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文檔簡介
1、南華大學(xué)本科生畢業(yè)設(shè)計(論文)開題報告設(shè)計(論文)題目新型凝血因子Xa抑制劑的設(shè)計、合成與活性研究設(shè)計(論文)題目來源縱向課題設(shè)計(論文)題目類型研究類起止時間一、 設(shè)計(論文)依據(jù)及研究意義:心腦血管疾?。╟ardiovascular disease, CVDs)是由于心臟或血管病變導(dǎo)致的循環(huán)系統(tǒng)疾病的統(tǒng)稱。心腦血管疾病是大多數(shù)國家的首要死亡病因,其中全球約半數(shù)的心腦血管疾病死亡病例發(fā)生在亞洲國家和地區(qū)1。根據(jù)世界衛(wèi)生組織報告,2011年全世界約730萬人死于缺血性心臟病,620萬人死于腦中風(fēng),兩者共構(gòu)成了大約21.8%的死亡人口,在所有死亡因素中居于前兩位(圖1-1)。在中國每年有約300
2、萬人死于心腦血管疾病,占所有死亡總數(shù)的41%左右。心腦血管疾病嚴重地威脅著人類的生命健康,并給社會和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟負擔(dān),研究有效防治心腦血管疾病的藥物已成為我國藥物研發(fā)的當(dāng)務(wù)之急。在缺血性心臟病和缺血性腦中風(fēng)的發(fā)病機制中,血栓的形成起到非常關(guān)鍵的作用2,凝血系統(tǒng)則在血栓的形成過程中扮演了重要角色。當(dāng)凝血系統(tǒng)被觸發(fā)后,經(jīng)過一段滯后時間后血液中產(chǎn)生大量凝血酶3,凝血酶使血液中可溶性的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘睦w維蛋白,從而產(chǎn)生血塊,血塊脫落時造成血栓。目前為止,臨床上用于防治血栓的藥物主要包括兩類抗凝血劑:(1)通過增強血漿抗凝血酶活性,而間接發(fā)揮抗凝作用的注射劑(如:未分級肝素,低分子量肝素
3、LMWHs和磺達肝癸鈉);(2)維生素K拮抗劑(如:華法林)。這兩類抗凝血劑均靶向于凝血系統(tǒng)中的多個受體,即作用于多種不同的凝血因子。這些藥物廣泛應(yīng)用于臨床,大大降低了血栓栓塞形成的概率,然而它們也有一定的局限性4:(1)肝素類藥物,如低分子量肝素和磺達肝癸鈉只能腸胃外給藥5, 6,使得它們不便于長期使用;(2)低分子量肝素,其“抗凝血酶依賴”的作用模式使其不能滅活與纖維蛋白結(jié)合的凝血酶、或者與與血栓結(jié)合的FXa;(3)另外,低分子量肝素還會引起血小板減少,而長期治療則會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥;(4)而維生素K拮抗劑如華法林雖然一直是長期抗凝治療的主打藥物,然而這些藥物具有起效慢、治療窗窄以及與多種藥
4、物、食物相互作用的缺點7-9。凝血過程中參與的凝血因子有I,II,III,IV,V,X等,其中凝血因子Xa(factor Xa,F(xiàn)Xa,活化的凝血因子X)和凝血酶(即活化的凝血因子II)是兩個近年來研究較多的靶點。FXa是一種胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶,它位于外在凝血途徑和內(nèi)在凝血途徑的交界處。在兩條凝血途徑的末尾交匯處,被激活的FXa與其輔助因子凝血因子Va(FVa)和磷脂表面的鈣離子結(jié)合后,形成FXa-FVa復(fù)合物,該復(fù)合物可以將凝血酶原轉(zhuǎn)化成凝血酶,凝血酶則進一步激活血小板,并同時將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白,從而最終導(dǎo)致血栓的形成。因此,F(xiàn)Xa是一個非常重要的且明確的新型抗凝血劑的作用靶標(biāo)1
5、0。文獻表明,1分子FXa可以產(chǎn)生大于 1000個凝血酶分子11,因此抑制FXa可以有效阻斷凝血酶的合成;對FXa的抑制不會影響血液中已經(jīng)存在的凝血酶的正常凝血功能;此外,小分子的FXa抑制劑能夠進入血栓,從而可以同時抑制循環(huán)中FXa的以及與血栓結(jié)合的FXa12。在一個封閉的胰蛋白酶樣的-折疊桶中,F(xiàn)Xa含有一段具有254個氨基酸的絲氨酸蛋白區(qū)域,這段區(qū)域包含著Ser195-His57-Asp102三聯(lián)體催化位點和兩個基本子位點,即S1特異性位點(口袋)和S4 芳基結(jié)合位點(口袋)。S1口袋是一個由疏水性的結(jié)構(gòu)所包圍的較小腔袋,其中底物與S1口袋的結(jié)合包括與口袋底部的Asp189形成一個鹽橋1
6、3, 14。而S4口袋是由Tyr99,Phe174和Trp215殘基形成的一個較大的疏水性腔袋15-17。尋找具有合適骨架且能夠與S1口袋和S4口袋形成最有利相互作用的小分子配體,成為基于結(jié)構(gòu)設(shè)計選擇性FXa抑制劑的一大重點18。目前已經(jīng)有三種凝血因子Xa抑制劑:利伐沙班、阿哌沙班、依度沙班分別在美國、歐盟和日本上市,應(yīng)用于抗血栓治療。利伐沙班等藥物具有顯著的防治靜脈血栓形成的藥理作用,降低了急性冠狀動脈綜合征患者發(fā)生心腦血管事件的風(fēng)險。然而,這些藥物在應(yīng)用中亦被發(fā)現(xiàn)有一些副作用,如可導(dǎo)致出血并發(fā)癥等。因此,研究開發(fā)高效、低毒的凝血因子Xa抑制劑依然是當(dāng)前抗凝血藥物研發(fā)的熱點。新型FXa抑制劑
7、的研究與開發(fā),對于缺血型心腦血管疾病的治療有重大意義。FXa抑制劑能夠顯著降低心腦血管事件風(fēng)險,保障人們的生命健康,減輕家庭和社會的經(jīng)濟負擔(dān),具有廣闊的應(yīng)用前景和良好的社會效益。目前對FXa抑制劑的開發(fā)與研究,主要以國外的大型藥企為主,包括德國拜耳,日本第一制藥,美國Squibb等公司,并已有三種FXa抑制劑上市。國內(nèi)對此領(lǐng)域的研究起步較晚。二、 設(shè)計(論文)主要研究的內(nèi)容、預(yù)期目標(biāo):(技術(shù)方案、路線)研究目標(biāo):本項目申請人在前期研究中,根據(jù)FXa的化學(xué)生物學(xué)信息和經(jīng)典的生物電子等排(Bioisosterism)藥物設(shè)計原理,替換先導(dǎo)化合物的P4區(qū)(與FXa的S4口袋結(jié)合的區(qū)域)和linker
8、區(qū),并采用多種多樣的P1區(qū)(與FXa的S1口袋結(jié)合的區(qū)域),設(shè)計合成了雙?;哙篎Xa抑制劑和氨基芐胺FXa抑制劑,并經(jīng)抗凝血活性試驗和FXa抑制活性試驗發(fā)現(xiàn)了一些具有較高活性的先導(dǎo)化合物。其中化合物H17的抗凝血活性活性和FXa抑制活性活性分別為(PTCT2 = 1.0 M, IC50 = 1.9 M),均優(yōu)于陽性對照藥利伐沙班(PTCT2 = 1.3 M, IC50 = 3.3 M)。本項目的研究目標(biāo)是基于FXa抑制劑藥物設(shè)計策略,以上市藥物利伐沙班和已發(fā)現(xiàn)的H17為先導(dǎo)化合物,對先導(dǎo)化合物的P4區(qū)、linker進行結(jié)構(gòu)改造,通過變換P4區(qū)的體積、疏水性等,以增強P4區(qū)與FXa的S4口袋的
9、結(jié)合能力;以及增強linker區(qū)與FXa的氨基酸的氫鍵形成能力,設(shè)計了一系列新型氨基芐胺類FXa抑制劑。該研究經(jīng)抗凝血活性試驗篩選與FXa抑制活性試驗,以及初步的成藥性評價,旨在發(fā)現(xiàn)新一代高效、低毒的FXa抑制劑候選藥物,為進一步開發(fā)奠定基礎(chǔ)。研究內(nèi)容:(1) 目標(biāo)化合物的設(shè)計根據(jù)先導(dǎo)化合物與FXa的結(jié)合模式和生物電子等排原理,將先導(dǎo)化合物的P4區(qū)以體積更大、疏水性更強的嗎啉聯(lián)吡啶基團或戊內(nèi)酰胺聯(lián)苯基團替代,使得該區(qū)域能更好地契合入FXa的S4口袋,并與周圍的疏水性氨基酸形成-堆積作用;linker區(qū)保留氨基芐胺,以砜基連接氨基芐胺和P1區(qū),砜基作為比羰基更強的電子供體,可以與FXa的氨基酸形
10、成更強的氫鍵,甚至是雙重氫鍵。由此來構(gòu)建FXa抑制劑。(2) 虛擬篩選與藥代動力學(xué)和毒性(ADMET)預(yù)測運用Sybyl-X中Surflex模塊進行目標(biāo)化合物的活性預(yù)測;運用DS毒性預(yù)測軟件TOPKAT建立模型,對設(shè)計的目標(biāo)化合物進行毒理學(xué)性質(zhì)預(yù)測;運用Sybyl-X中VOLSURF模塊對化合物的吸收、分布、代謝、排泄(ADME)性質(zhì)進行預(yù)測。(3) 目標(biāo)化合物的合成對通過虛擬篩選得出的目標(biāo)化合物進行定向化學(xué)合成;經(jīng)過核磁共振氫譜(1H)、核磁共振碳譜(13C)、元素分析和紅外光譜(IR)、質(zhì)譜(MS)等儀器分析確證其化學(xué)結(jié)構(gòu),并通過HPLC等測定化合物純度。(4) 體外抗凝血活性和FXa抑制
11、活性實驗以利伐沙班作為陽性對照藥物,對所設(shè)計合成的化合物進行體外抗凝血活性測試和FXa抑制活性試驗。(5) 初步成藥性評價根據(jù)體外活性試驗結(jié)果,選擇活性高的先導(dǎo)化合物進行動物體內(nèi)藥效學(xué)、藥代動力學(xué)(體外穩(wěn)定性、生物利用度、半衰期等)和安全性評價(急性毒性)等初步成藥性研究。技術(shù)路線:(1)系列A合成路線:Scheme 1. Reagents and conditions: i) K2CO3, DMF, 100 C, 6 h, (ii) SOCl2, reflux, 2 h.Scheme 2. (iii) (Boc)2O, N2 protection, DCM, ice bath for 20
12、min, for overnight, (iv) K2CO3, DCM, r.t., 20 min, (v) TFA, DCM, r.t., 5 h, (vi) ArSO2Cl, Et3N, THF, r.t., 20 min.(2)系列B合成路線Scheme 3. Reagents and conditions: i) a. K2CO3, CuI, DMSO, 1,10-Phenanthroline, 120-125 C, 12-24 h, b. NaOH, H2O, MeOH, (ii) SOCl2, reflux, 2 h.Scheme 4. (iii) (Boc)2O, N2 prot
13、ection, DCM, ice bath for 20 min, for overnight, (iv) K2CO3, DCM, r.t., 20 min, (v) TFA, DCM, r.t., 5 h, (vi) ArSO2Cl, Et3N, THF, r.t., 20 min.三、設(shè)計(論文)的研究重點及難點:(1) 化合物結(jié)構(gòu)的合理設(shè)計 根據(jù)FXa的化學(xué)生物學(xué)信息,以及生物電子等排體原理,對先導(dǎo)化合物的P4區(qū)、linker區(qū)和P1區(qū)進行結(jié)構(gòu)改造,以改善藥理活性,構(gòu)建對FXa選擇性高、毒性低的新型FXa抑制劑。(2) 發(fā)現(xiàn)高效、低毒的新型FXa抑制劑類抗凝血候選藥物通過體外抗凝血活性試
14、驗、FXa抑制活性試驗,發(fā)現(xiàn)新型FXa抑制劑先導(dǎo)化合物;并進一步動物體內(nèi)初步成藥性評價,以發(fā)現(xiàn)新型抗凝血候選藥物。四、 設(shè)計(論文)研究方法及步驟(進度安排):研究方法:根據(jù)先導(dǎo)化合物與FXa的結(jié)合模式和生物電子等排原理,將先導(dǎo)化合物的P4區(qū)以體積更大、疏水性更強的嗎啉聯(lián)吡啶基團或戊內(nèi)酰胺聯(lián)苯基團替代,使得該區(qū)域能更好地契合入FXa的S4口袋,并與周圍的疏水性氨基酸形成-堆積作用;linker區(qū)保留氨基芐胺,以砜基連接氨基芐胺和P1區(qū),砜基作為比羰基更強的電子供體,可以與FXa的氨基酸形成更強的氫鍵,甚至是雙重氫鍵;P1區(qū)采用多種不同的小體積芳香性基團。由此,我們構(gòu)建了A、B兩個系列FXa抑制
15、劑。運用Sybyl-X中Surflex模塊對構(gòu)建的虛擬化合物庫A、B進行虛擬活性評價;運用DS毒性預(yù)測軟件TOPKAT模塊建立模型,對設(shè)計的目標(biāo)化合物的毒理學(xué)性質(zhì)進行預(yù)測,同時運用Sybyl-X中VOLSURF模塊對化合物的吸收、分布、代謝、排泄(ADME)性質(zhì)進行預(yù)測。最后根據(jù)化合物的藥理活性、毒理學(xué)性質(zhì)和ADME性質(zhì)的預(yù)測結(jié)果,確定欲合成的目標(biāo)化合物。實驗方案:(1)目標(biāo)化合物的抗凝血活性實驗:目標(biāo)化合物的抗凝血活性由化合物對血漿凝血酶原時間的影響來評價。根據(jù)不同化合物濃度對貧血小板血漿凝血時間的延長時間不同,得到化合物的抗凝血活性。檢測原理:貧血小板血漿加入鈣離子等凝血誘導(dǎo)劑后,開始凝血
16、過程。由于一部分纖維蛋白凝聚,血漿的濁度便下降,在檢測儀器上就表現(xiàn)為血漿的透光度上升。目標(biāo)化合物如果能夠很好地抑制血漿中的FXa的活性,則可延緩凝血過程,使凝血酶原時間延長,血漿的透光率上升速度變緩。方法:按常規(guī)方法制備PPP,在EP管中加入PPP 血漿和待測藥物溶液,孵育一段時間后置于凝血酶原時間測定儀下記錄凝血酶原時間。1)貧血小板血漿(platelet-poor-plasma, PPP)的制備家兔心臟取血,將配制好的枸椽酸鈉抗凝劑以V血/V枸櫞酸鈉 = 9:1加入全血中,充分混勻后自然沉降30 min。之后將血液在離心機中以3000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,得到PPP。(室溫放
17、置時不超過2 h,若28 保存應(yīng)不超過4 h)。用塑料試管存放血漿,并用塑料吸管移取標(biāo)本。實驗前應(yīng)檢查血漿是否有溶血,黃疸,脂血或出現(xiàn)凝塊。2)藥品溶液的配制稱取10 mol化合物,加入1 mL DMSO,震蕩,使其溶解并混勻,得到104 mol/L的母液。加藥組:取400 L貧血小板血漿(PPP),加入100 L不同濃度的化合物溶液(以PPP稀釋化合物母液得到),使得到的血漿中化合物的終濃度為50 M,25 M,12.5 M, 6.25 M,3.125 M五個梯度。空白對照組:取500 L貧血小板血漿(PPP),不加化合物溶液。 3)凝血酶原時間的測定加藥組和空白對照組于37 下溫育1 mi
18、n,測定凝血酶原時間。通過對濃度-響應(yīng)曲線的回歸分析可以估算出能使凝血時間延長一倍(CT2)的化合物的濃度(PTCT2)。4)統(tǒng)計學(xué)處理通過測定凝血酶原時間,對濃度-響應(yīng)曲線進行統(tǒng)計學(xué)的處理,可以估算出能使凝血時間延長一倍的化合物的濃度。(2)目標(biāo)化合物的FXa抑制活性試驗:1)檢測原理及方法:FXa可以使發(fā)色底物S-2222分解為多肽和對硝基苯胺,后者在405 nm處有吸收高峰。加入FXa抑制劑后,對硝基苯胺的產(chǎn)生受到抑制,吸光度降低。用酶標(biāo)儀測定405 nm 處的OD值,由此可推算出FXa抑制劑對FXa的抑制活性。2)試驗步驟配制BSA buffer(牛血清白蛋白緩沖液):取0.01 mo
19、l(1.21 g)三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽,0.02 mol(1.16 g)氯化鈉,0.20 g 牛血清白蛋白,加100 mL三蒸水,搖勻,得到0.1 M三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽- 0.2 M 氯化鈉- 0.2% 牛血清白蛋白緩沖液 (pH = 7.4),待用。藥品溶液的配制:取10 mol化合物,加入100 L DMSO,震蕩,使溶解并混勻,得到105 mol/L的化合物母液。按遞倍稀釋法定量稀釋至規(guī)定濃度,最終濃度分別為1000 M,200 M,40 M,8 M,1.6 M,待用。FXa抑制活性的測定:于96孔板中,每孔加入10 L上述已配好的不同濃度的藥液(空白組中加5% DMSO
20、10 L),和10 L的0.0625 U/mL的human FXa,以40 L的BSA緩沖液(pH 7.4)混合均勻。37下孵育15 min。之后加入0.75 M 發(fā)色底物S-2222(40 L),震蕩10s后,于室溫下孵育3 h。酶標(biāo)儀下測定各孔在405 nm的吸光度。3)統(tǒng)計學(xué)處理:FXa抑制活性 = 1-(OD/min)sample/(OD/min)control。IC50值由FXa抑制活性和化合物的濃度曲線得出。(3)初步成藥性評價:體內(nèi)FXa抑制活性和抗凝血活性:雄性Wistar大鼠禁食過夜。將化合物溶于0.5% 甲基纖維素溶液,通過灌胃給藥??刂平M大鼠則只口服給予0.5% 甲基纖維
21、素溶液。取血時,將大鼠以氟烷麻醉之后取血,取出的血加檸檬酸鈉抗凝。將血樣離心,取貧血小板血漿用來測定FXa抑制劑的FXa抑制活性和抗凝血活性。1)FXa抑制活性:血漿 (5 L) 與0.1 M Tris-0.2 M NaCl-0.2% BSA buffer (pH 7.4; 40 L)、H2O (5 L), 和 0.1 U/ml human FXa (10 L) 混合。加入0.75 M S-2222 (40 L)之后,F(xiàn)Xa對S-2222的酶解反應(yīng)開始?;旌弦涸谑覝叵聰嚢?0 S之后,于405 nm下測定光密度的增加值(OD/min)。FXa抑制活性(inhibition %)由以下公式計算出
22、:anti-Xa activity ) = 1 - (OD/min) of sample/(OD/min) of control。 2)抗凝血活性:在封尾管中,將血漿 (20 L) 與溶于生理鹽水的FXa抑制劑 (20 L) 混合。將混合血漿中加入促凝血酶原 (40 L),開始凝血過程??鼓钚灾涤赡冈瓡r間的延長來計算得到。(4)初步的藥代動力學(xué)評價: 響列和設(shè)計wenxian好的耐受性而被廣泛應(yīng)用,88888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888
23、888888881)體外化學(xué)穩(wěn)定性初步實驗:方法的專屬性:選定合適的色譜條件,使得待測化合物和陽性對照藥有較好的分離度,在此條件下所測得的結(jié)果能代表各個待測成分濃度。精密稱取待測化合物,置于容量瓶中,分別用稀釋劑磷酸二氫鉀(pH 3.0/pH 7.0)超純水溶液:乙腈溶解并稀釋至刻度,于37水浴溫孵,每隔一段時間(1小時、2小時、4小時、8小時、24小時)用RP-HPLC采用歸一法對峰面積進行積分,測定溶液中待測化合物的濃度,設(shè)3組平行試驗,同時測定陽性對照藥利伐沙班。在酸性和中性條件下,同一時間檢測的含量越多說明該化合物穩(wěn)定性越好。2)在人工模擬胃腸液中穩(wěn)定性初步實驗:人工模擬胃液:9 mL
24、濃HCl,加水約50 mL及胃蛋白酶1 g充分溶解后,調(diào)pH = 1.2,定容100 mL;人工模擬腸液:稱取0.68g KH2PO4溶于50 mL水中,用0.4NaOH溶液,調(diào)pH = 6.8,另取1 g胰蛋白酶加水溶解,定容至100 mL;實驗過程:稱取待測化合物分別溶于3份平行的模擬胃液或腸液中,置37水浴溫孵,于設(shè)定時間點0、10 min、20 min、30 min、60 min、120 min、180 min、240 min、300 min、360 min抽取溶液100 L,用流動相稀釋至1 mL,經(jīng)孔徑為0.45 L的微孔濾膜過濾后上樣,采用歸一法對峰面積進行積分。測定溶液中化合物的濃度,同時測定陽性對照藥拉米夫定、替比夫定、恩替卡韋、恩曲他濱、阿德福韋酯。得到所測樣品濃度百分比隨時間的變化曲線,并計算出其水解半衰期
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