組織乙酰輔酶A羧化酶ACETYL-COACARBOXYLASE活

1、組織乙酰輔酶 A 羧化酶( ACETYL-COA CARBOXYLASE )活性光度法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書(中文版)主要用途組織乙酰輔酶 A 羧化酶( ACETYL-COA CARBOXYLASE )活性光度法定量檢測試劑是一種旨在通過底 物乙酰輔酶 A 和碳酸氫鹽受到乙酰輔酶 A 羧化酶的催化反應(yīng)后， 進(jìn)而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán) 法反應(yīng)系統(tǒng)，測定產(chǎn)生 ADP 過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸( NADH )的氧化反應(yīng)， 即采 用光度法測定其氧化后峰值的變化，以分析組織裂解樣品中乙酰輔酶 A 羧化酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方 法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于

2、各種組織裂解萃取液樣品(動(dòng)物、人體) 、部分或完 全純化酶樣品中乙酰輔酶 A 羧化酶活性的定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即 用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。技術(shù)背景乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl CoA Carboxylase ; ACC ; EC6.4.1.2),又稱為乙酰輔酶 A碳酸氫鹽連接酶(Acetyl CoA : bicarbonate ligase-ATP),是ATP依賴性含生物素酶，參與脂肪酸生物合成。哺乳動(dòng)物乙酰輔酶A羧化酶單體分子量為225 - 250Kd，含有許多磷酸化位點(diǎn)，以及 1個(gè)生物素輔基位點(diǎn)、2個(gè)催化位點(diǎn)和1個(gè)異構(gòu)(allosteric)位

3、點(diǎn)。乙酰輔酶A羧化酶催化生物素輔基(prosthetic group)的羧基化反應(yīng)，然后將生物素上 的羧基轉(zhuǎn)移到輔酶A上，產(chǎn)生丙二酰輔酶 A (malonyl CoA )，成為長鏈脂肪酸合成前的關(guān)鍵步驟。AMP活化蛋白激酶 (AMP-Activated Kinase ； AMPK )調(diào)節(jié)該酶的活性， 而十四烷基氧糠酸 ( 5-(tetradecyloxy)-2-furoic acid; TOFA)抑制該酶的活性?；诘孜镆阴］o酶A ( acetyl CoA)和碳酸氫鹽，在 ATP的存在下，受到乙酰輔酶A羧化酶的催化，獲得產(chǎn)物丙二酰輔酶A和ADP，進(jìn)而通過丙酮酸激酶(pyruvate kinas

4、e； PK)和乳酸脫氫酶( lactate dehydrogenase； LDH )反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸( reduced nicotinamide adenine dinucleotide； NADH )轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸( oxidized nicotinamide adenine dinucleotide ; NAD )，其吸光峰值的變化(340nm)，來定量分析乙酰輔酶 A羧化酶的活性。其反應(yīng)方式為：Acetyl CoA CarboxylaseAcetyl Co-A + ATP + HCO3 t Malonyl CoA + ADP + Pipyruvat

5、e kinasePhosphoenolpyruvate + ADPt pyruvate + ATPlactate dehydrogenasepyruvate + NADHlactateNAD460 毫升 10毫升20 毫升2 毫升2 毫升2 毫升500 微升1份(高吸收峰)(低吸收峰)產(chǎn)品內(nèi)容清理液( Reagent A) 裂解液( Reagent B) 緩沖液( Reagent C) 酶促液( Reagent D) 反應(yīng)液( Reagent E) 底物液( Reagent F) 陰性液( Reagent G) 產(chǎn)品說明書保存方式保存 清理液(Reagent A)在4 C冰箱里；其余的保存在2

6、0 C冰箱里，避免反復(fù)凍融；有效保證 6月用戶自備1.5 毫升離心管：用于樣品保存的容器15 毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器DOUNCE 勻漿器：用于裂解組織(微型)臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品預(yù)處理1 厘米光徑比色皿或 96 孔板：用于光度分析操作的容器 分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于樣品光度分析實(shí)驗(yàn)步驟一、 待測樣品準(zhǔn)備1 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重500 毫克組織重量2 (選擇步驟)放進(jìn)預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管3.(選擇步驟)加入 3毫升清理液(Reagent A)清洗4 (選擇步驟)抽去清理液5. 移入到一個(gè)液氮凍存管6. 即刻放進(jìn)液氮罐過夜7. 次日從液氮罐里取出，即刻(最快速度)用研磨棒碾

7、碎組織成粉末狀(注意：切莫使組織凍融 )8. 放進(jìn)一個(gè) 15 毫升錐形離心管9. 加入置于冰槽里預(yù)冷的 500 微升 裂解液( Reagent B)10. 渦旋震蕩 5 秒，充分混勻11. 即刻放入預(yù)冷的 DOUNCE 勻漿器12. 在冰槽里用勻漿棒勻化組織(約80 下)13. 將所有組織勻漿物移入 15 毫升錐形離心管14. 即刻放進(jìn)4C臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g15. 小心移取上清液到新的無菌的1.5 毫升離心管16. 移取 10 微升進(jìn)行蛋白定量檢測(注意： 建議使用 Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒 S30030.1) 仃.放進(jìn)-70C的冰箱里保存或置于冰槽里備用

8、二、 測定準(zhǔn)備1.準(zhǔn)備好待測樣品(例如組織裂解懸液等)，置于冰槽里2.設(shè)定好分光光度儀(溫度為 37C):波長為340nm，間隔1分鐘，讀數(shù)6次(共5分鐘)，并置零3.三、緩沖液( Reagent C) 室溫下均衡溫度 背景對(duì)照測定1.移取 650 微升 緩沖液( Reagent C) 到新的比色皿2.加入 100 微升 酶促液( Reagent D)3.加入 100 微升 反應(yīng)液( Reagent E)4.加入 100 微升 底物液( Reagent F)5.放進(jìn)37 C培養(yǎng)箱里靜置3分鐘6.加入 50 微升 陰性液( Reagent G)7.上下傾倒數(shù)次，混勻(限定在 3 秒之內(nèi))8.四、

9、即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對(duì)照：340波長讀數(shù) 0分鐘 340波長讀數(shù) 5分鐘樣品測定1.移取 650 微升 緩沖液( Reagent C) 到新的比色皿2.加入 100 微升 酶促液( Reagent D)3.加入 100 微升 反應(yīng)液( Reagent E)4.加入 100 微升 底物液( Reagent F)5.放進(jìn)37 C培養(yǎng)箱里靜置3分鐘6 加入 50 微升待測樣品（注意： 50 微克組織裂解蛋白；樣品須溶解 ）7 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)） 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品活性讀數(shù)： 340 波長讀數(shù) 0分鐘 340 波長讀數(shù) 5分鐘 五、 計(jì)算樣品活性（樣品

10、讀數(shù)背景讀數(shù)） X 1 （體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)衛(wèi).05 （樣品容量；毫升）X 6.22 （毫摩 爾吸光系數(shù)）X 5 （反應(yīng)時(shí)間；分鐘）=單位/毫升（樣品蛋白濃度）毫克/毫升=單位/毫克 單位=微摩爾NADH/分鐘六、 酶標(biāo)儀測定1 在 96 孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品2.分別移取130微升 緩沖液（Reagent C）到96孔板里3 分別加入 20 微升 酶促液（ Reagent D）4. 分別加入 20 微升 反應(yīng)液（ Reagent E）5. 分別加入 20 微升 底物液（ Reagent F）6. 輕輕搖動(dòng) 96 孔板7. 在37C溫度下孵育3分鐘8. 分別加入 10微

11、升 陰性液（ Reagent G） 或待測樣品（ 20微克組織裂解懸液蛋白）到相應(yīng)孔里（注意： 樣品須清澈）9. 輕輕搖動(dòng) 96 孔板10. 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測： 0 分鐘讀數(shù)和 5 分鐘讀數(shù)11 .活性計(jì)算：（樣品讀數(shù)背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.2 （體系容量；毫升）0.01 （樣品容量；毫升）X 6.22 （毫 摩爾吸光系數(shù)）X 0.6 （光徑距離；厘米）X 5 （反應(yīng)時(shí)間；分鐘）=單位/毫升（樣品蛋白濃度）毫克/毫 升=單位/毫克單位=微摩爾NADH/分鐘注意事項(xiàng)I . 本產(chǎn)品為 20 次（比色皿）和 100 次（ 96 孔板）操作，包括背景對(duì)照2. 操作時(shí)，須戴手套3. 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需 1 次4. 樣品須澄清，至關(guān)重要5. 加入樣品啟動(dòng)反應(yīng)后 3 秒內(nèi)即刻光度測定6. 測定值由高到低變化；測定可持續(xù) 5 分鐘7. 光度測定后，比色皿須清洗徹底8. 樣本測定 0 分鐘讀數(shù)高于 5 分鐘讀數(shù)表明具有酶活性9. 建議待測樣本蛋白濃度為 50 微克 /50 微升（本公司提供Bradford 蛋白質(zhì)濃度