課題3土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)

1、專題專題3 3 土壤中分解尿素的細(xì)菌的土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離分離與與計數(shù)計數(shù)尿素尿素CO(NHCO(NH2 2) )2 2重要的農(nóng)業(yè)氮肥。重要的農(nóng)業(yè)氮肥。只能被土壤中細(xì)菌分解為只能被土壤中細(xì)菌分解為NHNH3 3才能被植物吸才能被植物吸收利用收利用 CO(NH CO(NH2 2) )2 2 + H + H2 2O COO CO2 2 +2NH+2NH3 3細(xì)菌脲酶細(xì)菌脲酶一、課題背景一、課題背景二、課題目標(biāo)二、課題目標(biāo)l1、從土壤中分離產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌l2、統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌三、研究思路三、研究思路 （一）篩選菌株（一）篩選菌株 提出的問題提出的問題 如何尋找如何尋找耐

2、高溫耐高溫的酶？的酶？ 解決問題的思路解決問題的思路 尋找尋找耐高溫耐高溫環(huán)境；環(huán)境； 原理原理 高溫淘汰其他菌，選出耐高溫細(xì)菌，高溫淘汰其他菌，選出耐高溫細(xì)菌， 耐高溫菌種提取耐高溫酶。耐高溫菌種提取耐高溫酶。（一）篩選菌株（一）篩選菌株KHKH2 2POPO4 4 1.4g 1.4g NaHPO NaHPO4 4 2.1g 2.1g MgSO MgSO4 4 H H2 2O 0.2gO 0.2g 葡萄糖葡萄糖 10.0g10.0g 尿素尿素 1.0g1.0g 瓊脂瓊脂 15.0g15.0g 將上述物質(zhì)溶解后，將上述物質(zhì)溶解后，用蒸餾水定容到用蒸餾水定容到1000mL1000mL。 該培養(yǎng)基

3、的配方中，為該培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮微生物的生長提供碳源和氮源的分別是什么物質(zhì)？源的分別是什么物質(zhì)？ 此配方能否篩選出產(chǎn)生此配方能否篩選出產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌？為什么？脲酶的細(xì)菌？為什么？碳源：葡萄糖、尿素碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素氮源：尿素能。只有產(chǎn)生脲酶的能。只有產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌能利用尿素作為氮細(xì)菌能利用尿素作為氮源而生存。源而生存。選擇培養(yǎng)基實例選擇培養(yǎng)基實例 (1)加入加入青霉素青霉素可以分離出混雜在細(xì)菌中的酵母菌和霉菌；可以分離出混雜在細(xì)菌中的酵母菌和霉菌； (2)加入加入高濃度的食鹽高濃度的食鹽可得到金黃色葡萄球菌；可得到金黃色葡萄球菌；(3)培養(yǎng)基中培養(yǎng)基中缺乏氮源

4、缺乏氮源時，可以分離固氮微生物；時，可以分離固氮微生物； (4)培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境中培養(yǎng)只能得到耐高溫的微生物；培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境中培養(yǎng)只能得到耐高溫的微生物； (5)培養(yǎng)基中的氮源只有尿素時，理論上只有能合成脲酶的培養(yǎng)基中的氮源只有尿素時，理論上只有能合成脲酶的微生物才能在上面生長。微生物才能在上面生長。 Dc 1顯微鏡直接計數(shù)法顯微鏡直接計數(shù)法 (1)原理：利用特定細(xì)菌計數(shù)板或血細(xì)胞計數(shù)板，在顯原理：利用特定細(xì)菌計數(shù)板或血細(xì)胞計數(shù)板，在顯微鏡微鏡 下計算一定容積的樣品中微生物數(shù)量。下計算一定容積的樣品中微生物數(shù)量。 (2)方法：用計數(shù)板計數(shù)。方法：用計數(shù)板計數(shù)。 (3)缺點：不能區(qū)分死菌與

5、活菌。缺點：不能區(qū)分死菌與活菌。 不適于對運動細(xì)菌的計數(shù)；不適于對運動細(xì)菌的計數(shù)； 需要相對高的細(xì)菌濃度；需要相對高的細(xì)菌濃度； 個體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；個體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察； （二）統(tǒng)計菌落數(shù)目：（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目：2 2、活菌計數(shù)法、活菌計數(shù)法 (1)原理：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。 (2)計算公式：每克樣品中的菌株數(shù)(CV)M其中C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)， V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL) ,M 代表稀釋倍數(shù)。 【例】若某一稀釋度下，

6、平板上生長的平均菌落數(shù)為80，涂布平板時所用的稀釋液體積為0.1ml,稀釋液的稀釋倍數(shù)為106，則每克樣品中的活菌數(shù)約為 。8108 例：兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測定同例：兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測定同 一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)。從對應(yīng)稀釋倍數(shù)為一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)。從對應(yīng)稀釋倍數(shù)為10106 6的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。 1 1、甲同學(xué)在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計的、甲同學(xué)在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)為菌落數(shù)為230230。 2 2、乙同學(xué)在該濃度下涂布了、乙同學(xué)在該濃度下涂布了A A、B B、C C三個平板，三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別為統(tǒng)計

7、的菌落數(shù)分別為2121、212212、256256，該同學(xué)以這三，該同學(xué)以這三個平板上菌落數(shù)的平均值個平板上菌落數(shù)的平均值163163作為統(tǒng)計結(jié)果。作為統(tǒng)計結(jié)果。 你認(rèn)為這兩位同學(xué)的作法正確嗎？如果有問題，你認(rèn)為這兩位同學(xué)的作法正確嗎？如果有問題，錯在哪？錯在哪？ 甲：沒有甲：沒有重復(fù)實驗重復(fù)實驗（至少涂布（至少涂布3 3個平板）個平板） 乙：乙：A A組結(jié)果誤差過大，不應(yīng)用于計算平均值組結(jié)果誤差過大，不應(yīng)用于計算平均值三個或三個以上50個左右30300低 利用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行尿素分解菌的分離利用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行尿素分解菌的分離過程中，從對應(yīng)稀釋倍數(shù)為過程中，從對應(yīng)稀釋倍數(shù)為10106 6的培養(yǎng)基

8、中，的培養(yǎng)基中，A A、B B兩同學(xué)分別得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。兩同學(xué)分別得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。 1 1、A A同學(xué)篩選出同學(xué)篩選出150150個菌落。個菌落。 2 2、B B同學(xué)篩選出同學(xué)篩選出5050個菌落。個菌落。 B B認(rèn)為認(rèn)為A A的培養(yǎng)基被雜菌污染了，或培養(yǎng)基的培養(yǎng)基被雜菌污染了，或培養(yǎng)基中混入了其他含氮物質(zhì)，因而導(dǎo)致不能分解尿中混入了其他含氮物質(zhì)，因而導(dǎo)致不能分解尿素的細(xì)菌也能在該培養(yǎng)基中生長。素的細(xì)菌也能在該培養(yǎng)基中生長。A A確認(rèn)自己確認(rèn)自己的操作無誤，但也拿不出能令人信服的證據(jù)。的操作無誤，但也拿不出能令人信服的證據(jù)。 請你幫助請你幫助A A同學(xué)改進(jìn)實驗，提供具有說明同學(xué)改進(jìn)實驗，提供具有說明了的證據(jù)。了的證據(jù)。DA 土壤土壤取樣取樣樣品樣品稀釋和涂布稀釋和涂布微生物的微生物的培養(yǎng)培養(yǎng)觀察并記錄觀察并記錄結(jié)果結(jié)果細(xì)菌細(xì)菌計數(shù)計數(shù) 三、實驗設(shè)計三、實驗設(shè)計( (以活菌計數(shù)法為例以活菌計數(shù)法為例) )制備培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基 從從肥沃、濕潤肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層的土壤中取樣。先鏟去表層土土3cm3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。信封中。取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要前都要滅菌滅菌。制備以制備以 為唯一氮源的為唯一氮源的 培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。（以