第2章氨基酸與蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)

1、第一節(jié)：氨基酸，第一節(jié)：氨基酸，2.5學(xué)時(shí)學(xué)時(shí) 第二節(jié)：氨基酸的分離分析，第二節(jié)：氨基酸的分離分析，0.5學(xué)時(shí)學(xué)時(shí) 第三節(jié)：肽和蛋白質(zhì)，第三節(jié)：肽和蛋白質(zhì)，0.5學(xué)時(shí)學(xué)時(shí) 第四節(jié)：蛋白的分離，第四節(jié)：蛋白的分離，0.5學(xué)時(shí)學(xué)時(shí) 第五節(jié)：一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定，第五節(jié)：一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定，1學(xué)時(shí)學(xué)時(shí) 蛋白質(zhì)種類(lèi)與功能的多樣性蛋白質(zhì)種類(lèi)與功能的多樣性 1010-1012 結(jié)構(gòu)蛋白 貯藏蛋白 收縮蛋 白 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 l180180多種天然多種天然AAAA，大多數(shù)是不參與蛋白質(zhì)組，大多數(shù)是不參與蛋白質(zhì)組 成的。這些成的。這些AAAA被稱(chēng)為非蛋白質(zhì)被稱(chēng)為非蛋白質(zhì)AAAA。 l參與蛋白質(zhì)組成的參與蛋白質(zhì)組成的AAAA為為蛋

2、白質(zhì)蛋白質(zhì)AAAA，常見(jiàn)的常見(jiàn)的 只有只有2020種種 基本氨基酸，標(biāo)準(zhǔn)氨基酸基本氨基酸，標(biāo)準(zhǔn)氨基酸 l 表達(dá)方式：表達(dá)方式：三字母三字母或或單字母的簡(jiǎn)寫(xiě)符號(hào)單字母的簡(jiǎn)寫(xiě)符號(hào) l除脯氨酸外，其他除脯氨酸外，其他1919種均具有如下結(jié)構(gòu)通式。種均具有如下結(jié)構(gòu)通式。 各種氨基酸的區(qū)別在于側(cè)鏈各種氨基酸的區(qū)別在于側(cè)鏈R R基基的不同。的不同。 -氨基酸氨基酸 可變部分可變部分 不變部分不變部分 COOH CHH2N R 一、基本氨基酸 1, 1, 按按側(cè)鏈側(cè)鏈R R基的化學(xué)結(jié)構(gòu)基的化學(xué)結(jié)構(gòu)，分為三類(lèi)，分為三類(lèi) l脂肪族氨基酸脂肪族氨基酸15種種 C2:1 C3:3 C4:3 C5:4 C6:4 l芳

3、香族氨基酸芳香族氨基酸3種種 l雜環(huán)族氨基酸雜環(huán)族氨基酸2種種 GlyAlaValLeuIle PheTyrTrpCysMet S S 氨基酸氨基酸的的R R基大小基大小 l分為分為4 4類(lèi)：類(lèi)： l非極性氨基酸：非極性氨基酸：9 9 l 極性不解離：極性不解離：6 6 l極性氨基酸極性氨基酸 解離帶負(fù)電荷：解離帶負(fù)電荷：2 2酸性酸性 l 極性解離極性解離 l 解離帶正電荷：解離帶正電荷：3 3堿性堿性 l POLAR NON- POLAR Tyr His Gly 酸性酸性中性中性Basic Asp Glu Gln Cys Asn Ser Thr Lys Arg Ala Val Ile Le

4、u Met Phe Trp Pro 氨基酸的極性分類(lèi)氨基酸的極性分類(lèi) 極極性或非性或非極極性，是性，是影響影響蛋白蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的關(guān)鍵質(zhì)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的關(guān)鍵 - - + + + S S 有大有小 有正有負(fù) 有極性 非極性 形形色色的氨基酸側(cè)基 l含硫氨基酸含硫氨基酸 l含羥基氨基酸含羥基氨基酸 l-C-C 帶分支氨基酸 帶分支氨基酸 l二羧基一氨基氨基酸二羧基一氨基氨基酸 l二氨基一羧基氨基酸二氨基一羧基氨基酸 l亞氨基酸亞氨基酸 COOH CHH2N R 除甘氨酸外，除甘氨酸外，皆含皆含手性手性C C，皆為，皆為L(zhǎng)-L-構(gòu)型（構(gòu)型（蛋白中的蛋白中的氨氨 基酸）；基酸）； 旋光方向不同。左或右旋

5、。旋光儀測(cè)定。旋光方向不同。左或右旋。旋光儀測(cè)定。 比旋光度比旋光度D D25 25( (單位濃度、單位長(zhǎng)度下的旋光度， 單位濃度、單位長(zhǎng)度下的旋光度， /c/c* *l)l)是氨基酸的重要物理常數(shù)之一，是鑒別各種是氨基酸的重要物理常數(shù)之一，是鑒別各種 氨基酸的重要依據(jù)氨基酸的重要依據(jù) 。 l在近紫外區(qū)在近紫外區(qū)(200-400nm)(200-400nm) 只有酪氨酸、苯丙氨酸只有酪氨酸、苯丙氨酸 和色氨酸有吸收光的能和色氨酸有吸收光的能 力。力。 l酪氨酸酪氨酸的的 maxmax275nm275nm， l色氨酸色氨酸的的 maxmax280nm280nm l苯丙氨酸的苯丙氨酸的 maxmax

6、257nm257nm l一）氨基酸的兼性離子形式：一）氨基酸的兼性離子形式： 氨基酸的兩個(gè)重要性質(zhì)：氨基酸晶體的氨基酸的兩個(gè)重要性質(zhì)：氨基酸晶體的 熔點(diǎn)高（熔點(diǎn)高（ 200200 C C）；氨基酸使水的介電）；氨基酸使水的介電 常數(shù)增高。常數(shù)增高。 AA是兩 性電解質(zhì) COOH NH2 H+ COO- R - C - H NH2 H+ R - C - H COO- NH2 R - C - H 酸性環(huán)境酸性環(huán)境中性中性環(huán)境環(huán)境 堿性環(huán)境堿性環(huán)境 +1-1 0 pK1 2 pK2 9.4 等電點(diǎn)等電點(diǎn) 6.0 等等電點(diǎn)電點(diǎn)pIpI：所帶凈電荷為零。電場(chǎng)中不移動(dòng)。：所帶凈電荷為零。電場(chǎng)中不移動(dòng)。 此

7、此氨基酸氨基酸在在 pH pH 2 2 或或 9 9 附近，有附近，有緩沖緩沖作用作用。 賴(lài)氨酸的解離及等電點(diǎn)計(jì)算賴(lài)氨酸的解離及等電點(diǎn)計(jì)算 H A2+A+ A0 A- l等電點(diǎn)等電點(diǎn)(isoelectric point,pI)(isoelectric point,pI)： l中性氨基酸：酸性和堿性基團(tuán)的算術(shù)平均值：中性氨基酸：酸性和堿性基團(tuán)的算術(shù)平均值： p pI I = (p = (pK K-COO -COO- + p - + pK K-NH2 -NH2 )/2 )/2， l l酸性氨基酸：兩個(gè)酸性解離基團(tuán)的算術(shù)平均值酸性氨基酸：兩個(gè)酸性解離基團(tuán)的算術(shù)平均值 p pI I = (p = (p

8、K K-COO -COO- + p - + pK KR-COO R-COO- - )/2 )/2 ， l堿性氨基酸：兩個(gè)堿性解離基團(tuán)的算術(shù)平均值堿性氨基酸：兩個(gè)堿性解離基團(tuán)的算術(shù)平均值 p pI I = (p = (pK K-NH2 -NH2+ p + pK KR-NH2 R-NH2 )/2 )/2 ， COOH CHH 2N R 亞硝酸反應(yīng)亞硝酸反應(yīng) 烴基化反應(yīng)烴基化反應(yīng) ?；磻?yīng)?；磻?yīng) 脫氨基反應(yīng)脫氨基反應(yīng) 西佛堿反應(yīng)西佛堿反應(yīng) 成鹽成酯反應(yīng)成鹽成酯反應(yīng) 成酰氯反應(yīng)成酰氯反應(yīng) 脫羧基反應(yīng)脫羧基反應(yīng) 疊氮反應(yīng)疊氮反應(yīng) 側(cè)鏈反應(yīng)側(cè)鏈反應(yīng) 茚三酮反應(yīng)茚三酮反應(yīng) 成成 肽肽 反反 應(yīng)應(yīng) 用途用途

9、：常用于氨基酸的定性或定量分析。常用于氨基酸的定性或定量分析。 C C C O O O 茚三酮茚三酮 C C C O O OH OH H2O H2O 水合茚三酮水合茚三酮 CO2NH2RCHO+ + + C C C O O H OH H2NCHCOOH R C C C O O OH OH + 2NH3 C C C O O C C C O O-NH4+ N H2O2 + C C C O O O C C C O O H HO l氨基酸的結(jié)構(gòu)通式為氨基酸的結(jié)構(gòu)通式為氨基酸。蛋白質(zhì)氨基酸。蛋白質(zhì) 除含除含C,H,OC,H,O外，還含有外，還含有N N。AAAA平均分子量平均分子量 為為110110。

10、l不同蛋白的含氮量皆在不同蛋白的含氮量皆在16%16%左右。只需測(cè)左右。只需測(cè) 定定N N含量，含量， N N含量含量/16%/16%即為蛋白含量。即為蛋白含量。 l l - -凱氏定氮法的理論基礎(chǔ)凱氏定氮法的理論基礎(chǔ) l根據(jù)根據(jù)R R基的極性。原理：分配層析?；臉O性。原理：分配層析。 l 濾紙層析濾紙層析： l 薄層層析薄層層析： l根據(jù)氨基酸的凈電荷及根據(jù)氨基酸的凈電荷及R R基的極性：基的極性： l 離子交換層析離子交換層析： l陰離子交換樹(shù)脂-N(CH3)3OH，陽(yáng)離子交換樹(shù)脂- SO3H l根據(jù)氨基酸的凈電荷及質(zhì)點(diǎn)大?。焊鶕?jù)氨基酸的凈電荷及質(zhì)點(diǎn)大?。?l 電泳電泳： l層析法層析法

11、色層分析法（色譜）色層分析法（色譜） 系統(tǒng)的組成固定相（靜相）系統(tǒng)的組成固定相（靜相） 流動(dòng)相（動(dòng)相）流動(dòng)相（動(dòng)相） l分配定律分配定律當(dāng)溶質(zhì)在兩種給定的當(dāng)溶質(zhì)在兩種給定的互不相互不相 溶溶的溶劑中分配時(shí)，在一定的溫度下達(dá)到的溶劑中分配時(shí)，在一定的溫度下達(dá)到 平衡后，溶質(zhì)在兩相中的濃度比值為一常平衡后，溶質(zhì)在兩相中的濃度比值為一常 數(shù)數(shù). .此比值即分配系數(shù)（此比值即分配系數(shù)（kdkd）。）。 l 固定相：固定相：纖維素上吸附的水纖維素上吸附的水 流動(dòng)相：展層溶劑，有機(jī)相流動(dòng)相：展層溶劑，有機(jī)相 層析時(shí)，混合層析時(shí)，混合AAAA在兩相中不斷分配，在兩相中不斷分配，疏水性強(qiáng)的疏水性強(qiáng)的 AAAA

12、在固定相水中溶解度在固定相水中溶解度較較小，與水的作用力也較小，與水的作用力也較 小，小，隨展層劑的展層（移動(dòng)）也移動(dòng)較遠(yuǎn)距離隨展層劑的展層（移動(dòng)）也移動(dòng)較遠(yuǎn)距離 （遷移率（遷移率RfRf大）。大）。 l極性強(qiáng)的極性強(qiáng)的RfRf值小，疏水性強(qiáng)的值小，疏水性強(qiáng)的RfRf大。大。 l分離、鑒定分離、鑒定AAAA混合物的方法?；旌衔锏姆椒?。 l將下列每組混合物分別用正丁醇將下列每組混合物分別用正丁醇- -醋酸醋酸- - 水進(jìn)行紙層析，指出每組的相對(duì)遷移率。水進(jìn)行紙層析，指出每組的相對(duì)遷移率。 l(1) Val(1) Val和和Lys;Lys; l(2) Phe(2) Phe和和Ser;Ser; l(

13、3) Leu(3) Leu、AlaAla、SerSer l一個(gè)氨基酸的羧基一個(gè)氨基酸的羧基 與另一個(gè)氨基酸的與另一個(gè)氨基酸的 氨基之間失水形成氨基之間失水形成 的酰胺鍵稱(chēng)為的酰胺鍵稱(chēng)為肽鍵肽鍵， 所形成的化合物稱(chēng)所形成的化合物稱(chēng) 為肽。為肽。 由兩個(gè)氨基酸組成的肽稱(chēng)為二肽，由幾個(gè)到幾十由兩個(gè)氨基酸組成的肽稱(chēng)為二肽，由幾個(gè)到幾十 個(gè)氨基酸組成的肽稱(chēng)為寡肽，由更多個(gè)氨基酸組個(gè)氨基酸組成的肽稱(chēng)為寡肽，由更多個(gè)氨基酸組 成的肽則稱(chēng)為多肽。組成肽鏈的氨基酸單元稱(chēng)為成的肽則稱(chēng)為多肽。組成肽鏈的氨基酸單元稱(chēng)為 氨基酸殘基氨基酸殘基。 CCNCCNCCNCCNC CH2CHCH2CH2CH2 COO- OHC

14、O2HCH2 CONH2 OH CH3 H3N+ OOOO HHHHH HHHH SerValTyrAsp Gln CH3 N-端 C-端 肽鍵 l在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列 順序稱(chēng)為氨基酸順序。順序稱(chēng)為氨基酸順序。 l方向性：方向性：一條多肽鏈有兩個(gè)末端，自由 - -氨基，稱(chēng)為氨基，稱(chēng)為 氨基端或氨基端或N-N-端；端；游離 - -羧基，稱(chēng)為羧基端或羧基，稱(chēng)為羧基端或C-C-端。端。 l氨基酸的順序：氨基酸的順序：N-N-端端C-C-端端 l如上述五肽可表示為：Ser-Val-Tyr-Asp-Glu n 絲氨絲氨酰酰纈氨纈氨酰酰酪氨酪

15、氨酰酰天冬氨天冬氨酰酰谷氨谷氨酸酸 肽單位肽單位 主鏈： 側(cè)鏈 肽具有酸堿兩性性質(zhì)和等電點(diǎn)。肽具有酸堿兩性性質(zhì)和等電點(diǎn)。肽的酸肽的酸 堿性質(zhì)主要來(lái)自游離末端堿性質(zhì)主要來(lái)自游離末端 -NH-NH2 2和游離和游離 末端末端 -COOH-COOH以及側(cè)鏈以及側(cè)鏈R R上可解離的基上可解離的基 團(tuán)。每一種肽都有其相應(yīng)的等電點(diǎn)。團(tuán)。每一種肽都有其相應(yīng)的等電點(diǎn)。末末 端端 - -NHNH2,2, - -COOHCOOH比游離氨基酸的比游離氨基酸的 酸堿度降低。酸堿度降低。 l在生物體中，多肽最重要的存在形式是在生物體中，多肽最重要的存在形式是 作為蛋白質(zhì)的亞單位。作為蛋白質(zhì)的亞單位。 l但是，也有許多分

16、子量比較小的多肽以但是，也有許多分子量比較小的多肽以 游離狀態(tài)存在。這類(lèi)多肽通常都具有特游離狀態(tài)存在。這類(lèi)多肽通常都具有特 殊的生理功能，常稱(chēng)為活性肽。殊的生理功能，常稱(chēng)為活性肽。 l如：腦啡肽；激素類(lèi)多肽；抗生素類(lèi)多如：腦啡肽；激素類(lèi)多肽；抗生素類(lèi)多 肽；肽；谷胱甘肽谷胱甘肽；蛇毒多肽等。；蛇毒多肽等。 l部分肽中含有部分肽中含有D-D-氨基酸。氨基酸。 l CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOH CHCH2 2 CHCH2 2 CHNHCHNH2 2 COOHCOOH CHCH2 2 SHSH 1.參與體內(nèi)氧化還原反應(yīng)參與體內(nèi)氧化還原反應(yīng) 2.作為輔酶參與氧化還原反應(yīng)作為輔酶參與氧

17、化還原反應(yīng) 保護(hù)巰基酶或含保護(hù)巰基酶或含Cys的蛋白質(zhì)中的蛋白質(zhì)中 SH的還原性的還原性 防止氧化物積累防止氧化物積累 GSH+GSH-GSSG 根據(jù)：根據(jù)：所要提取的蛋白（目的蛋白）與其它所要提取的蛋白（目的蛋白）與其它 蛋白（雜蛋白）的不同進(jìn)行分離。蛋白（雜蛋白）的不同進(jìn)行分離。 溶解度不同溶解度不同: : 反相柱層析；反相柱層析；鹽析鹽析 分子量不同分子量不同: : 透析；透析；凝膠過(guò)濾法凝膠過(guò)濾法 所帶電荷不同所帶電荷不同: : 電泳；離子交換層析電泳；離子交換層析 特有的親和力：特有的親和力：親和層析親和層析 l不同的蛋白質(zhì)溶解度不同。且溶解度隨外不同的蛋白質(zhì)溶解度不同。且溶解度隨外

18、 界條件如鹽濃度，界條件如鹽濃度，pHpH值，溫度等而變。值，溫度等而變。 鹽對(duì)蛋白質(zhì)濃度的影響 鹽溶鹽溶 Salting-in: 加少量鹽使蛋白質(zhì)溶解度變大 鹽析鹽析 Salting-out: 加大量鹽使蛋白質(zhì)由溶液中沉淀出來(lái) 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)溶解度溶解度和和pH值及鹽濃度有關(guān)值及鹽濃度有關(guān) 0.001 0.005 0.01 0.02 NaCl(mol/L) pI 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6 pH 溶 解 度 蛋白的穩(wěn)定因素：蛋白的穩(wěn)定因素： （1 1）帶電層）帶電層 （2 2）水化層）水化層 加入少量鹽：增加入少量鹽：增 加帶電層，促進(jìn)加帶電層，促進(jìn) 溶解。溶解。 -鹽溶鹽溶 Ag

19、gregate 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)分子表面的疏水性分子表面的疏水性區(qū)域區(qū)域，聚集許多水分子，聚集許多水分子， 當(dāng)當(dāng)加入加入鹽時(shí)鹽時(shí)，這些水分子被抽出，暴露出來(lái)的疏水，這些水分子被抽出，暴露出來(lái)的疏水 性性區(qū)域區(qū)域互相互相結(jié)合結(jié)合，形成，形成沉淀沉淀。 鹽析鹽析 Salting-out Salting-out ： Ionic strength 溶 解 度 + - + + + - - - - - + Ammonium sulfate Sodium sulfate A little salting-in effect NH4 + SO4 2- = hydrophobic 硫酸銨分級(jí)沉淀硫酸銨分級(jí)沉淀 l又

20、稱(chēng)為分子篩層析。依蛋白質(zhì)分子量的差異，又稱(chēng)為分子篩層析。依蛋白質(zhì)分子量的差異， 通過(guò)具有通過(guò)具有分子篩性質(zhì)的凝膠分子篩性質(zhì)的凝膠而分離。而分離。 l葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠G10-G200G10-G200 l瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠2B,4B,6B2B,4B,6B l聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠S100S100S600S600 凝膠顆粒 小分子進(jìn)入凝小分子進(jìn)入凝 膠分子內(nèi)，被膠分子內(nèi)，被 滯留滯留 大分子在凝大分子在凝 膠顆粒間移膠顆粒間移 動(dòng)，較快流動(dòng)，較快流 出出溶劑流動(dòng)方向溶劑流動(dòng)方向 按按 分分 子子 量量 從從 大大 到到 小小 依依 次次 流流 出出 l如兩分子間有如兩分子間有專(zhuān)一性親和力

21、專(zhuān)一性親和力（特別的結(jié)（特別的結(jié) 合和識(shí)別能力，具有合和識(shí)別能力，具有針對(duì)性針對(duì)性），以其中一種以其中一種 作為作為“魚(yú)餌魚(yú)餌”，可把另外一種，可把另外一種“釣釣”出來(lái)。出來(lái)。 其它蛋白不被吸引而結(jié)合不上。其它蛋白不被吸引而結(jié)合不上。 親和層析親和層析法的作用法的作用機(jī)理機(jī)理： 固相載體 (1)(2)(3) A B Sample WashingElution XB 親和基團(tuán) 的配體 X B AA l在外電場(chǎng)的作用下，帶電顆粒向著與其電性在外電場(chǎng)的作用下，帶電顆粒向著與其電性 相反的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱(chēng)為電泳。相反的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱(chēng)為電泳。 l蛋白質(zhì)有各自的等電點(diǎn)。在非等電點(diǎn)時(shí)，蛋蛋白質(zhì)有各

22、自的等電點(diǎn)。在非等電點(diǎn)時(shí)，蛋 白質(zhì)顆粒均帶有不同的電荷。白質(zhì)顆粒均帶有不同的電荷。 l蛋白質(zhì)顆粒在電場(chǎng)中移動(dòng)的速度（蛋白質(zhì)顆粒在電場(chǎng)中移動(dòng)的速度（v v）取決于）取決于 電場(chǎng)強(qiáng)度電場(chǎng)強(qiáng)度(E)(E)，所帶的，所帶的凈電荷凈電荷(q)(q)以及與以及與介質(zhì)介質(zhì) 的摩擦系數(shù)的摩擦系數(shù)(f(f，即顆粒大小及形狀，即顆粒大小及形狀) )。 lSDSSDS（十二烷基（十二烷基磺酸鈉磺酸鈉）是一種陰離子型表）是一種陰離子型表 面活性劑，它能夠與蛋白質(zhì)中的氨基酸殘面活性劑，它能夠與蛋白質(zhì)中的氨基酸殘 基按大約基按大約1 1 2 2比例結(jié)合，使比例結(jié)合，使蛋白以一條無(wú)蛋白以一條無(wú) 構(gòu)型的長(zhǎng)條分子存在構(gòu)型的長(zhǎng)條

23、分子存在，且分子表面均勻結(jié)，且分子表面均勻結(jié) 合一層負(fù)的合一層負(fù)的SDSSDS的電荷，蛋白質(zhì)分子的電荷，蛋白質(zhì)分子原有電原有電 荷間的差別則可以忽略荷間的差別則可以忽略。 l用已知分子量的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)，則可以用已知分子量的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)，則可以 估算出不同蛋白質(zhì)的分子量。估算出不同蛋白質(zhì)的分子量。 定義定義 1969年年 ，國(guó)際純化學(xué)與，國(guó)際純化學(xué)與 應(yīng)用化學(xué)委員會(huì)應(yīng)用化學(xué)委員會(huì) （IUPAC） 規(guī)定規(guī)定 ：蛋白質(zhì)的一級(jí)：蛋白質(zhì)的一級(jí) 結(jié)構(gòu)指結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)多蛋白質(zhì)多 肽連中肽連中AA的排列的排列 順序，包括二硫順序，包括二硫 鍵的位置。鍵的位置。 F. Sanger (1953, Cambri

24、dge U) Insulin 胰島素 (A, B chains) 以傳統(tǒng)氨基酸定序法決定蛋白質(zhì)序列 S S S S S S +NH3 NH3+ -OOC Q G I V E Q C C T S I C S L Y L E N Y C N COO- F S F V N Q H L C G H LV E A L Y L V C G E R G F Y T P K T B-chain A-chain l（1） 測(cè)定多肽鏈的數(shù)目，拆分多肽鏈，測(cè)定多肽鏈的數(shù)目，拆分多肽鏈，分析分析 多肽鏈的多肽鏈的N末端和末端和C末端殘基末端殘基 l（2）斷裂多肽鏈內(nèi)、間的二硫鍵）斷裂多肽鏈內(nèi)、間的二硫鍵 l（3） 測(cè)

25、定每條多肽鏈的測(cè)定每條多肽鏈的AA組成組成 l（4） 多肽鏈斷裂成小肽段多肽鏈斷裂成小肽段 （5） 測(cè)定各個(gè)肽段的測(cè)定各個(gè)肽段的AA順序順序 l（6） 確定肽段在多肽鏈中的次序確定肽段在多肽鏈中的次序 （7） 確定原多肽鏈中二硫鍵的位置確定原多肽鏈中二硫鍵的位置 lSangerSanger法。法。2,4-2,4-二硝基氟苯在堿性條件下，能二硝基氟苯在堿性條件下，能 夠與肽鏈夠與肽鏈N-N-端的游離氨基作用，生成二硝基苯端的游離氨基作用，生成二硝基苯 衍生物（衍生物（DNP-DNP-肽）。肽）。 l酸解，得黃色酸解，得黃色DNP-DNP-氨基酸，用乙醚抽提分離。氨基酸，用乙醚抽提分離。 不同的不

26、同的DNP-DNP-氨基酸可以用色譜法進(jìn)行鑒定。氨基酸可以用色譜法進(jìn)行鑒定。 （一）一）N N末端分析法末端分析法 O2NF NO2 + H2NCHC RO HNCHC RO O2N NO2 H+ H2O O2N NO2 HNCHC RO OH + 氨基酸 DNFB N-端氨基酸DNP衍生物 DNP-氨基酸 是游離氨基酸、多肽及蛋白共有的一個(gè)反應(yīng)是游離氨基酸、多肽及蛋白共有的一個(gè)反應(yīng) 用途用途：可以用來(lái)鑒定多肽或蛋白質(zhì)可以用來(lái)鑒定多肽或蛋白質(zhì)NH2末端氨基酸末端氨基酸. DNSDNS + + AA AA 多肽多肽 蛋白蛋白 弱堿弱堿 DNS-DNS- AA AA 多肽多肽 蛋白蛋白 酸酸 DN

27、S-AADNS-AA + +游離游離AAAA （乙醚抽提，有熒光）（乙醚抽提，有熒光） l在可用在可用8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol/L6mol/L鹽酸胍（使鹽酸胍（使 蛋白變性，亞基分開(kāi)）存在下，蛋白變性，亞基分開(kāi)）存在下，使使用過(guò)用過(guò) 量的量的 - -巰基乙醇巰基乙醇，使二硫鍵還原為巰基，使二硫鍵還原為巰基， 然后用然后用烷基化試劑烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，以保護(hù)生成的巰基，以 防止它重新被氧化防止它重新被氧化。 (三三)氨基氨基 酸組成的酸組成的 分析：分析： 酸，堿解后酸，堿解后 氨基酸分析氨基酸分析 儀測(cè)定儀測(cè)定 l1 1、 酶裂解法酶裂解法 胰胰 蛋白酶蛋白酶 蛋白水

28、解酶（蛋白酶）：蛋白水解酶（蛋白酶）： 糜糜 蛋白酶（肽鏈內(nèi)切酶）蛋白酶（肽鏈內(nèi)切酶） 嗜嗜 熱菌蛋白酶熱菌蛋白酶 胃胃 蛋白酶蛋白酶 l胰蛋白酶胰蛋白酶Trypsin ：R R1 1= =賴(lài)氨酸賴(lài)氨酸LysLys和精氨酸和精氨酸ArgArg 側(cè)鏈（專(zhuān)一性較強(qiáng)，水解速度快）側(cè)鏈（專(zhuān)一性較強(qiáng)，水解速度快）。 l胰凝乳（糜）蛋白酶：專(zhuān)一性胰蛋白酶胰凝乳（糜）蛋白酶：專(zhuān)一性胰蛋白酶 斷裂斷裂Phe,Trp,TyrPhe,Trp,Tyr等芳香族等芳香族AAAA的羧基形成的肽鍵。的羧基形成的肽鍵。 NHCHC O R4 NHCHC O R3 NHCHC O R2 NHCHC O R1 水解位點(diǎn)水解位點(diǎn)

29、2、化學(xué)試劑法：溴化氰。R1=R1=甲硫氨酸。 l1 1、EdmanEdman化學(xué)降解法化學(xué)降解法 lEdmanEdman（苯異硫氰酸酯法）氨基酸順序分（苯異硫氰酸酯法）氨基酸順序分 析法實(shí)際上也是一種析法實(shí)際上也是一種N-N-端分析法端分析法。此法。此法 的特點(diǎn)是能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈的特點(diǎn)是能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈N-N- 端氨基酸殘基逐一進(jìn)行標(biāo)記和解離。端氨基酸殘基逐一進(jìn)行標(biāo)記和解離。 用途用途：可以用來(lái)鑒定多肽或蛋白質(zhì)可以用來(lái)鑒定多肽或蛋白質(zhì)NH2末端氨末端氨 基酸?；?。亦稱(chēng)亦稱(chēng)EdmanEdman反應(yīng)反應(yīng) 弱堿弱堿 AAAA PITC+ PITC+ 多肽多肽 蛋白蛋白 AAAA PTCPTC多肽多肽 蛋白蛋白 無(wú)水甲酸無(wú)水甲酸 或或HFHF PTH-AA + PTH-AA + 少一個(gè)少一個(gè)AAAA的多肽或蛋白的多肽或蛋白 （乙