不能檢測三對，所以稱為二對半。故只能檢測二對半而不能檢測三對，所以稱為二對半。 實驗材料 1.HBsAg診斷試劑盒 2.HBsAg抗原（陽性對照），陰性血清，待 檢血清 微孔條已經(jīng)包被微孔條已經(jīng)包被HBsAb 1、編號：微孔條按順序編號。 2、加樣：分別加入待檢血清、陽性血清、陰性血清各50ul， 空白對照。 3、加入酶結(jié)合物：每孔中加入酶結(jié)合物50ul，空白對照孔不加， 輕拍混勻。 4、溫育：貼上膠紙，37溫育30分鐘。 5、洗滌：用洗滌液充分洗滌5次，洗滌完往后扣干（每次保持 30-60秒的浸泡時間）。 6、顯色：每孔加底物A、B各50

9、ul，輕拍混勻，封口，37暗 置10-15分鐘。 7、終止：每孔加終止液50ul，輕拍混勻。 8、測定：用酶標儀單波長450nm測定各孔OD值，并記錄結(jié)果， 讀數(shù)在加終止液10分鐘內(nèi)完成。 結(jié)果判定：結(jié)果判定： 1、臨界值（CO，cutoff）的計算：臨界值=陰性對照 孔OD均值N2.1。 2、陰性對照孔OD (optical density)均值大于0.1時重 新實驗，小于0.05時以0.05計算。 結(jié)果判定：樣品OD值S/ CO1者為陽性， 樣品OD值S/ CO1者為陰性。 四、注意事項四、注意事項 1、所有樣品按傳染源處理； 2、加試劑前應混勻，力求滴加準確； 3、加樣應加在板孔的底部，

10、避免產(chǎn)生氣泡并迅速完成； 4、洗滌時各孔均需加滿，洗滌必須徹底，防止產(chǎn)生假陽性； 5.溫育的時間要嚴格控制。 五、五、 ELISA的影響因素的影響因素 （一）固相載體 （二）抗原 （三）試驗樣品 （四）結(jié)合物 (五）洗滌劑與稀釋劑 （六）底物 （七）作用時間 （八）結(jié)果判斷 (九)試驗的重復性（精確度） （十）對使用儀器要求 自習自習 （一）固相載體（一）固相載體 在在ELISAELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應板及塑中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應板及塑 料管。但每批微量反應板對抗原或抗體蛋白質(zhì)的吸附性能料管。但每批微量反應板對抗原或抗體蛋白質(zhì)的吸附性能 是有顯著差別的。

11、實驗證明，吸附效果似乎與塑料的類型是有顯著差別的。實驗證明，吸附效果似乎與塑料的類型 及其表面性質(zhì)有關(guān)。特別是塑料制品在加工過程中因工藝及其表面性質(zhì)有關(guān)。特別是塑料制品在加工過程中因工藝 不同或受其他因素的影響而造成吸附性能的極大差異，甚不同或受其他因素的影響而造成吸附性能的極大差異，甚 至完全喪失吸附能力。因此，對每批制品在使用前，必須至完全喪失吸附能力。因此，對每批制品在使用前，必須 經(jīng)過實驗室鑒定經(jīng)過實驗室鑒定 。 （二）抗原（二）抗原 包被所用的抗原必須是可溶性的，而且要求是優(yōu)質(zhì)和 穩(wěn)定的制劑，純度和免疫原性要高。如果不純，由于抗原 中所含雜質(zhì)就會競爭固相載體上的有限位置，降低敏感性

12、和特異性。此外還應考慮到制備包被抗原不應破壞其免疫 學活性。 對大多數(shù)傳染病和寄生蟲病的血清學診斷中所用的抗 原并非要求十分嚴格，一般能用于補體結(jié)合試驗的可溶性 抗原均可用于ELISA。 對某些抗原必須進行提純，如病毒的組織培養(yǎng)和雞胚 培養(yǎng)物以及病毒接種動物的臟器等，它們當中存在著許多 非抗原的蛋白質(zhì)，必須設(shè)法除去，常用梯度超速離心或親 和層析法提純，不經(jīng)提純是不能使用的。 （三）試驗樣品（三）試驗樣品 血清、血漿或其他體液，均可作為ELISA的試驗樣品（標 本）。但應注意分離血清時，血液要求放置室溫中凝固 收縮，不宜置冰箱（4）中凝固，否則會使大部分IgM 和少量IgG喪失活性。關(guān)于人血清在

13、保存過程中抗體的穩(wěn) 定性報導尚不多。但一般認為作ELISA血清最好要新鮮， 若要貯藏，必須少量分裝保存于低溫冰箱，并防止反復 凍融。血漿可用肝素毛細管法采血，而血清可用濾紙片 法采血。 （四）結(jié)合物（四）結(jié)合物 在ELISA中，用酶標記的抗體或抗原統(tǒng)稱為結(jié)合 物，此為進行ELISA檢測的關(guān)鍵試劑。常規(guī)使用 ELISA法的主要問題是能夠簡便地制備酶結(jié)合物， 而此種制備好的酶結(jié)合物要求穩(wěn)定，具有很高的 酶活性，抗原或抗體的特異性，產(chǎn)量高及成本低。 （五）洗滌劑與稀釋劑（五）洗滌劑與稀釋劑 加入牛血清白蛋白（BSA）和吐溫20抑制非 特異性蛋白的競爭性吸附作用。 它們有良好的封阻作用 （六）底物（六

14、）底物 （1）底物在未被酶催化以前應該是無色的， 而經(jīng) 酶催化后有明顯的顏色變化，這樣可 使結(jié)果分辨清楚； （2）所顯色澤易干洗脫； （3）顯色后的產(chǎn)物要求穩(wěn)定，在作定量測定 時所產(chǎn)生的有色物質(zhì)應該是可溶性的； （4）價廉，易得而且無毒。 （七）作用時間（七）作用時間 (1) 任意確定一個時間，如20分鐘或30分鐘終止反應，測 定被檢標本和陽性參考標本的O.D值。這樣所得的數(shù)據(jù)要進 行校正，校正可按下列公式： 校正后O.D絕對值=被檢標本的O.D值*（1.0/陽性標本的 O.D值） (2) 制備好一批酶結(jié)合物后預試時間，在反應溫度固定時， 當陽性參考血清O.D值達到1.0時終止反應，記錄這個時

15、間， 如30分鐘，以后用本批酶結(jié)合物測定待檢樣品時都采用同 一時間終止反應，這個辦法不需要校正，比較方便。 （八）結(jié)果判斷（八）結(jié)果判斷 ELISA的試驗結(jié)果可用肉眼觀察顏色反 應的深淺作出判斷，也可用分光光度計作 精確測定。當然,后者更為正確。而肉眼觀 察更為簡便，而且也有一定正確性。 不論用哪種方法判定結(jié)果，每次都 要有陽性和陰性參考血清作對照，這樣可 以消除一些外界的影響因素。 ( (九九) )試驗的重復性（精確度）試驗的重復性（精確度） 記錄結(jié)果有下列幾種方法： 1、“+”或“-”：所有超過規(guī)定的O.D值（如O.D，0.4） 的標本均屬陽性，此規(guī)定O.D值是根據(jù)事先測定大量陰 性標本所

16、取得的，此規(guī)定值是陰性標本的上限?；蛘咭?一組陰性標本O.D平均值加23個標準差作為陽性閾值。 2、直接以O(shè).D值來表示，如0.4、0.7、1.2，O.D值越 大，陽性反應越強，但此數(shù)值是在固定實驗條件下得到 的結(jié)果，而且每次實驗都要有參考標本作對照。 3、以終點滴度表示：將標本作連續(xù)稀釋，最高稀釋度 能出現(xiàn)陽性反應者（即OD值仍大于陽性閾值，即為該 標本的滴度。 4、以“比值”表示：求出被檢標本的O.D值與一組陰性標 本O.D值的比值，例如為陰性標本的2倍或3倍，即為陽性， 比值小于2.1而大于1.5為可疑，1.5為陰性。 測定標本O.D值-空白O.D值 2.1 陰性對照O.D值-空白O.D

17、值 如在此測定時以空白校正“O”點。 5、以“單位”來表示：在測定被檢標本的同時，再測定一 個含已知單位數(shù)的陽性參考血清，用不同稀釋度作ELISA檢 測后，以O(shè).D值為縱坐標，單位數(shù)為橫坐標，畫出標準曲線。 以后可根據(jù)被檢標本的O.D值，從曲線上找出相應的單位數(shù)， 再乘于血清的稀釋倍數(shù)，即可得出被檢標本的單位數(shù)。 （十）對使用儀器要求（十）對使用儀器要求 所用儀器如吸管、燒杯試管都要清潔，用于酶 結(jié)合和底物的吸管和容器一定要分開。試劑要 求標準化 ELISA應用的范圍很廣，而且正在不斷地擴大，原則上 ELISA可用于檢測一切抗原、抗體及半抗原，可以直 接定量測定體液中的可溶性抗原。酶免疫試驗（

18、EIA） 結(jié)合光學顯微鏡或電子顯微鏡可進行抗原定位與結(jié) 構(gòu)的研究，用酶標記抗原或抗體結(jié)合免疫擴散及免 疫電泳可提高試驗的敏感性。在實際應用方面可作 疾病的臨床診斷、疾病監(jiān)察、疾病普查、法醫(yī)檢查、 獸醫(yī)及農(nóng)業(yè)上的植物病害的診斷檢定等。因此，它 和生物化學、免疫學、微生物學、藥理學、流行病 學及傳染病學等方面密切相關(guān) 。 六六、ELISA的應用的應用 ( (一一):):檢查抗原和半抗原方面檢查抗原和半抗原方面 1.內(nèi)分泌方面已經(jīng)用于檢測雌性激素、絨毛膜 促性腺激素、黃體素、胰島素、皮質(zhì)醇、促 甲狀腺素和孕酮等，其敏感性與RIA相當 2.在血液學方面可用于檢查凝固因子（如第 凝固因子）、紅細胞抗原及

19、結(jié)合球蛋白 （Hapto Globin）等 3.在腫瘤方面已試用檢查甲胎蛋白（AFP）癌 胚抗原（CEA），對前者的敏感性已達到與 放射免疫試驗相當?shù)乃?，但對CEA檢查的 敏感性較低，目前尚不能用于常規(guī)診斷 4.在傳染病的診斷方面正在日益擴大，其中 最滿意的是用于檢查乙型肝炎表面抗原 5.在免疫化學方面可用于檢測白蛋白，免疫 球蛋白的各種組份，也可用于檢測補體成 份，還能用于檢測蛇毒。 6.還可用于植物組織漿液中檢查植物病毒。 此外尚試用于測鉤體抗原及血吸蟲病的循 環(huán)抗原等。 (二):檢查抗體方面 用ELISA間接法檢查抗體，已獲得對多種傳 染病和寄生蟲病的血清學診斷，亦開始廣泛 用于現(xiàn)場流

20、行病學調(diào)查。 1.在寄生蟲病方面，它用于對瘧原蟲、阿米巴、 利日曼原蟲、錐蟲、血吸蟲、囊蟲、弓漿蟲、 肺吸蟲、肝吸蟲、血絲蟲、旋毛蟲病等血清 學診斷，這對人醫(yī)和獸醫(yī)都很重要。 2.在病原微生物方面已用于檢查鏈球菌、沙門 氏菌、布氏桿菌、結(jié)核桿菌、麻瘋桿菌、霍 亂弧菌、淋球菌、假絲酵母菌等的抗體，還 可用于破傷風抗毒素和霍亂弧菌抗毒素的測 定以及檢測斑疹傷寒立克次氏體感染后的抗 體，可作診斷 3.試用于病毒抗體檢查報告的有：流感病毒、腮腺炎病 毒、麻診、風疹、輪狀病毒、皰疹病毒、巨細胞病毒、 EB病毒、腺病毒、腸道病毒、腦炎病毒、黃熱病毒、 狂犬病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒等，其敏感性都超過目前 常用的

21、檢查方法 此外，還可用于鑒定病毒型別，例如 皰疹病毒。如能進一步改進方法用于檢查特異性IgM， 可以作為早期診斷以及了解體內(nèi)有關(guān)抗原的清除情況。 4.在免疫性疾病方面有試用作自身疫病抗體測定以及對 過敏的診斷，例如檢測各種過敏原的抗體、DNA抗體 及甲狀腺球蛋白抗體，紅斑性痕瘡抗體等等。 5.在衛(wèi)生學方面，可用于檢測食品中葡萄球菌腸毒素及 沙門氏菌毒素等等。 七七、ELISA存在的問題存在的問題 ELISA法由于本身所具備的優(yōu)越性，是一項 很有發(fā)展前途的血清學診斷方法，而且應 用的領(lǐng)域也越來越廣泛。但是我們認為 ELISA不是萬應良方，用它來代替一切，這 是不當?shù)摹Ｒ驗镋LISA法還有局限性：

22、 1、由于ELISA所用的抗原大部分還是混合的 可溶性抗原，所以對同一微生物寄生蟲或 其他物質(zhì)不同部位的抗原還沒有分開。 2、內(nèi)源性過氧化酶的普遍存在，如人腦組織 中，呼吸道分泌物的炎癥細胞中及某些病 毒的組織培養(yǎng)中均有內(nèi)源性過氧化物酶的 活力，常不易除去，如果用某些方法除去 時，則病毒 的抗原性亦受到破壞，對于用 ELISA檢測不利。 3.對ELISA法的非特異性評價的資料尚不夠完 善，因此，對出現(xiàn)一些非特異性反應的時 候，往往不易解釋。 4.固相載體的質(zhì)量常不統(tǒng)一，主要是原料及 制備工藝還不一致，致使不同批號的固相 載體有時本底值較高，有時吸附性能很差， 影響試驗結(jié)果。 5.試劑不統(tǒng)一，現(xiàn)在處于“八仙過海，各顯 神通”，標準還不能統(tǒng)一。 免疫標記技術(shù) = 免疫標記技術(shù)的主要特點：免疫標記技術(shù)的主要特點： 高度特異性高度特異性、高度靈敏性高度靈敏性 ELISAELISA的基本原理有三條：的基本原理有三條： （1）抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，是 蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，并保