核酶與抗體酶課件

1、核酶與抗體酶1 主講主講 陳陳 惠惠 核酶與抗體酶2 l一、概述 l二、剪接型核酶 l三、剪切型核酶 l四、核酶的應(yīng)用 l五、核酶技術(shù)面臨的問題 l六、脫氧核酶（deoxyribozyme) 核酶與抗體酶3 1、對(duì)酶及生物催化劑的認(rèn)識(shí)的發(fā)展對(duì)酶及生物催化劑的認(rèn)識(shí)的發(fā)展 生物催化劑生物催化劑 （Biocatalyst） 蛋白質(zhì)類：天然酶蛋白質(zhì)類：天然酶 enzyme 極端酶極端酶 extremozyme 抗體酶抗體酶 abzyme 生物工程酶生物工程酶 其它：模擬酶其它：模擬酶 核酸類核酸類: 克隆酶克隆酶 遺傳修飾酶遺傳修飾酶 蛋白質(zhì)工程新酶蛋白質(zhì)工程新酶 、 Ribozyme Deoxyri

2、bozyme 核酶與抗體酶4 2、長(zhǎng)期以來，人們認(rèn)為只有某些蛋白質(zhì)才有生 物催化功能。但近些年研究發(fā)現(xiàn)，某些RNA分 子也具有生物催化功能，被稱為Ribozyme。 1982年Cech等發(fā)現(xiàn)四膜蟲細(xì)胞大核期間 26SrRNA前體具有自我剪接功能，并于1986年 證明其內(nèi)含子L-19IVS具有多種催化功能。1984 年Altman等發(fā)現(xiàn)RNaseP的核酸組分M1RNA具有 該酶的活性，而該酶的蛋白質(zhì)部分C5蛋白并無 酶活性。Cech和Altman因發(fā)現(xiàn)Ribozyme而獲得 1989年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 核酶與抗體酶5 l3、核酶作用的特點(diǎn) l 化學(xué)本質(zhì) RNA l 底物 RNA 肽鍵 -葡聚糖分

3、支酶 l 反應(yīng)特異性(專一性）堿基 l 催化效率 低 l 產(chǎn)物 核酶與抗體酶6 剪切型核酶 剪接型核酶 根據(jù)催化反應(yīng) 錘頭核酶 I內(nèi)含子 II內(nèi)含子 發(fā)夾核酶 丁型肝炎病毒（HDV)核酶 RNaseP 4.核酶的分類 核酶與抗體酶7 l剪接型核酶的作用機(jī)制是通過既剪有接 的方式除去內(nèi)含子（Intron). l剪接型核酶分類 l1、I類內(nèi)含子 2、II類內(nèi)含子 核酶與抗體酶8 l剪接機(jī)制剪接機(jī)制 lL-19IVS在體外的多種酶活性在體外的多種酶活性 l核酶是一種金屬依賴酶核酶是一種金屬依賴酶 l結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 l 引導(dǎo)序列：引導(dǎo)序列：IVS中的中的6個(gè)嘌呤核苷酸序列個(gè)嘌呤核苷酸

4、序列 l 5CUCUCU3 l 3GGGAGG5 l G結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn):IVS 中的中的 P7莖區(qū)莖區(qū) l 空間結(jié)構(gòu)空間結(jié)構(gòu) 核酶與抗體酶9 l金屬離子的作用金屬離子的作用： l1、特異的結(jié)構(gòu)作用，或參與活性部位的、特異的結(jié)構(gòu)作用，或參與活性部位的 化學(xué)過程化學(xué)過程 l2、促進(jìn)、促進(jìn)RNA的總體折疊的總體折疊 l3、二價(jià)金屬離子（如、二價(jià)金屬離子（如Mg 2+ ）與底物活與底物活 性部位直接相互作用，參與過渡中間復(fù)性部位直接相互作用，參與過渡中間復(fù) 合物的形成合物的形成 核酶與抗體酶10 l剪接機(jī)制 l結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 核酶與抗體酶11 l1、自身催化剪切型RNA l 1、1 剪切機(jī)制 l

5、1、2 結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 l 錘頭結(jié)構(gòu) (Hammerhead) l 發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Hairpin) l 斧頭結(jié)構(gòu)(Axehead) l 假結(jié)樣結(jié)構(gòu)(Pseudoknot-like) l 1、3 影響核酶活性的因素 核酶與抗體酶12 l2、異體催化剪切型RNA l 核糖核酸酶P(RNaseP)是內(nèi)切核酸酶，是核 糖核蛋白體復(fù)合物，能剪切所有tRNA前體的 5端，除去多余的序列，形成3-OH 和 5- 磷酸末端。 l RNaseP由M1RNA和蛋白質(zhì)亞基組成。 l體外： M1RNA具催化作用 l 蛋白質(zhì)作為輔助因子 l體內(nèi)： M1RNA和蛋白質(zhì)對(duì)酶活性都是必需的。 l 2、1剪切機(jī)制 Mg 2+ l

6、 2、2結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 M1RNA 5端完 整結(jié)構(gòu)對(duì)維持催化活性是必需的。 核酶與抗體酶13 RNaseP可剪切可剪切 前體前體5端端41nt, 5 端成熟。不同端成熟。不同 tRNA的的 5 端沒端沒 有順序共同性，剪有順序共同性，剪 切的準(zhǔn)確性與剪切切的準(zhǔn)確性與剪切 部位周圍的核苷酸部位周圍的核苷酸 順序無關(guān)，表明在順序無關(guān)，表明在 RNaseP的組分內(nèi)的組分內(nèi) 沒有引導(dǎo)序列，沒有引導(dǎo)序列， RNaseP所識(shí)別的所識(shí)別的 是底物的是底物的高級(jí)結(jié)構(gòu)高級(jí)結(jié)構(gòu)。 RNaseP底物的二級(jí)結(jié)構(gòu)底物的二級(jí)結(jié)構(gòu) 剪切位點(diǎn)剪切位點(diǎn) 核酶與抗體酶14 核酶與抗體酶15 1、轉(zhuǎn)核苷酸作用轉(zhuǎn)核苷酸作用 2Cp

7、CpCpCpC CpCpCpCpCpC +CpCpCpC 2、水解作用水解作用 CpCpCpCpC CpCpCpC + pC 3、轉(zhuǎn)磷酸作用轉(zhuǎn)磷酸作用 CpCpCpCpCpCp+UpCpU CpCpCpCpCpC + UpCpUp 4、去磷酸作用去磷酸作用 CpCpCpCpCp CpCpCpCpC +Pi 5、限制性內(nèi)切酶作用限制性內(nèi)切酶作用 CpUpCpUpN +G CpUpCpU +GpN 核酶與抗體酶16 核酶在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用 1、核酶抗肝炎病毒的研究 目前人們已進(jìn)行了核酶抗甲型肝炎病毒（HAV)、乙型肝炎 病毒（ HBV）、丙型肝炎病毒（ HCV）以及HDV作用的研 究。人工設(shè)計(jì)核酶多為

8、錘頭狀結(jié)構(gòu)，少部分是采用發(fā)夾狀核 酶。 2、抗人類免疫缺陷病毒型（HIV- )核酶 1998年，美國(guó)加利福尼亞大學(xué)Wong-Staal等利用發(fā)夾核酶 抑制HIV- 基因表達(dá)，并率先進(jìn)入臨床期。 3、抗腫瘤治療 核酶能在特定位點(diǎn)準(zhǔn)確有效地識(shí)別和切割 腫瘤細(xì)胞的mRNA,抑制腫瘤基因的表達(dá)，達(dá)到治療腫瘤的目 的。 核酶與抗體酶17 五、核酶技術(shù)面臨的問題五、核酶技術(shù)面臨的問題 1、核酶催化切割反應(yīng)的可 逆性問題 2、提高催化效率 3、尋找合適載體將核酶高效、特異地導(dǎo)入靶 細(xì)胞 4、使核酶在細(xì)胞內(nèi)有調(diào)控地高效表達(dá) 5、增強(qiáng)核酶在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性 6、對(duì)宿主的損傷問題有待進(jìn)一步考察 核酶與抗體酶18 六

9、、脫氧核酶的研究 1、體外選擇技術(shù)篩選脫氧核酶分子 脫氧核酶分子的體外選擇是通過優(yōu)先擴(kuò)增事先固定在固相載體 上的具有自我裂解功能的活性分子來實(shí)現(xiàn)的。通過這一技術(shù)已 有兩種具有RNA裂解活性的脫氧核酶被篩選出來。8-17，10-23。 2、脫氧核酶催化特征 10-23裂解位點(diǎn)為嘌呤、嘧啶連接 雙鏈穩(wěn)定性越高，酶活性越高 結(jié)合臂的長(zhǎng)度影響酶催化轉(zhuǎn)換性 RNA-DNA 比 RNA-RNA 穩(wěn)定 性差。 對(duì)Mg 2+,Zn 2+,Ca 2+,Mn 2+有依賴性 組氨酸，精氨酸促進(jìn)催化活性 極強(qiáng)的切割特異性（單堿基錯(cuò)配即可大幅降低切割活性） 核酶與抗體酶19 10-23型脫氧核酶作用機(jī)理型脫氧核酶作用機(jī)

10、理 R Y R RNA substrate切割點(diǎn)切割點(diǎn) R=A or G Y=C or U deoxyribozyme 5 3 核酶與抗體酶20 手槍型脫氧核酶自我剪切作用機(jī)理手槍型脫氧核酶自我剪切作用機(jī)理 莖莖II (催化部位催化部位) 莖莖I(結(jié)合部位結(jié)合部位) 5 3 3 C A 切割點(diǎn)切割點(diǎn) 10 20 30 40 核酶與抗體酶21 p 3 HO-G p 3 p P-G OH p P-G 3 HO 類內(nèi)含子的剪接機(jī)制 Mg 2+或Mn 2+ GMP,GDP,GTP 外顯子外顯子 內(nèi)含子或居間序列內(nèi)含子或居間序列 （Intervening sequence,IVS) 5 核酶與抗體酶22

11、 p 2 HO-A p p-A p 3 OH p P-A HO 3 類內(nèi)含子的剪接機(jī)制 Mg 2+ 套環(huán)的形成套環(huán)的形成 5 3 外顯子連接外顯子連接 核酶與抗體酶23 B A A 5 B BA B A PCR PCR 5 5 5 Streptavidin Column NaOH cofactor 體外選擇技術(shù)篩選具有自我裂 解功能的DNA分子 N50(DNA分子庫） 核酶與抗體酶24 類內(nèi)含子二級(jí)結(jié)構(gòu)通式類內(nèi)含子二級(jí)結(jié)構(gòu)通式 保守序列保守序列 G結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn) 剪接部位剪接部位 引導(dǎo)序列引導(dǎo)序列 核酶與抗體酶25 類內(nèi)含子有一個(gè)保類內(nèi)含子有一個(gè)保 守的二級(jí)結(jié)構(gòu)：守的二級(jí)結(jié)構(gòu)： 結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域

12、：兩個(gè)保守：兩個(gè)保守 內(nèi)含子結(jié)構(gòu)序列內(nèi)含子結(jié)構(gòu)序列 EBS1,EBS2與兩個(gè)外與兩個(gè)外 顯子結(jié)構(gòu)序列顯子結(jié)構(gòu)序列 IBS1,IBS2互相配對(duì)?；ハ嗯鋵?duì)。 結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域：高度保守，：高度保守， 催化活性必需。催化活性必需。 結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域：A 提供提供 2-OH 類內(nèi)含子二級(jí)結(jié)構(gòu)模式類內(nèi)含子二級(jí)結(jié)構(gòu)模式 5 3 核酶與抗體酶26 5個(gè)環(huán)和4個(gè)螺旋形成兩個(gè) 結(jié)構(gòu)域 剪切反應(yīng)發(fā)生在底物識(shí)別 序列GUC的5端 兩個(gè)內(nèi)部環(huán)中的堿基及在 螺旋區(qū)的G11和底物中 的G+1都是酶發(fā)揮作用所 必需的。 5 3 發(fā)夾二級(jí)結(jié)構(gòu)模型 剪切位點(diǎn) 核酶與抗體酶27 HDV RNA斧頭結(jié)構(gòu)模式 三個(gè)堿基對(duì)的莖三個(gè)堿基對(duì)的莖

13、需要二價(jià)陽離子，需要二價(jià)陽離子， 產(chǎn)生產(chǎn)生5-OH和和 2,3-環(huán)環(huán) 磷酸磷酸 剪切部位剪切部位 剪切部位剪切部位 核酶與抗體酶28 這類這類RNA進(jìn)行自進(jìn)行自 身催化的反應(yīng)是只切身催化的反應(yīng)是只切 不接。不接。 特點(diǎn)特點(diǎn)：在：在 Mg 2+ 或其或其 他二價(jià)金屬離子存在他二價(jià)金屬離子存在 下，在特定的位點(diǎn)，下，在特定的位點(diǎn)， 自我剪切，產(chǎn)生自我剪切，產(chǎn)生5- OH 和和2，3-環(huán)磷環(huán)磷 酸二酯末端酸二酯末端。 剪剪 切切 機(jī)機(jī) 制制 核酶自身剪切反應(yīng)核酶自身剪切反應(yīng) 核酶與抗體酶29 mRNA剪接過程剪接過程 mRNA剪接反應(yīng)是剪接反應(yīng)是 在剪接體（在剪接體（splicesome) 上進(jìn)行的

14、上進(jìn)行的. 5種種snRNA 剪接體剪接體 50多蛋白質(zhì)多蛋白質(zhì) 核酶與抗體酶30 錘頭結(jié)構(gòu)的錘頭結(jié)構(gòu)的 五種類型五種類型 R示酶，示酶，S示底物，箭頭示剪切位點(diǎn)示底物，箭頭示剪切位點(diǎn) 核酶與抗體酶31 建議的建議的L19 RNA催化機(jī)理催化機(jī)理 核酶與抗體酶32 錘頭型核酶對(duì)切割位點(diǎn)的識(shí)別錘頭型核酶對(duì)切割位點(diǎn)的識(shí)別 位點(diǎn)遵守位點(diǎn)遵守NHH規(guī)則（規(guī)則（N代表任代表任 意核苷酸，意核苷酸，H代表代表A,U或或C）。）。 催化過程需要二價(jià)金屬離子參催化過程需要二價(jià)金屬離子參 與。與。 單金屬離子催化單金屬離子催化 雙金屬離子催化雙金屬離子催化 核酶與抗體酶33 核酶與抗體酶34 錘頭型核酶的二級(jí)結(jié)

15、構(gòu) 和空間立體結(jié)構(gòu)示意圖 三個(gè)雙螺旋區(qū) 13個(gè)核苷酸殘基保 守序列 剪切反應(yīng)在右上方 GUX序列的3端 自動(dòng)發(fā)生 核酶與抗體酶35 UCUAAA IVS GUAA Pre-rRNA UCU A A A GUAA UCUoH3 5GAA A GUAA UCUUAA 5GAAA GOH 3 G-IVS L-19IVS 19nt 5 3 rRNA 5 3 5 pGOH 3 5 3 四膜蟲rRNA前體自我剪接反應(yīng) 核酶與抗體酶36 C C C U C U O P + HOG 3 OA o o o C C C U C U O P OA o O G C C C U C U OH + P-oG o Ao o

16、 過渡態(tài) 核酶與抗體酶37 C C C U C U O P OA o O G o C C C U C U O P OA o O G Mg 2+ Mg 2+ o 過渡態(tài) 金屬離子催化 核酶與抗體酶38 核酶與抗體酶39 l二級(jí)結(jié)構(gòu)模型 l錘頭二級(jí)結(jié)構(gòu)編號(hào) l錘頭結(jié)構(gòu)的類型 l錘頭核酶的催化反應(yīng)機(jī)制 核酶與抗體酶40 17位（位（ X ）的核苷酸殘的核苷酸殘 基多數(shù)是基多數(shù)是C,不能是不能是U,G. 7位核苷酸殘基的置換位核苷酸殘基的置換 不會(huì)對(duì)酶活性產(chǎn)生很大不會(huì)對(duì)酶活性產(chǎn)生很大 影響影響 錘頭二級(jí)結(jié)構(gòu)編號(hào)錘頭二級(jí)結(jié)構(gòu)編號(hào) 7位核苷酸位核苷酸 17位核苷酸 核酶與抗體酶41 l 發(fā)夾核酶發(fā)現(xiàn)于三種

17、不同植物RNA病毒，即 煙草環(huán)點(diǎn)病毒，菊苣黃色斑點(diǎn)病毒型和筷子芥 花葉病毒。三種發(fā)夾核酶分別是這些RNA病毒 衛(wèi)星RNA的負(fù)鏈，英文縮寫分別是 sTRSV,sCYMVT,sARMV,均為單鏈RNA。 l 發(fā)夾核酶結(jié)構(gòu)模型 l 發(fā)夾核酶催化機(jī)制 金屬離子在催化反應(yīng) 中起結(jié)構(gòu)作用，其剪切活性比錘頭結(jié)構(gòu)核酶高。 核酶與抗體酶42 G U A C G G C C G G U G C C G G C U G G G GC A U U C C G A G G G G A C CAA G U A A U G G C U C C C C U G c C G G G U C C A G C C U U C C G C C U C A G G U A A G C G 3 5 剪切 位點(diǎn) HDV 核酶假結(jié)樣結(jié)構(gòu) L3 L4 J1/2 J1/4 J2/4 四個(gè)螺旋區(qū)，三個(gè)連接區(qū)，兩 個(gè)環(huán) 活性中心區(qū)： J1/4, J2/4, L3 剪切位點(diǎn)：688/689 核酶與抗體酶43 l1、pH值對(duì)活性的影響值對(duì)活性的影響 pH70 - 7 5 時(shí)核酶活性最高。時(shí)核酶活性最高。 l2、二價(jià)金屬陽離子對(duì)活性的影響、二價(jià)金屬陽離子對(duì)活性的影響 Mg 2+ Mn 2+ l3、抗生素對(duì)活性的影響、抗生素對(duì)活性的影響 大多數(shù)為抑制效應(yīng)大多數(shù)為抑制效應(yīng) l4、變形劑對(duì)活性的影響、變形劑對(duì)活性的影響 l5、溫度對(duì)活