動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)試驗(yàn)指導(dǎo)全面

1、實(shí)驗(yàn)篇實(shí)驗(yàn)一 實(shí)驗(yàn)器材的清洗實(shí)驗(yàn)物品（一）每一大組公用物品（每班分 6 大組）吸球 4 個(gè)、酒精棉球瓶?jī)蓚€(gè)、消毒水一瓶、吸瓶?jī)蓚€(gè)、計(jì)數(shù)板 1 塊、洗液缸一個(gè)、 95%酒精 1 瓶。（二）每一小組公用物品（兩人一小組）刻度吸管 5毫升 4支, 小漏斗 1個(gè)、 80-200 銅濾網(wǎng) 1塊、培養(yǎng)皿 2個(gè)、 l00 毫 升鹽水瓶 及塞子4個(gè)、10毫升鹽水瓶 及塞子1個(gè)、100ml培養(yǎng)瓶及塞子 4個(gè)、10ml 培養(yǎng)瓶及塞子 1 個(gè)、鑷子 1 個(gè)、剪刀 1 把、凍存管（ 1.5 毫升， 2毫升）2個(gè)、軟毛刷 2 個(gè)、塑料盆一個(gè)。（二）公用物品小濾器、大濾器 2個(gè)、 1000毫升量筒 2個(gè)、 100毫升量筒

2、 2個(gè)、家用剪刀、耐酸 乳膠手套長(zhǎng)的兩雙、短的四雙 、酒精一壺、玻璃棒幾個(gè)、 0.22卩m的小濾膜一盒、 電爐 3 個(gè)。清洗注意事項(xiàng)和要求（一）使用后的實(shí)驗(yàn)器材應(yīng)立即投入清水中。帶毒的玻璃器皿需先浸泡在5來(lái)蘇兒或 1鹽酸溶液中（依病毒的種類而定）1 天以上或高壓滅菌。（二）浸泡、煮沸、酸泡的器皿內(nèi)要充滿液體，不得有氣泡。（三）煮沸前的水面要高于器材5厘米，水沸后投入洗滌劑（直徑 35 厘米的鋁鍋，用洗衣粉 10 克左右）；若洗滌劑和實(shí)驗(yàn)器材同時(shí)從冷水煮至沸騰或使用過(guò)量洗劑均易 腐蝕玻璃表面，使玻璃堿化PH值上升。（四）軟毛刷的刷端已掉毛的應(yīng)該棄去，否則會(huì)損害玻璃。玻璃劃痕處易殘留洗滌 劑,會(huì)改

3、變培養(yǎng)液PH和毒害細(xì)胞。（五）浸泡器材的蒸餾水容器要專用，并做好標(biāo)記，如“蒸餾水1 盆”、”蒸餾水 2盆。（六）器材清洗干燥后，在以后各步操作時(shí)，手指不可接觸器材的使用端。清洗者 可戴一次性薄膜手套進(jìn)行操作，這樣省時(shí)又保證清洗質(zhì)量。（七）清潔物品應(yīng)及時(shí)包裝消毒，應(yīng)注意妥善保存，防止落人灰塵、蟑螂、螞蟻等 引起二次污染。（八）刷洗、酸泡后的器材要用流水振蕩沖洗；不得殘留洗滌劑、清潔液。操作方法（一）清洗液（俗稱酸液）的配制方法常用清潔液配方重鉻酸鉀100g，濃硫酸 200ml，蒸餾水800ml。以配置 10000ml 常用清潔液為例介紹如下：先在搪瓷盆或塑料盆中加入蒸餾水8000ml，稱取100

4、0g重鉻酸鉀，用玻璃棒攪拌直至溶解（可加熱以輔助溶解），待重鉻酸鉀液冷卻后，緩慢加入濃硫酸，邊加邊用玻璃棒攪動(dòng)，以混合液溫度不過(guò)快上升和 不出現(xiàn)重鉻酸鉀結(jié)晶為度。配好后倒入洗液缸中備用。新配制的清潔液呈棕紅色。當(dāng) 使用時(shí)間過(guò)久，清潔液的顏色變暗、發(fā)綠或混濁時(shí)，應(yīng)棄去（深埋地下），配制新的。配制、盛裝清潔液的容器應(yīng)防酸、耐熱、有較大的開(kāi)口，一般用瓷缸、玻璃制品或耐 酸塑料制品。（二）物品的清洗1 、 新購(gòu)置物品玻璃器皿清洗步驟清水浸泡半小時(shí)以上t簡(jiǎn)單刷洗t5%的稀鹽酸浸泡過(guò)夜t自來(lái)水沖洗t在洗滌劑中反復(fù)刷洗t自來(lái)水中充分沖洗t涼干（或50C烤干）t浸入清潔液中（俗稱浸酸）過(guò)夜t流水振蕩沖洗 20

5、遍t漓水t去離子水沖洗 34次或浸泡2次（每次24小時(shí)） t三蒸水沖洗兩次（或浸泡一次）t50C烤干，待包裝。2、用過(guò)的玻璃器皿清洗步驟帶毒玻璃器材用后應(yīng)立即浸入消毒水中，非帶毒的玻璃器材需浸入清水中浸泡t 刷洗t自來(lái)水沖洗t涼干（50 C烤干）T浸入清潔液中（俗稱浸酸）過(guò)夜T流水振蕩 沖洗20遍T(mén)漓水T去離子水沖洗 34次或浸泡2次（每次24小時(shí)）T三蒸水沖洗兩 次（或浸泡一次）t 50C烤干，待包裝。3、橡皮帽和橡皮塞的清洗 新購(gòu)置的橡膠制品（大小膠塞、橡皮膠頭）的洗滌方法如下；2%NaOH煮沸15分鐘宀流水沖洗宀 25獅HCI煮沸15分鐘宀流水沖洗宀去離子水煮沸20分鐘（或去離子水浸泡過(guò)

6、夜去離子水沖洗一次t三蒸水煮沸20分鐘t三蒸水沖洗一次t 50 C烤干備用.4、塑料制品（塑料培養(yǎng)板、針頭式加壓塑料小濾器）的清洗用后立即用流水沖洗t浸于自來(lái)水中過(guò)夜t用紗布或棉簽刷洗t流水沖洗t晾干t浸于清潔液中15分鐘t流水沖洗20遍t去離子水浸洗三次T雙蒸水中浸泡24小時(shí)t晾干備用。注射器薄膜濾器刷洗前先將上、下兩部分分開(kāi)，按上述方法清洗晾干后 將纖維薄膜濾片夾在中間（光面向下）擰緊上下兩部分，備用。5、不銹鋼除菌濾器的清洗先用洗滌劑刷洗濾器t流水沖洗15分鐘t去離子水沖洗 23次（去離子水浸泡24小時(shí)）t三蒸水沖洗 23次或浸泡24小時(shí)t干燥備用。6、鑷子、剪刀紗布擦去臟污T自來(lái)水洗凈

7、T酒精棉球擦試。7、金屬濾網(wǎng)自來(lái)水沖洗T蒸餾水沖洗T三蒸水沖洗。實(shí)驗(yàn)二 實(shí)驗(yàn)器材的包裝和消毒實(shí)驗(yàn)用品實(shí)驗(yàn)一中清洗的所有物品、脫脂棉一卷 / 班、紗布一卷 /班、高壓鍋一個(gè) /班、無(wú)菌 操作臺(tái)一臺(tái) / 組、牛皮紙 1 張/組，紙繩一卷 / 組、塞脫脂棉用的針頭或牙簽、記號(hào)筆一 個(gè)/ 組。實(shí)驗(yàn)方法（一）包裝1、包裝時(shí)手指與器材接觸面積要小，手指不能觸及器材的使用端。2、瓶類：需用局部包扎，用牛皮紙包扎。隨后單個(gè)或幾個(gè)一起用紙包好。3、玻璃管道口（尖吸管、移液管手持端、抽濾瓶下口端等）加脫脂棉，吸管、滴 管，隨后置玻璃吸管筒或銅制、鋁制吸管筒內(nèi)（內(nèi)放紗布） ，塞上棉塞或蓋上有孔蓋子 （內(nèi)外孔對(duì)好）

8、，外包上兩層牛皮紙，若沒(méi)有吸管筒應(yīng)每根吸管單獨(dú)包扎。4、帶蓋的瓶子或塑料離心管等物品應(yīng)擰松蓋子，包裝消毒后再擰緊。6、為防止已消毒品和未消毒品發(fā)生混淆，應(yīng)在包裝盒或包裝紙的表面注以符號(hào)或?qū)懮献帧啊?“”。（二）器皿的消毒干熱消毒主要用于玻璃器皿的消毒。160C、120分鐘，消毒后不要立即打開(kāi)箱門(mén)，以防止冷空氣驟然進(jìn)入引起玻璃炸裂，影響消毒效果。濕熱消毒即高壓蒸汽消毒：布類、膠塞、金屬器械、玻璃器皿以及某些培養(yǎng)用液等都可用此方法消毒滅菌。消毒時(shí)間是從壓力達(dá)到15磅，溫度達(dá)到121 C時(shí)算起。一般蒸氣消毒 30分鐘。橡皮手套和儲(chǔ)在小瓶?jī)?nèi)的溶液都不應(yīng)超過(guò) 15分鐘。消毒后，調(diào) 節(jié)活塞使壓力在 7 分

9、鐘左右均勻地下降到零。這樣能使任何可能存在的液體得以與周 圍蒸氣以相同的速度散熱，而不至于激烈的沸騰。各種物品有效消毒壓力和時(shí)間不同，一般要求如下：培養(yǎng)用液、橡膠制品l0磅 l0 分鐘布類、玻璃制品、金屬器械等 15 磅 20分鐘實(shí)驗(yàn)三 培養(yǎng)用液的配置實(shí)驗(yàn)用品實(shí)驗(yàn)器材：1000ml 的量筒 2 個(gè)， 1000ml 的燒杯 2 個(gè)，磁力攪拌器一臺(tái)，玻璃棒兩個(gè)，感量 0.1mg 的分析天平 ,100ml 的鹽水瓶若干 ,化學(xué)試劑 :NaCl,KCl, KH 2PO4 ,Na 2HPO4.12H2O 2.85g 或 Na2HPO4.2H 2O, NaHCO3, 小牛或胎牛 血清 , 胰蛋白酶 ,醋酸

10、。實(shí)驗(yàn)要求及方法（一）PBS液實(shí)驗(yàn)室常用含 0.85%,pH7.2的PBS(簡(jiǎn)稱pH7.2的PBS)1. PBS貯存液配法NaCl(AR) 8.5g ； KCl(AR) 0.2g ； KH 2PO4 0.27g ；Na2HPO4.12H2O 2.85g(或 Na2HPO2H2O 1.13g) 溶于 100ml 雙蒸水中。2. PBS應(yīng)用液配法取貯存液50ml加雙蒸水450ml即成,經(jīng)103kPa(121.3 C )15分鐘滅菌,置室溫或4C保存?zhèn)溆谩?. 配制BSS液的要求(l ) BSS液中各試劑規(guī)格為一級(jí)GR試劑(guara nteed reage nt )或二級(jí) AR( analytic

11、 reagent )試劑 .( 2)配制后液體呈桃紅色， pH 7.4 左右沒(méi)有混濁和沉淀。( 3 )含鈣鎂離子的物質(zhì)要單獨(dú)溶解.(4)可配制 10倍濃度的貯存液，濾過(guò)消毒，分裝，每瓶 10毫升；冰箱保存。 使用時(shí)每瓶加三蒸水至 l00 毫升。( 5)配制離散細(xì)胞用的消化液和細(xì)胞洗滌液時(shí)，宜采用無(wú)鈣、離子的DHanks液，或PBS液。(二) 血清滅活處理的方法 :1. 選用與血清瓶同規(guī)格的對(duì)照瓶一個(gè)。2. 對(duì)照瓶?jī)?nèi)放入與血清等體積的水。3. 溫度預(yù)試：使水浴鍋溫度保待在56C。放入內(nèi)45支溫度計(jì)，選擇23支溫度計(jì)，4. 血清滅活：血清瓶與帶溫度計(jì)的對(duì)照瓶一齊放入水浴箱中，待溫度計(jì)所示溫度 上升

12、至56C時(shí)定時(shí)30分鐘。5. 大瓶血清滅活后進(jìn)行分裝。6. 分裝后，抽樣做無(wú)菌試驗(yàn)，2070C保存。(三) 配制合成培養(yǎng)基(液)注意事項(xiàng)。1. 用三天內(nèi)制備的玻璃三蒸水配制培養(yǎng)液2. 按二周用量配制為宜，配量過(guò)多，存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)造成培養(yǎng)基老化、變質(zhì)、產(chǎn) 生沉淀。3. 培養(yǎng)液中各成分是否完全溶解的判斷方法：將培養(yǎng)液置室溫或4C冰箱30分 鐘后，觀察瓶底有無(wú)顆粒產(chǎn)生。4 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，在培養(yǎng)液中加入適量37C單獨(dú)溶解的NaHCO溶液。正常體細(xì)胞培養(yǎng)液中NaHCO量為2022克/升，腫瘤細(xì)胞為 1.51.7克/升。5干粉培養(yǎng)基不易溶于水，實(shí)驗(yàn)室采用空氣CO助溶法即將甲液在磁場(chǎng)上攪拌一段時(shí)間，當(dāng)甲液p

13、H值下降到5.8左右時(shí)（橙黃色）氨基酸和維生素基本溶解，在甲液內(nèi)再加入溶解有 NaHCO勺乙液，兩液混和后，營(yíng)養(yǎng)液pH值為7.07.1，抽濾后pH值上升0.1。此法操作簡(jiǎn)便，營(yíng)養(yǎng)液 pH值穩(wěn)定。（四）胰蛋白酶液胰蛋自酶是一種黃白色粉末， 水解蛋白質(zhì)時(shí)作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架.從而使細(xì)胞分離。胰蛋白酶的活力 是用解離酪蛋白的能力表示的，常用的有1：125和 1:250 兩種，即 1 份胰蛋白酶能解離 125份或 250 份酪蛋白。不同的細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶液的濃度、作用溫度和作用時(shí)間等 要求也不一樣。一般來(lái)說(shuō)，濃度越大、溫度越高、作用時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞的

14、分離能力 也越大，但超過(guò)一定限度就會(huì)損傷細(xì)胞。常用的胰蛋白酶液的濃度是0.25 利0.125 %，作用溫度37 C或室溫，pH7.4左右。Csi+ Mg+和血清的存在都會(huì)降低其活力 0.25%胰蛋白酶液的配制方法如下。1. 過(guò)濾消毒法。 按實(shí)驗(yàn)需要稱取酶粉，用少量D-Hanks液或PBS液將胰蛋白酶粉調(diào)成糊狀。 加適量D-Hanks液或PBS液（橙紅色），磁力攪拌溶解 溶解后的酶液（深紅色）濾過(guò)除菌，分裝， -20 C凍存。2. 高熱消毒法。 利用胰蛋白酶在酸性條件下有較好的熱穩(wěn)定性對(duì)其進(jìn)行高熱消毒。 、按實(shí)驗(yàn)需要稱取酶粉溶于1毫摩爾/升pH3.0的HCI中。 、酶液和2倍D Hanks液同時(shí)

15、在0.1兆帕，120C條件下滅菌20分鐘。 、兩液冷卻至室溫時(shí)，等量混勻。酶液濃度高時(shí)，消毒后有少量的沉淀，去除沉淀后，兩液等體積混勻。然后用10摩爾/升的NaOH調(diào)消化液PH值至7.2 （橙紅色或深紅色） 、經(jīng)計(jì)算，消毒后酶濃度下降50%。如消毒前酶濃度為0.1%0.5 %，消毒后為0.05 %O.25 %。高熱消毒法比過(guò)濾消毒法更加簡(jiǎn)便、安全、可靠。（五）PH調(diào)整液1、NaHCO溶液常用的濃度有 7.4 %、5.6 %、3.7 %三種，配制時(shí) 37C三蒸水溶 解后通過(guò)濾膜過(guò)濾除菌，分裝于安瓶中4 C冰箱保存，每支一次用完。使用時(shí)，NaHCO液要逐滴加入，并不時(shí)攪動(dòng)培養(yǎng)液。以防pH值過(guò)高。2

16、、10 %醋酸液 高壓滅菌，分裝，4 C冰箱保存。使用方法和要求同NaHCO液。（六）200 毫摩爾升 L- 谷氨酰胺L 谷氨酰胺 2.9222克（M=146.15）,加適量50C三蒸水溶解.定容至 100毫 升，濾過(guò)除菌，1毫升/安瓶，一 20C保存使用時(shí)每100毫升培養(yǎng)基中加1毫升谷氨 酰胺。（七）抗菌素液 加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌和霉菌的生長(zhǎng)，而不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。青霉素、鏈霉素液又稱雙抗溶液。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升 100單位。（八）細(xì)胞用液的分裝要求1. 使用嚴(yán)格無(wú)菌操作。盡量減少試劑在空氣中的暴露時(shí)間。2. 根據(jù)配量準(zhǔn)備分裝

17、瓶和瓶塞， 分裝瓶規(guī)格、 數(shù)量應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要準(zhǔn)備。 避免因 包裝瓶過(guò)大、貯液時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或反復(fù)凍融使用造成營(yíng)養(yǎng)成分丟失和微生物污染。按一次用量或一周內(nèi)用量挑選小包裝瓶。融化后的液體置4C保存。3. 分裝前做好分裝量標(biāo)記，分裝瓶?jī)?nèi)液體量要小于瓶容積的2/3。4. 做好分裝瓶標(biāo)記，包括試劑名稱、濃度、配制日期、組號(hào)。采用邊過(guò)濾邊分裝的方法。瓶口的液體用干酒精棉球擦去，火焰消毒，加塞包 裝。實(shí)驗(yàn)四 組織細(xì)胞的原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)操作要領(lǐng)和注意事項(xiàng)（一）原代細(xì)胞培養(yǎng)操作要領(lǐng)1、原代細(xì)胞混勻操作要領(lǐng) 火焰消毒吸管，用 Hanks液冷卻和濕潤(rùn)管內(nèi)壁（這是因?yàn)閯偡蛛x的組織細(xì)胞易粘在管壁上） 。 吸管頭插入管底。 用吸管

18、反復(fù)輕輕吹打組織塊。2、器械的使用操作要領(lǐng) 用工作臺(tái)消毒鑷子取浸泡在酒精中消毒的器械。 器械置無(wú)菌干紗布內(nèi)擦一下，迅速通過(guò)火焰，冷卻后使用。 用過(guò)的器械置另一加蓋的器皿中再消毒。 器械按浸泡消毒的順序使用 . 各套再消毒器械不可混用。3、除去組織塊多余水分的操作要領(lǐng) 用吸管將組織塊推向器皿一角，然后將有組織塊的瓶面翻向上方，吸去流向?qū)?cè) 的多余水分。注意：多余水分若不除去，會(huì)使組織塊剪切不細(xì)。消化后的細(xì)胞懸液清亮（細(xì)胞 數(shù)少），并可見(jiàn)消化液中有線狀或絮狀物漂浮。4、細(xì)胞計(jì)數(shù)操作要領(lǐng) 用吸管混勻待計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸液。 將一小滴細(xì)胞懸液從蓋玻片與載玻片交界部位滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)池中。 沉降 1 分鐘，低倍鏡

19、下計(jì)數(shù)血球計(jì)數(shù)板四大中格中的結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞，小細(xì)胞 團(tuán)計(jì)數(shù)為 l 。 計(jì)數(shù)時(shí)，如果細(xì)胞壓在格上，則數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右。然后按下式計(jì)算出 每毫升懸液中的細(xì)胞數(shù)。（四大中格細(xì)胞數(shù)/ 4 ）X 10000=細(xì)胞數(shù)/毫升注：細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，每中格體積為 0.1 立方毫米。（二）原代細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)1、 嚴(yán)格進(jìn)行動(dòng)物皮膚消毒，使用三套器械取材。新生動(dòng)物皮膚先用2碘酒液消 毒，成年鼠先用 3%5%碘酒液消毒，后再用 75%酒精消毒。2、嚴(yán)格進(jìn)行無(wú)菌操作，防止細(xì)菌、霉菌、支原體污染，避免化學(xué)物質(zhì)污染。3、吸取液體前，瓶口和吸管口應(yīng)行火焰消毒；吸取液體時(shí)，避免兩者碰撞。4、離心管入臺(tái)前，管口、管壁應(yīng)消毒。5

20、、實(shí)驗(yàn)者離開(kāi)超凈臺(tái)時(shí)，要隨即用肘部關(guān)閉工作窗。6、使用過(guò)的器械用酒精棉球擦去血污后，移入另一個(gè)器皿中繼續(xù)消毒，在浸泡器 械時(shí)剪刀口要叉開(kāi)放，鑷子彎頭要向下放，并加蓋消毒。7、器材使用時(shí)既要注意用火焰消毒，又要防止?fàn)C傷、燙死細(xì)胞。經(jīng)火焰消毒后的 吸管一定要用 PBS 液冷卻。超凈臺(tái)內(nèi)溫度、濕度較大，在夏天工作時(shí)臺(tái)內(nèi)散熱更慢。 因此進(jìn)行細(xì)胞懸液混勻、接種時(shí)，離火焰要稍遠(yuǎn)些。實(shí)驗(yàn)方法、雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)通常應(yīng)用胚胎或幼小動(dòng)物的組織來(lái)制備細(xì)胞培養(yǎng)，因?yàn)樗鼈兎至淹?，容?生長(zhǎng)。各種動(dòng)物的大多數(shù)組織細(xì)胞都能在體外培養(yǎng)。應(yīng)用最多的為腎、肺、皮膚等， 雞胚組織應(yīng)用最為普遍。（一）雞胚的處理1. 取1011日

21、齡的雞胚，在氣室部用5 %碘酒消毒，用酒精脫碘。2 用滅菌鑷子擊破和除去該部卵殼和卵膜。3. 以眼科彎頭鑷子撕破絨尿膜和羊膜，鉤住雞胚頭部，提出移于平皿內(nèi)。4. 去頭、腳、翅和內(nèi)臟。用Hanks液或PBS液洗去血液，重復(fù)三次。5. 用外科剪剪成12口帛大小的碎塊。力口 Hanks液約20m1混勻，稍靜置使 組織塊下沉。用滅菌吸管將混有紅細(xì)胞及碎片的懸液充分吸去。依同法再洗23 次， 至Hanks液不渾濁為止。也可將雞胚投入20m1注射器（不帶針頭）內(nèi)擠出，以替代剪碎。（二）蛋白酶消化1 .將0. 25%胰蛋白酶溶液（pH7 . 8）于37C水浴中預(yù)熱2 棄去 Hanks 液。3 按組織塊的 3

22、5 倍，將預(yù)熱好的 025%胰蛋白酶溶液加于裝有雞胚的 玻璃容器中。每個(gè)雞胚約需胰蛋白酶液 l0ml 。4. 將玻璃容器放在 37C水浴中，每隔5min輕輕搖勻一次。5 如發(fā)現(xiàn)組織塊變得散松，沉降漸變緩慢時(shí)即表示消化足夠，約需l 5 20min6. 將玻璃容器取出水浴，靜置12min，吸去胰蛋白酶液，加含犢牛血清 的Hanks液約20m1，輕輕搖勻后吸去，如此重復(fù)一次，目的是洗去殘余 的胰蛋白酶和抑制其消化作用。7 加入生長(zhǎng)液， 按每個(gè)雞胚 10m1 左右， 以粗口吸管吹吸數(shù)次， 使細(xì)胞脫落 分散。& 靜置12mi n,使組織塊下沉，細(xì)心地輕輕吸出細(xì)胞懸液，另置一25m1玻璃容器中。如此反復(fù)數(shù)

23、次，將各次收獲的細(xì)胞懸液合并一起 .9 用滅菌紗布過(guò)濾一次,除去偶爾吸入的組織塊。必須注意的是,每次吹 吸次數(shù)不宜過(guò)多,一般 5 6 次即可,太多細(xì)胞容易受損。（三）細(xì)胞計(jì)數(shù)可借染色法區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞,并計(jì)算每毫升細(xì)胞個(gè)數(shù)。1 .配制臺(tái)盼藍(lán)溶液取0. 2g臺(tái)盼藍(lán)，溶于100m1磷酸平衡鹽水中貯存， 臨用前再稀釋 10 倍。這是一種活體染液，完整的活細(xì)胞不被染色，而細(xì)胞膜受 損后才染成藍(lán)色。也可用0. 01%結(jié)晶紫液（用O.lmol / L檸檬酸配制）染色，這時(shí)細(xì)胞核被染 成藍(lán)紫色，但只能計(jì)數(shù)而無(wú)法區(qū)分死活。 ）2 .取搖勻的細(xì)胞懸液 1滴加于玻片上，加染液 4滴，混勻后靜置45min。3.

24、吸取細(xì)胞懸液少許，滴到血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，計(jì)算四角 4 個(gè)大格內(nèi)完整的 細(xì)胞數(shù)， 如幾個(gè)細(xì)胞聚集一起， 則按一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。 然后將活細(xì)胞總數(shù)換算成每 m1 中細(xì)胞數(shù)，最后還要乘以 5，因?yàn)榧?xì)胞已被染液稀釋 5 倍。活細(xì)胞數(shù)/ ml =（ 4大格活細(xì)胞總數(shù)/ 4）X 10 000 X 5（四）稀釋和分裝根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果，以生長(zhǎng)液配成每ml含2040萬(wàn)細(xì)胞2 的懸液，分裝細(xì)胞培養(yǎng)瓶。微量細(xì)胞培養(yǎng)板每孔（0.3cm 2）0.1m1 ；轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)每 100ml 容量加 10m1 細(xì)胞懸液。必須注意，瓶口務(wù)必塞緊，不能漏氣，否則在培養(yǎng)過(guò)程中C02 不斷逸出而使?fàn)I養(yǎng)液迅速變堿，而且容易被細(xì)菌污染。（五）生長(zhǎng)液

25、和維持液的配方雞胚細(xì)胞較易生長(zhǎng)，常用者有下列兩種。1. 0. 5 %乳蛋白水解物 95 %犢牛血清 5%青霉素 100IU/ m1鏈霉素 100Ug / m1 此為生長(zhǎng)液的配方，如為維持液可將血清量減至12%即可。2. Eagle 氏 MEM 95 %犢牛血清 5%青霉素 100IU/ m1鏈霉素 100Ug / m1 此為生長(zhǎng)液的配方，如為維持液可將血清量減至 12%即可。細(xì)胞懸液分裝后置 37 C溫箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，幾小時(shí)后細(xì)胞即可貼附于瓶壁，2448h 長(zhǎng)成單層，此時(shí)即可供接種病毒之用。如發(fā)現(xiàn)液體渾濁（有細(xì)菌或酵母生長(zhǎng)）或有菌絲體 （ 有霉菌生長(zhǎng) ），應(yīng)立即棄去。 如為微量細(xì)胞培養(yǎng)，可用滌綸

26、 膠布將板面密封，置 C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。如為轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，可將培養(yǎng)瓶放置在轉(zhuǎn)鼓 上，以612r /h的速度在37C培養(yǎng)。、兔腎上皮細(xì)胞培養(yǎng)一）實(shí)驗(yàn)材料：1. 兔嬰（出生48小時(shí)內(nèi)尚未進(jìn)食 兔嬰，體重300500g）。2. 培養(yǎng)基與試劑：含10%FBS或CS）的MEM CMF-HankS液、0. 25胰 酶/CMF-PBS3. 器具：各種吸管、離心管、 80100 目尼龍網(wǎng)或不銹鋼篩網(wǎng)、三角燒瓶、培 養(yǎng)皿、瓶，手術(shù)刀、剪、鑷， 1%新潔爾滅消毒缸、解剖板等。（二）實(shí)驗(yàn)方法1. 取腎：取 2 日齡內(nèi)兔嬰，將其斷頸處死后，放入 1%新潔爾滅溶液中浸泡 lOmin 。 取出兔嬰，放置瓷盤(pán)內(nèi)的木板上，背部向上

27、，四腳釘住固定。用碘酒，酒精消毒背部 皮膚，用剪刀和鑷子將背部皮膚剪開(kāi)剝?nèi)?。另?yè)Q剪刀，在腰部背脊長(zhǎng)肌兩側(cè)剪開(kāi)腹腔 如蠶豆大的缺口，即可看到腎。用尖頭鑷子夾緊腎蒂，剪斷血管及結(jié)締組織等，將腎 提出放在平皿內(nèi)。2. 組織處理及消化：剪下腎皮質(zhì)部分，移入小三角燒瓶?jī)?nèi)，用小剪細(xì)剪成1mm左右的組織塊，用 PBS或Hanks液洗3次，吸棄上清液，視其沉下的組織塊量，約加10倍量的0.25%胰酶，于37C水浴中消化30min。以下步驟及方法與雞胚細(xì)胞制備相同， 不贅述。3. 胰蛋白酶消化分熱消化和冷消化兩種。 熱消化與雞胚成纖維細(xì)胞相同， 但時(shí)間必須延長(zhǎng)到 25 30min。如欲獲得更多的細(xì)胞，可在消化瓶

28、內(nèi)預(yù)放幾十粒玻珠，消化后轉(zhuǎn)動(dòng)消化瓶使細(xì) 胞脫落。在吸出的胰酶細(xì)胞懸液中加入犢牛血清2m1以終止酶的作用。剩下的組織塊另加胰蛋白酶液繼續(xù)消化 20min，重復(fù)上述步驟12次，即可將組 織幾乎消化殆盡。 許多實(shí)驗(yàn)室喜用冷消化，即在組織塊內(nèi)加入 7一 10倍量的胰蛋白 酶液，在4C冰箱內(nèi)消化過(guò)夜，翌日晨取出，按熱消化法處理。4、細(xì)胞計(jì)數(shù) 同雞胚成纖維細(xì)胞。5、生長(zhǎng)液和維持液的配方1 ）.0.5乳蛋白水解物 45Eagle 氏 MEM 45 犢牛血清 10 青霉素 100 IU m13 5 。3 5。細(xì)胞濃度為50萬(wàn)/ ml。在鏈霉素 100 Ug m1 此為生長(zhǎng)液的配方，如為維持液可將血清量減至2

29、） Eagle 氏 MEM 90 犢牛血清 10 青霉素 100 IU m1镕霉素 100 Ug m1 此為生長(zhǎng)液的配方，如為維持液可將血清量減至6、細(xì)胞懸液的稀釋和分裝與雞胚成纖維細(xì)胞同，37C培養(yǎng)45日可以長(zhǎng)成單層。、雞胚心肌塊的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用品1. 孵育 9 11 日齡雞胚一個(gè)2. 培養(yǎng)液：MEM+20小牛血清（CS）, CS 無(wú)鈣鎂 Hanks 液（CMF-Hanks）或 pH=7.2 的 PBS。3. 器具：各種吸管、彎頭吸管，60mm培養(yǎng)平皿或25cni培養(yǎng)瓶，90mm玻璃平皿 一個(gè)，60mm玻璃平皿3個(gè)，鑷子、眼科剪、吸管架，雞卵架等。實(shí)驗(yàn)方法1. 雞胚摘出： 取911日齡雞胚于卵架

30、上，用碘酒、酒精消毒雞胚氣室側(cè)，用鑷子敲開(kāi)氣室部，剪開(kāi)氣室部蛋殼，用鑷子摘除卵殼膜，輕輕夾住雞胚頸部取出雞胚于無(wú)菌90mm平皿內(nèi)，注意不要強(qiáng)拉雞胚頸部。2. 制備心肌塊：用鑷子固定雞胚， 從腹部向胸部切開(kāi)， 用鑷子摘除心臟， 移入裝有 10mlCMF-Hanks液或pH=7.2的PBS的60ml的平皿內(nèi)，用刀將心房和血管等切除，心室放CMF-Hanks液或pH=7.2的PBS的平皿中充分洗滌，然后將心室移入另一裝有CMF-Hanks液或pH=7.2的PBS的平皿內(nèi)，用刀將心室切成適當(dāng)大小 （12口命小塊，于CMF-Hanks液或 pH=7.2的PBS液中洗滌數(shù)次，轉(zhuǎn)入裝有少量生長(zhǎng)液的平皿中暫存

31、。3. 培養(yǎng)與觀察：將組織小塊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每只體積為 25ml 的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)可放置 2030 塊組織 輕輕地傾斜擺動(dòng)培養(yǎng)瓶，使組織小塊均勻地分布于生長(zhǎng)細(xì)胞瓶?jī)?nèi)壁表面上。把瓶蓋蓋 上，放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，靜置 18-24 小時(shí)，添加少量培養(yǎng)液。待外植塊均巳粘附玻壁上后，約經(jīng)過(guò) 2 天后，在每只培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)添加足量培養(yǎng)液。 培養(yǎng)至 3 5 天后，于相差顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞的形態(tài)及節(jié)律性收縮現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)五 傳代細(xì)胞的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)材料1 蛋白酶消化液：主要是用無(wú)CsT Mg+的平衡鹽溶液或者 PBS配制的0.08%0.25%（m/V，下同）胰蛋白酶溶液，其中也可以再補(bǔ)加0.02%的EDTA或 1 mmol/ L

32、）。有時(shí)候還需要 0.02% 0.03%或 200IU/ml 的膠原酶溶液甚或其它的消化液。2培養(yǎng)器皿：一般與進(jìn)行原代培養(yǎng)時(shí)所用類型相同。所需數(shù)量須根據(jù)擬傳代的規(guī) 模而定。3.培養(yǎng)液及平衡鹽溶液：同原代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)方法（一）貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法1 取需要傳代的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶數(shù)次，懸浮起浮著在細(xì)胞表面的碎 片，然后連同生長(zhǎng)液一起倒出，用無(wú)鈣鎂的磷酸平衡鹽溶液洗滌2 次。2. 從無(wú)細(xì)胞面加入 0. 25% 0.1%胰蛋白酶液或0. 02% EDTA液 （或兩者等量混合）45ml，將該培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，使消化液浸沒(méi)細(xì)胞層。3. 在37C放置815min。中途取出，用肉眼或低倍顯微鏡觀察。如單層邊

33、緣略有卷邊，或低倍下細(xì)胞間已有縫隙，細(xì)胞層出現(xiàn)布紋孔，即表明消化適度。（如果細(xì)胞 突起縮回、細(xì)胞之間間隙增大、細(xì)胞近乎縮成圓形，應(yīng)立即終止消化。 ）4. 將培養(yǎng)瓶倒置，使細(xì)胞不再接觸酶液，繼續(xù)在37C放置幾分鐘。5. 取出，傾去酶液越徹底越好，加入生長(zhǎng)液后用吸管吸吹數(shù)次，使細(xì)胞分散。6. 裝入離心管，離心 （1000r min， 5min） 。除去上清含酶溶液。7. 用培養(yǎng)液將細(xì)胞沉淀重新懸浮。計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度。8每瓶細(xì)胞單層可擴(kuò)大分裝24瓶。9. 37 C靜置培養(yǎng)12天又可長(zhǎng)成單層（二）懸浮細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法 懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞可直接將培養(yǎng)物吸取一部分或者將培養(yǎng)物離心后再分成幾部分并 接種培養(yǎng)即

34、可。1 、將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，離心 （1000r/min ， 5min） 。2、吸出上清液。給細(xì)胞沉淀加入培養(yǎng)液重新懸浮。3、分別取部分細(xì)胞懸液，接種在數(shù)個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)。4、補(bǔ)加培養(yǎng)液。入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。若為直接分部傳代，僅需停止攪拌或搖動(dòng)，待細(xì)胞自然下沉。吸去大部分上清培 養(yǎng)液，再用吸管吹勻培養(yǎng)物成細(xì)胞懸液。分別吸取部分細(xì)胞懸液接種在數(shù)個(gè)培養(yǎng)器皿 內(nèi)。補(bǔ)加培養(yǎng)液。入培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)六 病毒的接種實(shí)驗(yàn)用品實(shí)驗(yàn)試劑： 青霉素，鏈霉素， Hanks 液，細(xì)胞維持液。實(shí)驗(yàn)儀器： 離心機(jī)，水浴鍋，吸管，顯微鏡，培養(yǎng)箱。實(shí)驗(yàn)材料： 病料，長(zhǎng)滿單層的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)方法首先要選擇對(duì)特定病毒易感的細(xì)胞培養(yǎng)。

35、 當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)成單層后即可接種病毒或待檢 病料。一般按下列步驟進(jìn)行。1 將病料制備成1： 10勻漿，離心沉淀，取上清，每 ml加青霉素1000IU和鏈霉素lOOOUg,室溫放置1 一 2min。如病料為糞便，則抗生素量要增加10倍。2. 棄去細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)液，用預(yù)熱至 37C的Hanks液（pH7.2 7. 4）洗一次，以除 去細(xì)胞碎片等。3. 滴加病料上清，接種量約為生長(zhǎng)液的110，原則是使細(xì)胞單層都能接觸病料為度。在37C放置1 /22h,使病毒吸附于細(xì)胞膜。在此期間可以轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶23次，以防部分細(xì)胞末接觸接種物。4. 棄去接種液，用 pH7. 2Hanks 液將細(xì)胞單層洗 23 次，以除去

36、接種液內(nèi)可能 存在的對(duì)細(xì)胞有毒的物質(zhì)，糞便等特別要注意。如果接種液就是細(xì)胞培養(yǎng)傳代病毒， 則可省略此步驟。5. 按生長(zhǎng)液量換加維持液，在 37 C培養(yǎng)。6逐日在低倍顯微鏡下檢查 CPE或進(jìn)行其他試驗(yàn)。接種病毒后第 2天如發(fā)現(xiàn)維 持液渾濁，則表明有細(xì)菌污染，應(yīng)該棄去。真菌污染常在較后幾天才能發(fā)現(xiàn)。上述為大多數(shù)病毒的常規(guī)接種方法。有些如細(xì)小病毒需要在分裂旺盛的細(xì)胞中才能生長(zhǎng)，這時(shí)病毒接種應(yīng)在細(xì)胞貼壁后不久進(jìn)行，甚至在細(xì)胞分裝時(shí)接種。還有一些 細(xì)胞結(jié)合性病毒如馬立克氏病毒等，接種的病料必須是完整的感染細(xì)胞而非上清液， 接種后細(xì)胞單層不能用 Hanks液將感染細(xì)胞洗去。實(shí)驗(yàn)七 空斑形成技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理病毒

37、的空斑猶如噬菌體的噬斑，故空斑和噬斑（又稱蝕斑 ）含義相同。動(dòng)物病毒的空斑形成試驗(yàn)。先制備成致密無(wú)孔的細(xì)胞單層；再感染適當(dāng)量的病毒；爾后加瓊脂復(fù) 蓋和染色，加瓊脂復(fù)蓋的用意有二：其一是將每個(gè)病毒體都限制在它原來(lái)吸附和進(jìn)入 的地方；其二，以襯托出空斑形成的地點(diǎn)。因每個(gè)病毒體只能在它吸附和進(jìn)入的地方 繁殖，故 1 個(gè)病毒體只形成一個(gè)空斑。換言之， 1 個(gè)空斑亦相當(dāng)于 1 個(gè)病毒體。操作方法1 .在細(xì)胞培養(yǎng)瓶或平皿中使細(xì)胞長(zhǎng)成密集的單層， 不能有空隙 （細(xì)胞接種濃度不6低于 1 x l 0 / m1）。2 .吸去生長(zhǎng)波，用維持液將細(xì)胞單層洗一次。3 .病毒檢樣用Hanks液（pH7. 27. 4）作

38、連續(xù)10倍稀釋。要能檢出孤立可數(shù)的空斑，病毒濃度最好在100500TCID5。/ ml,稀釋時(shí)要注意。每一濃度接種2個(gè)培養(yǎng)瓶。接種劑量隨容器大小而異。直徑6cm的平皿接種量約0. 2ml，以此類推。4 將培養(yǎng)瓶在37 C培養(yǎng)60min，使病毒吸附于細(xì)胞，每 15min將培養(yǎng)瓶輕輕轉(zhuǎn) 動(dòng),使接種液分布均勻。5 .將培養(yǎng)瓶放在水平的桌面上。6 .加入融化后冷卻到 4244C的瓊脂覆益層，厚度約3mm覆蓋層的組成如下：2. 25高級(jí)瓊脂 （或瓊脂糖 ） 40ml ； 2 倍濃縮營(yíng)養(yǎng)液 50m1 ； 犢牛血清 5m1 ； 1 ： 1000中性紅溶液 5m1 ；青霉素 100IU /ml； 鏈霉素 10

39、0Ug /m1。先將瓊脂用雙蒸水配成 2. 25%濃度，經(jīng)121 C高壓蒸汽滅菌15min。使用前在 100 C水浴中融化，然后使水浴冷卻到 44C。這時(shí)將其余成分放在水浴中預(yù)熱 15min。 把它們加入瓊脂中，輕輕混勻，不能產(chǎn)生氣泡。這時(shí)加入7% NaHCO使 pH調(diào)到7. 27. 4。7 .瓊脂凝固后將瓶（平皿）翻轉(zhuǎn)，在37C培養(yǎng)。如果是培養(yǎng)瓶，只需將瓶塞塞緊即可；如果是平皿，應(yīng)將其放在C0a培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，以保持適宜的CQ濃度和濕度。8. 培養(yǎng) 3 4 天后計(jì)算空斑數(shù)。空斑呈淡白色,背景呈談紅色。實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1 .瓊脂的質(zhì)量是空斑形成的關(guān)鍵,必須選用高級(jí)瓊脂或瓊脂糖。2 .瓊脂加入前溫度切

40、忌太高，以免影響細(xì)胞活力。在44C水浴中加入 NaHCQ后保留時(shí)間不能超過(guò) 20 min ,否則 C02 逃逸太多而使?fàn)I養(yǎng)液變堿。3 .只要細(xì)胞不衰老,培養(yǎng)時(shí)間盡量長(zhǎng)些,使空斑充分發(fā)育。4 .中性紅常對(duì)細(xì)胞有毒性,有人建議在瓊脂層中不加。在培養(yǎng)2 3天后再加第二覆蓋層（用雙蒸水配制1 %瓊脂，內(nèi)含0. 01%中性紅）。此層的厚度約1mm即可。 更為簡(jiǎn)單的辦法是在檢查空斑前瓶?jī)?nèi)加入滅菌的0. 01%中性紅溶液，在 37C放置2h,傾去后觀察。也可用其他染料代替中性紅，如臺(tái)盼藍(lán)，前者只染活細(xì)胞，后者只染死細(xì)胞。5 .中性紅是光敏活體染料, 感染細(xì)胞如在可見(jiàn)光下培養(yǎng)即不能產(chǎn)生正常的空斑。觀察時(shí)光線不

41、宜太強(qiáng),時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。中性紅溶液最好現(xiàn)配現(xiàn)用,或在暗處短期保存。實(shí)驗(yàn)八 細(xì)胞的保存細(xì)胞的凍存方法1實(shí)驗(yàn)用品對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞（證明無(wú)支原體污染）；0.25%胰蛋白酶；BSS 培養(yǎng)液；DMSO優(yōu)質(zhì)無(wú)色）；吸管；離心管；細(xì)胞凍存管 （2m1）;酒精燈；標(biāo)記小牌和 線繩；紗布小口袋 （三層）。2實(shí)驗(yàn)程序（1）細(xì)胞：選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞；收集細(xì)胞 24 小時(shí)前換液一次；（2）計(jì)數(shù)：按常規(guī)法把細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)、令細(xì)胞密度達(dá)5 x 106/m1（如一瓶細(xì)胞數(shù)量不足則用兩瓶或更多的細(xì)胞 ），離心去上清；（3）凍存液：先用培養(yǎng)液 9份+ DMSO 1份（或甘油）配成10%勺DMS礫存液；按上 法一滴滴加入離心管

42、中，然后用吸管輕輕吹打令細(xì)胞重懸；（4）分裝：分裝入無(wú)菌細(xì)胞凍存管中，每管加 1.5 毫升細(xì)胞懸液；（5）封口：用塑料凍存管時(shí)擰緊瓶口即可；如用火焰封閉安瓿口后，仔細(xì)檢查，定 要封嚴(yán)，必要時(shí)需進(jìn)行檢驗(yàn)。為安全起見(jiàn)，把安瓿縫入紗布小袋中，以防液氮浸入后，融解時(shí)因受熱發(fā)生爆 炸傷人；紗袋一端系以線繩，末端扎有小牌，注明細(xì)胞名稱，凍存日期，以便日后查 找。（6）凍存：當(dāng)前已有專用細(xì)胞凍存器，在無(wú)凍存器勺情況下，可用手工辦法：把凍 存物先放置0c 30min , -20 C冰箱中放置2小時(shí)，液氮上層過(guò)夜后直接投入液氮罐。檢驗(yàn)方法：將安瓿浸入預(yù)冷的 0. 05%美藍(lán)溶液中，在 4C放置30min。這樣一

43、 方面可使冷凍保護(hù)劑 （ 二甲基亞硯 ） 與細(xì)胞之間平衡， 另一方面檢查安瓿封口是否嚴(yán)密。 如發(fā)現(xiàn)美藍(lán)液進(jìn)入安瓿，即證明封口滲漏。這是極其危險(xiǎn)的務(wù)必毫無(wú)保留地將其棄去 或重封。因?yàn)榱粲形⒖椎陌碴吃谝旱拗幸旱獣?huì)滲入，以后取出時(shí)液氮會(huì)迅速氣化而 導(dǎo)致安瓿爆炸。細(xì)胞復(fù)蘇的方法1實(shí)驗(yàn)用品75%酒精；培養(yǎng)液；BSS離心管；搪瓷罐或鋁鍋(帶蓋)。2. 實(shí)驗(yàn)程序(1) 從液氮罐中取出凍存管2迅速放入盛有 36C37C水的搪瓷罐或鋁鍋中，扣上蓋并不時(shí)搖動(dòng)，盡快解凍，(3) 剪開(kāi)紗布口袋，取出安瓿，用 70%酒精擦試消毒后，凈化臺(tái)上打開(kāi)蓋 ( 如為玻 璃安瓿則折斷安瓿頸部 ) ；用吸管吸出細(xì)胞懸液，裝入離心管

44、中，再補(bǔ)加 10ml 培養(yǎng)液， 吹打使細(xì)胞懸??；(4) 低速離心 (5001000轉(zhuǎn)/分)5 分鐘，取上清后再重復(fù)用培養(yǎng)液漂洗、離心。(5) 加入培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，再移入培養(yǎng)瓶中，置溫箱培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液 后再繼續(xù)培養(yǎng)。注意：安瓿內(nèi)凍存細(xì)胞數(shù)量要充分， 在融解后能允許做 1:10 倍或 1:20 倍的稀釋 (細(xì) 胞數(shù)/毫升)，一般每瓶細(xì)胞接種濃度為 5X 105/ml，因此凍存密度應(yīng)達(dá)到 107/m1，在稀 釋20倍時(shí)，仍能保持 5X 105/m1數(shù)量。實(shí)驗(yàn)九 小鼠骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備實(shí)驗(yàn)原理骨髓細(xì)胞具有豐富的細(xì)胞質(zhì)和高度的分裂活性，因些細(xì)胞中有著較多的分裂相。 在試驗(yàn)中需加以秋水仙

45、素或秋水仙酰胺， 使分裂細(xì)胞阻斷在有絲分裂中期， 再經(jīng)離心、 低滲處理及固定、滴片步驟，便可制作較好的骨髓細(xì)胞的染色體標(biāo)本。此法不需無(wú)菌 操作，設(shè)備簡(jiǎn)單，所用時(shí)間較短。實(shí)驗(yàn)用品實(shí)驗(yàn)試劑：秋水仙素 350 卩 g/ml 10g 0.25ml,20g 0.5ml, 0.85NaCI 溶液,50% 酒精溶液；0.075mol / L KCl,37 C;固定液：甲醇：冰醋酸=3:1。共用物品：離心機(jī)，顯微鏡， Giemsa 染色液。每組所需物品：注射器 1 毫升 2 個(gè)， 10 毫升注射器 1 個(gè)，離心管 5 個(gè)，剪刀兩把， 小白鼠 5 只，微量移液器 1 把（帶槍頭） ，玻片 5 片，酒精棉球。實(shí)驗(yàn)

46、操作方法1. 處死小鼠前36小時(shí)向小鼠腹腔中注入秋水仙素 （按每克體重58卩g量注 入）。2. 斷頸椎處死小鼠。3. 剪開(kāi)腹腔，剝離出兩條后肢，由股骨關(guān)節(jié)處剪斷，取下后肢（ 注意不要將股骨 剪斷 ） 。4. 將骨外面的肌肉盡可能剪掉，剩下附著在骨骼上的少量肌肉，用棉花或紗布蘸 75的酒精來(lái)回搓，直至骨骼外不帶任何肌肉為止。5. 剝離股骨，并將股骨頭的兩端剪去少許，使共成為平面，然后用較細(xì)的注射器 針頭小心插人骨髓腔中，將骨髓腔穿通 （不可用力過(guò)大，以防骨骼破裂 ）。6將1m1注射器的針頭插入骨髓腔1 /2部位，然后將股骨浸入盛有 0. 85%生理鹽水的離心試管中，操縱注射器將骨髓細(xì)胞沖洗到離心

47、試管內(nèi)，直至骨髓腔呈白 色為止。丟棄股骨，拍打離心試管中的細(xì)胞使其散開(kāi)。7.用 1000轉(zhuǎn)分鐘的速度離心 810分鐘，棄去上清液，留下細(xì)胞。向細(xì)胞中 加入46ml在37C預(yù)熱的0. 075mol/L KCI溶液，拍打均勻，置 37C恒溫箱中20 40 分鐘進(jìn)行低滲處理。在此期間同時(shí)配制固定液，即甲醇加冰醋酸（3 ：1），放入密閉的瓶中，置46C冰箱中備用。8 .低滲完畢，立即加入 lml 新配制的預(yù)冷的固定液，并用吸管抽打均勻，進(jìn)行 預(yù)固定。然后用 1000轉(zhuǎn)分鐘的速度離心 810分鐘。9. 棄去上清液，沿離心管壁向沉淀的細(xì)胞團(tuán)中徐徐加入新配制并預(yù)冷的甲醇冰醋酸固定液46ml，用吸管輕輕地將固

48、定液與細(xì)胞團(tuán)抽打混勻，置室溫下固定2530 分鐘。10. 用 1000轉(zhuǎn)分鐘速度離心 810分鐘，棄去上清液。11再次加入固定液，抽打均勻后，將試管置于4C冰箱中固定30分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間，必要時(shí)也可過(guò)夜。12. 用 1000轉(zhuǎn)分鐘速度離心 810分鐘，棄去上清液，13. 根據(jù)管底沉淀細(xì)胞的多少，加入新配制的固定液0. 30. 5m1,并用吸管將 細(xì)胞團(tuán)輕輕吹打散開(kāi)，形成懸浮液。14. 滴片：將干凈的載玻浸入 50%酒精溶液中，并置 4C冰箱中預(yù)冷。使用前取 出載玻片放入冰柜 510分鐘后取出，用吸管吸取細(xì)胞懸液從一米高處滴在預(yù)冷的載 玻片上，每張載片上滴 12滴但勿重疊，然后用鑷子夾住載玻片的一

49、端，在酒精燈火 焰上過(guò)一下，使染色體更好地散開(kāi)。15. 染色：用 pH6. 8 的磷酸緩沖液將姬姆薩母液稀釋 10 倍，放入染色缸中，將 制備好的晾干的染色體標(biāo)本載片投入染色缸中，染色 10分鐘。16. 迅速用自來(lái)水將染料沖洗掉，將載片標(biāo)本晾干，用光學(xué)顯微鏡鏡檢，必要時(shí) 可用蓋片封后保存。實(shí)驗(yàn)十 臍血中單核細(xì)胞的分離與培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)原理從混合的細(xì)胞懸液中獲取目的細(xì)胞的過(guò)程叫細(xì)胞分離(cell separation)。不同的細(xì)胞具有不同的形態(tài)和功能特征，細(xì)胞的形態(tài)特征反映在其物理性狀上，如各種細(xì) 胞的大小、比重、表面電荷和黏附能力等存在差異；而細(xì)胞的功能特征往往由該細(xì)胞 膜表面的蛋白質(zhì)(表面標(biāo)記)來(lái)體

50、現(xiàn)，根據(jù)不同形態(tài)和功能特征，可以將各種目的細(xì) 胞從混合細(xì)胞群體中分離出來(lái)。一步梯度密度離心法 : 將細(xì)胞懸液加于一種高密度介質(zhì)上，應(yīng)用低速離心，密度 大于介質(zhì)的細(xì)胞通過(guò)介質(zhì)而沉淀于管底，而密度低于介質(zhì)的細(xì)胞則滯留于介質(zhì)之上， 體積較大的細(xì)胞沉降較快，體積較小的細(xì)胞沉降較慢，從而將具有不同密度和大小的 細(xì)胞分離開(kāi)來(lái)。一步密度梯度離心法常用于分離血細(xì)胞和形成玫瑰花環(huán)的淋巴細(xì)胞。一步密度梯 度法常用的分離介質(zhì)是 Ficoll-Hypaque ，也可用Percoll、動(dòng)物血清、BSA等。實(shí)驗(yàn)用品試劑：【按兩個(gè)臍血標(biāo)本(60-100ml )即兩次實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)耗材量 】1、Ficoll Hypaque分離液(

51、密度 1. 0771 0. 001g/m1)： 一瓶。2、D-MEM/F-12 (1X)、liquid 、1 : 1 , 11330-032 , 500ml(GIBCO3、表皮生長(zhǎng)因子【 epidermal growth factor（ EGF）、 Human、 Recombinant ，13247-051 , 100卩g （GIBCO】：貯存液（2卩g/ml ）配制方法：100卩g溶解50 ml 三蒸水中，過(guò)濾除菌分裝注射液瓶（ 2ml5ml/瓶），-20 C保存。使用時(shí)按100ml培 養(yǎng)液加入 1ml 即可。4、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子【 basic fibroblast growth fact

52、or（bFGF ,13256-029,10卩g （GIBCO】：貯存液（2卩g/ml ）配制方法：10卩g溶解5 ml三蒸水中，過(guò)濾除菌，分裝注射液瓶（1ml/瓶），-20 C保存。使用時(shí)按100ml培養(yǎng)液加入 1ml 即可。5、青霉素/鏈霉素（100X）貯存液。按常規(guī)方法配制。6、 谷氨酰胺（100 X）貯存液配制：取0.3 g谷氨酰胺溶于10ml三蒸水過(guò)濾分裝， 分裝注射液瓶（1ml/瓶），-20 C保存。使用時(shí)按100ml培養(yǎng)液加入1ml。7、 pH調(diào)整液【NaHCO常用濃度為7.4%、5.6%、3.7% （ m/v）。高壓滅菌的 10% 的醋酸溶液。HEPE（化學(xué)全名羥乙基哌嗪乙硫磺酸

53、）溶液：是一種氫離子緩沖劑，一 般培養(yǎng)基內(nèi)含 20mmol/l HEPES 即可達(dá)到緩沖能力?！?、 平衡鹽溶液【PBS液的配制：可配成含0.85%NaCl, pH=7.2的PBS（簡(jiǎn)稱PH=7.2 的PBS） PBS液（10 X ）貯存液配法：NaCI8.5g,KCI0.2g,NaHPO 4 12H2O2.85g（NaHPC4 2HzO1.13g）,K H2 PO 0.27g 溶與 100ml 三蒸水中。1mol/L （100X） HEPESt存液配法：取 23.8gHEPES溶于100ml三蒸水中, 用1 mol/LNaOH調(diào)pH至7.58.0后,過(guò)濾除菌,分裝（2ml/瓶）,4 C或-2

54、0 C保存?！?、2%NaOH 1%HCL器材與設(shè)備：可調(diào)微量移液器（5-40卩l(xiāng)、40-200卩l(xiāng)、200-1000卩l(xiāng) ）（共用）及對(duì)應(yīng)槍頭；鋁制或不銹鋼制盒子；針頭式濾器（0.22卩m的微孔濾膜）4個(gè)；100ml輸液瓶 10個(gè)；細(xì)胞培養(yǎng)瓶 10個(gè)； 50 ml 刻度離心管： 10個(gè)；刻度吸管 5 m1、 10 m1 各10個(gè)；尖頭吸管10個(gè)（帶小膠頭）；顯微鏡一臺(tái)；水平離心機(jī)一臺(tái)；吸管筒：3 個(gè)；細(xì)胞計(jì)數(shù)板一個(gè)；脫脂棉（酒精棉球）。材料來(lái)源 ：檸檬酸鈉抗凝臍血 ；實(shí)驗(yàn)方法一） Ficoll Hypaque 分離法11、將 Ficoll Hypaque 溶液小心地加于刻度離心管底部，體積不

55、超過(guò)試管的4。2、 取抗凝血若干毫升，用Hanks液（或PH=7.2的PBS將其稀釋1倍，混勻。 用刻度吸管將稀釋血液沿管壁輕輕加于 Ficoll Hypaque 上面，使稀釋血液重疊于 Ficoll Hypaque溶液上。稀釋血與 Ficoll Hypaque液的柱高之比約為 3: 2,且兩 者的總柱高不超過(guò)試管的 23。（ 15/22.5 ）。3、 將試管置水平離心機(jī)中,以 2000r min 離心 20min 。離心畢,試管內(nèi)可見(jiàn)分 為五層,一般可分為 4 個(gè)組分：最上層是血漿和血小板；第二層是單核細(xì)胞和淋巴細(xì) 胞；第三層為 Ficoll Hypaque;第四層為粒細(xì)胞；第五層是紅細(xì)胞。收集第二層細(xì) 胞于離心管內(nèi)。4、 將收集的目的細(xì)胞懸液進(jìn)一步用適量Hanks液（或PH=7.2的PBS 1000rpm離心5min洗滌，棄上清，將沉淀彈起，用適量D-MEM/F-12培養(yǎng)液將各管內(nèi)細(xì)胞收集在一管內(nèi)。（若紅細(xì)胞較多，可用三蒸水解離紅細(xì)胞，解離后加Hanks液（或PH=7.2的PBS離心、棄上清用適量 D-MEM/F-12培養(yǎng)液懸浮）。5、檢查細(xì)胞活力 , 計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞密度： 取 2 滴細(xì)胞懸液加 l 滴 2 臺(tái)盼藍(lán)染液, 混勻, 5min 后,取樣作濕 片檢查?；罴?xì)胞不著色,死亡細(xì)胞呈藍(lán)色。取用臺(tái)盼藍(lán)染過(guò)的細(xì)胞懸