高等植物DNA的提取和純度鑒定

1、高等植物DNA的提取和純度鑒定總結(jié)報(bào)告藥學(xué)院08級(jí)本科一班周正昌3008213029闕夢(mèng)3008213030報(bào)告內(nèi)容l 預(yù)實(shí)驗(yàn)情況l 實(shí)驗(yàn)中問題l 同學(xué)的意見l 我們的總結(jié)一、預(yù)實(shí)驗(yàn)情況（按實(shí)驗(yàn)日期排列）9.10實(shí)驗(yàn)情況此次是我們第一次正式實(shí)驗(yàn)先前培養(yǎng)了小麥，發(fā)現(xiàn)霉變現(xiàn)象。進(jìn)行了基礎(chǔ)的配液工作，將實(shí)驗(yàn)需要的試劑進(jìn)行量取和稱量。向老師學(xué)習(xí)了凝膠電泳的使用方法和凝膠的制作。處理：經(jīng)過我們的討論和詢問老師得知小麥每天需要清洗才能保證霉菌被去除。（只需麥芽的生長(zhǎng)速度快于霉菌即可）。初步確定了實(shí)驗(yàn)時(shí)需要的試劑的量和規(guī)格，和老師溝通，解決實(shí)驗(yàn)時(shí)藥品供應(yīng)。9.11實(shí)驗(yàn)情況實(shí)驗(yàn)任務(wù)：完成第一次DNA的提取。實(shí)

2、驗(yàn)過程：小麥芽已經(jīng)部分長(zhǎng)成，摘取合適長(zhǎng)度的小麥芽進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其他的小麥芽繼續(xù)放入恒溫箱培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)由于在液氮研磨過程中缺乏液氮保護(hù)，造成研磨時(shí)小麥芽不能成細(xì)分狀。（此現(xiàn)象會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響）按步驟完成實(shí)驗(yàn)的提取過程。實(shí)驗(yàn)問題研磨：由于小麥芽比較長(zhǎng)，且較多量的小麥芽接觸液氮后相互間間隙很大，比較蓬松且脆，研磨時(shí)很容易使得小麥芽的磨碎物蹦出使得小麥芽損失。研磨時(shí)如果不能除凈小麥芽上殘留的水分，或者不在液氮的保護(hù)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成什么影響？SS-苯酚問題：離心管不嚴(yán)，傾倒時(shí)苯酚會(huì)流出。由于苯酚的腐蝕性，雖然為了防范危險(xiǎn)已經(jīng)戴了手套，但是仍應(yīng)該在實(shí)驗(yàn)時(shí)重點(diǎn)提出。第二次離心后的上層水相轉(zhuǎn)入燒杯再

3、轉(zhuǎn)移入離心管比較復(fù)雜，能否合并為一步以減少復(fù)雜性RNase 處理步驟不做對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。蛋白質(zhì)離心除去步驟不重復(fù)可能造成的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：成功制得了DNA樣品。放入冷藏柜冷藏待用。實(shí)驗(yàn)計(jì)劃：準(zhǔn)備下一步的實(shí)驗(yàn)方法及改進(jìn)，討論實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的問題。9.12實(shí)驗(yàn)情況實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簽轵?yàn)證實(shí)驗(yàn)的有效性以及探索更優(yōu)的方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行下一步的對(duì)照組DNA提取。采用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測(cè)定，（保證小麥芽表面無水條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)注意了部分研磨操作，提前預(yù)冷了研缽，其他試劑和操作與之前基本一致）實(shí)驗(yàn)結(jié)果：成功完成了對(duì)照組的DNA提取。熟悉了提取的操作步驟。9.13實(shí)驗(yàn)情況實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和瓿蓪?duì)照組實(shí)驗(yàn)組的紫外分光測(cè)定。進(jìn)行凝膠電泳。

4、實(shí)驗(yàn)過程：在常志靜學(xué)姐的指導(dǎo)下我們進(jìn)行了第一次的凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。雖然提前學(xué)習(xí)了學(xué)姐的指導(dǎo)，但是實(shí)驗(yàn)途中還是發(fā)現(xiàn)了許多問題。1 如何進(jìn)樣。2 如何計(jì)算進(jìn)樣量。3 如何設(shè)計(jì)合適的電泳時(shí)間保證最好的分離效果。紫外分光測(cè)定：第一次進(jìn)行紫外測(cè)定發(fā)現(xiàn)DNA樣液的數(shù)據(jù)超過了檢出限，儀器顯示“OVER”，在和老師的溝通下，發(fā)現(xiàn)了儀器上的問題還有比色皿的問題，使得問題得到了解決。紫外分光問題：DNA的稀釋倍數(shù)不容易確定，差異很大，尤其是和小麥的量，DNA提取操作有很大關(guān)系。在和之前做的DNA樣液對(duì)照試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：紫外對(duì)照結(jié)果：兩組數(shù)據(jù)均超過正常值 A260/A280 小于1.8顯示DNA中蛋白質(zhì)含量比較高。瓊脂糖凝膠

5、電泳實(shí)驗(yàn)表明：研磨時(shí)不成粉狀的（缺乏液氮保護(hù)的）一組顏色較淺（基本無顏色）另一組熒光稍可見。凝膠電泳實(shí)驗(yàn)總結(jié)： 雖然成功進(jìn)行了電泳實(shí)驗(yàn)，但是效果不是很理想，DNA基本只在原點(diǎn)處沒有發(fā)生條帶移動(dòng)。載樣的大小還不能確定好。本次試驗(yàn)總體總結(jié)：實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了表面干燥的小麥芽分解相對(duì)較少，下次實(shí)驗(yàn)應(yīng)該加以應(yīng)用。由紫外數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)RNA含量不多，解決了之前是否使用RNAse 以純化DNA的問題。凝膠的制備和電泳操作已經(jīng)基本清楚。但是是否是由于我們電泳載樣量不足造成的熒光不明顯我們并不清楚。下次實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩?duì)已經(jīng)驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)以確定穩(wěn)定性。再次進(jìn)行凝膠電泳的電泳條件的探究。9.13實(shí)驗(yàn)情況實(shí)驗(yàn)

6、目的：1對(duì)已經(jīng)驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)以確定穩(wěn)定性。2再次進(jìn)行凝膠電泳的電泳條件的探究。3為了實(shí)現(xiàn)我們對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可控性分析，我們引入了Marker作為標(biāo)尺鑒定電泳結(jié)果。實(shí)驗(yàn)過程：本次實(shí)驗(yàn)注意到了之前總結(jié)的問題，包括小麥芽的處理，研磨時(shí)的液氮保護(hù)，防止濺出，實(shí)驗(yàn)的連續(xù)性，去掉了轉(zhuǎn)移至燒杯中的步驟，直接在離心管中操作。實(shí)驗(yàn)的安全性苯酚使用前務(wù)必戴手套。凝膠電泳使用了標(biāo)準(zhǔn)的Marker標(biāo)定進(jìn)行測(cè)定。（gold view）實(shí)驗(yàn)結(jié)果：最后處理的DNA 進(jìn)行瓊脂糖電泳后顯示Marker顏色也不是很深，證明是載樣量問題造成的。也證明了我們的凝膠沒有問題，電泳儀等設(shè)備和我們的電泳操作沒有問題。

7、但是我們自己的DNA跑得的結(jié)果仍不好，說明我們DNA提取還是存在問題的。9.14實(shí)驗(yàn)?zāi)康模阂环矫胬^續(xù)探索DNA提取實(shí)驗(yàn)，在途中進(jìn)行錄像工作。錄像過程比較繁瑣，途中多次NG，也有較多技術(shù)問題需要克服。1 清晰體現(xiàn)實(shí)驗(yàn)過程2 如何突出實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)3 實(shí)驗(yàn)視頻詳細(xì)但是繁簡(jiǎn)有度，在講述清楚的條件下盡量節(jié)省視頻的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：錄制了標(biāo)準(zhǔn)化的視頻資料，沒有進(jìn)行完整的電泳實(shí)驗(yàn)。9.15情況沒有進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，主要是完成了PPT制作以及演示視頻制作9.16實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠?jì)算實(shí)驗(yàn)時(shí)需要使用的試劑的量，進(jìn)行配液。完成之前的電泳實(shí)驗(yàn)。準(zhǔn)備制作明天使用的凝膠。9.17 實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)講解過程：順利的進(jìn)行了對(duì)實(shí)驗(yàn)的原理的講解（PPT）進(jìn)行

8、了實(shí)驗(yàn)操作流程的視頻演示并輔以講解。強(qiáng)調(diào)了本實(shí)驗(yàn)有毒物質(zhì)（苯酚，sds，氯仿-異戊醇），以及標(biāo)準(zhǔn)操作。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行還算順利。實(shí)驗(yàn)當(dāng)時(shí)情況總結(jié)：實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的主要問題：1紫外分光光度測(cè)定時(shí)DNA樣品稀釋倍數(shù)的確定。（需要根據(jù)每個(gè)人的實(shí)際情況不同區(qū)分，老師的建議是第一次不稀釋，根據(jù)算出的濃度進(jìn)行計(jì)算后在稀釋相應(yīng)的倍數(shù)）。2凝膠電泳時(shí)電泳載樣量的確定。3凝膠不能被取出，不小心被弄破，使得實(shí)驗(yàn)被迫一度停止。4離心管在倒轉(zhuǎn)時(shí)會(huì)發(fā)生滲漏，（造成苯酚漏出）。二實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1、 高等植物DNA的提取和純度鑒定組號(hào)組員小麥芽質(zhì)量/g吸收度A260/A280吸收度比值原液濃度ug/mL點(diǎn)樣濃度ug/mL1張慧、楊圓圓0.

9、99720.675/0.5021.345168.7556.252齊蕊、任成鳳1.1390.833/0.6901.207208.253陳麗、陳惠渝1.0010.303/0.2621.15675.754劉楊、呂程程1.39150.457/0.2721.68114.257.15賀巧巧、程旭東1.0470.496/0.4611.0761246張楠、周晨婷0.9400.253/0.2451.03263.2565.257夏超、徐子晨1.0000.503/0.4251.1850.38黃雄、李鈺川0.9310.177/0.1171.51344.259王占薇、王振豪1.0570.276/0.2301.269 以

10、上為部分實(shí)驗(yàn)組的數(shù)據(jù)，從數(shù)據(jù)可以看出，本次一班的高等植物DNA提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：從吸收度比值看，因?yàn)锳260/A2801.8時(shí)，表明蛋白質(zhì)含量偏高；1.8 A260/A2802.0時(shí)，表明RNA或DNA碎片較多。以上9組的吸收度比值都小于1.8，說明所有組均是蛋白質(zhì)含量偏高。從原液濃度看，濃度最高的是第2組，高達(dá)208.25ug/mL，而有5組的濃度都小于100ug/mL，這些組原液濃度低，說明部分組所提DNA量較少。從樣液在260nm和280nm處的吸收度值可以看出，蛋白質(zhì)濃度高的實(shí)驗(yàn)組相應(yīng)DNA濃度也高，相差不大，有幾組都接近于相等。說明樣液中DNA和蛋白質(zhì)幾乎等量，蛋白質(zhì)未除干凈。2、瓊脂

11、糖凝膠電泳上面這張圖是各組用所制備的樣液稀釋后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后的圖。從圖中可以看出，最右側(cè)的Marker條帶較清晰（由于照相的問題，所以條帶較淺，實(shí)際情況很清晰），說明我們自己制備的凝膠沒有問題。但由于我們?cè)趯?shí)驗(yàn)前沒有做好充分的準(zhǔn)備工作，因此沒有最終確定點(diǎn)樣濃度和上樣量。從上面的表格可以看出有2組的點(diǎn)樣濃度約為60ug/mL（由于有些組并沒有記錄點(diǎn)樣濃度，因此無法知道其他組的點(diǎn)樣濃度），上樣量為5 uL經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明點(diǎn)樣濃度較低，圖片中間的點(diǎn)樣濃度即為60ug/mL，無法顯示出條帶。而最左側(cè)的2個(gè)條帶點(diǎn)樣濃度有所提高，點(diǎn)樣量為10uL，可以顯出條帶，說明提取DNA成功，并且由于所提DNA較

12、大，所以在凝膠電泳中前進(jìn)的距離并不遠(yuǎn)。實(shí)驗(yàn)分析與討論：為了改善實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提高DNA的提取含量和盡可能除盡樣液中的蛋白質(zhì)，我們根據(jù)同學(xué)們的實(shí)驗(yàn)報(bào)告的分析情況和所查文獻(xiàn)資料，進(jìn)行一下實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化和創(chuàng)新，將從幾個(gè)方面一一進(jìn)行分析：所用材料及材料的預(yù)處理【實(shí)驗(yàn)方法】根據(jù)資料，在實(shí)際實(shí)驗(yàn)過程中，我們使用的材料是摘取長(zhǎng)于1厘米的小麥芽約1克，吸干水分后，進(jìn)行液氮研磨?！痉治雠c改進(jìn)方法】1、 確定理想的DNA提取材料在陳麗的實(shí)驗(yàn)報(bào)告中，她提到提取方法對(duì)不同的植物有不同的效應(yīng)，這是因?yàn)樵诜蛛x和純化核酸時(shí)解聚核蛋白和去除蛋白質(zhì)是很重要的一步，而不同的核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)的數(shù)量、成分、牢固程度有所不同，所以用不同的

13、方法提取不同植物的DNA效果不一樣。因此，要確定用什么植物來提取DNA效果最好。新鮮和幼嫩的植物材料因其含有較完整的DNA， 因而常成為制備高質(zhì)量的基因組DNA的充分條件之一。對(duì)于大多數(shù)植物而言，健康的嫩葉是試驗(yàn)最佳的樣本來源。因?yàn)榻】档哪廴~不僅含有較少的代謝物，同時(shí)細(xì)胞數(shù)量也更多，而如果選擇成熟或老化的葉片組織，多糖、多酚等代謝物相應(yīng)增加，會(huì)給基因組DNA的提取帶來困難，也會(huì)影響下面實(shí)驗(yàn)。而小麥幼芽由于細(xì)胞多數(shù)處于分裂期，所以含DNA量較高，而且小麥幼芽含蛋白質(zhì)及其他代謝產(chǎn)物較少，所以我們可以確定小麥幼芽是作為提取DNA的材料較為理想。12、 材料的預(yù)處理對(duì)于這些材料通常用70%的乙醇清洗表

14、面，并浸泡1min以去除外源的DNA污染，并用滅菌去離子水沖洗干凈。3、 材料用量在提取液體積不變時(shí),適當(dāng)提高實(shí)驗(yàn)樣品量是可提高目標(biāo)產(chǎn)物的得率。這個(gè)從我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也可以看出，一般小麥幼芽用量較多的，那么原液濃度就會(huì)相應(yīng)較多。當(dāng)然，這也會(huì)帶來一個(gè)問題，就是蛋白質(zhì)的含量可能也會(huì)偏高。研磨【實(shí)驗(yàn)方法】我們先用液氮將研缽預(yù)冷，然后放入干燥的小麥芽進(jìn)行液氮研磨，保持研缽中有液氮存在?！痉治雠c改進(jìn)方法】1、 小麥幼芽的預(yù)冷凍在實(shí)驗(yàn)前，可以將小麥幼芽進(jìn)行冷凍，有利于實(shí)驗(yàn)。例如，用液氮研磨前，先將小麥幼芽先冷凍干燥數(shù)小時(shí)，再進(jìn)行研磨。2或者，可以將材料在4度冰箱中放置12天，有利于葉片中多糖類物質(zhì)的降解，實(shí)

15、驗(yàn)結(jié)果較好，DNA的OD260/OD280的比值在1.8 2.0 之間，說明DNA純度較高。3 2、 研磨方法我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，用研缽研磨非常容易讓小麥幼芽飛濺，使得材料損失?？梢灾苯佑缅F型玻璃棒在15 mL 離心管中研磨，磨成糊狀，這樣避免了材料的損失。在小麥研磨過程中，關(guān)鍵是要快速，不能時(shí)間過長(zhǎng)，磨細(xì)后要立即加抽提液，防止DNA的降解。這種方法不用液氮，操作簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)、質(zhì)量較好。4 水浴操作【實(shí)驗(yàn)方法】加入抽提液和SDS，用玻璃棒攪拌后放入65度恒溫水浴，水浴30分鐘?！痉治黾案倪M(jìn)方法】水浴的目的是為了在溫?zé)釛l件下更好地使DNA與蛋白質(zhì)分離，達(dá)到提純的目的。為了達(dá)到好的水浴效果，

16、可以采取一下措施：1、 采取兩次水浴的方法5 第一次水浴（圖1） 第二次水?。▓D2） 在該方法中，采取兩次重復(fù)的方式，圖1為不同水浴時(shí)間第一次提取的DNA瓊脂糖檢測(cè)結(jié)果。圖中，A、B:水浴90min左右提取的DNA; C、D:水浴30min左右提取的DNA; E、F:水浴60min左右提取的DNA; G、H:水浴120min左右提取的DNA; I:為水浴150min左右提取的DNA。從圖1中可以看出90min和120min水浴時(shí)間所提的DNA泳帶最亮,分布集中,無拖尾現(xiàn)象; 30min、60min所提的DNA帶偏暗; 150min時(shí)DNA帶有拖尾現(xiàn)象。圖2為不同水浴時(shí)間提取DNA后殘?jiān)俅嗡?/p>

17、90min,提取的DNA瓊脂糖檢測(cè)結(jié)果。A和B:水浴30min后再次提取獲得的DNA; C和D:水浴60min再次提取獲得的DNA; E和F:水浴90min左右再次提取的DNA; G和H: 120min 水浴后再次提取的DNA; I: 150min水浴后再次提取的DNA。從圖2中可以觀察出第一次水浴時(shí)間少于90min,第二次提取的DNA質(zhì)量較好,第一次水浴時(shí)間超過120min, 第二次提取只能獲得較少或者不能獲得DNA。結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析，第一次水浴在90min以下再次提取的DNA 質(zhì)量較好,且沒有明顯的降解,水浴30min和60min后再次提取的DNA數(shù)量和質(zhì)量明顯比水浴90min以上的好。綜合考

18、慮,我們認(rèn)為,第一次水浴時(shí)間以90min到120min為宜。另外，值得注意的是，如果材料較少，且非常珍貴，可以將第一次提取DNA后的殘?jiān)尤隓NA提取緩沖液，第二次提取DNA。2、 水浴時(shí)的操作在水浴時(shí)不應(yīng)用玻璃棒攪拌，而是直接混搖即可，以免機(jī)械力過大而使DNA斷裂。可以采用如下實(shí)驗(yàn)條件：65度，水浴1h，中間每隔5-10min搖一次。4離心【實(shí)驗(yàn)方法】在實(shí)驗(yàn)中涉及到4次離心，前兩次條件為4000r/min，8min，25度；后兩次為4000r/min，10min，25度。【分析及改進(jìn)方法】1、 離心轉(zhuǎn)速的確定隨著加入酚-氯仿和氯仿后提高轉(zhuǎn)速,對(duì)DNA質(zhì)量，和數(shù)量都有一定的影響。為了確定離心轉(zhuǎn)

19、速，從以下實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析5上圖為加入氯仿后不同離心轉(zhuǎn)速提取的DNA瓊脂糖檢測(cè)結(jié)果。同樣是重復(fù)兩次，1、2: 加入酚-氯仿后離心的轉(zhuǎn)速為10000 rpm; 3、4: 加入酚-氯仿后離心的轉(zhuǎn)速為12 000rpm; 5、6:加入酚-氯仿后離心的轉(zhuǎn)速為14000 rpm; 7、8:加入酚- 氯仿后離心的轉(zhuǎn)速為16000 rpm從上圖可以看出酚-氯仿后離心轉(zhuǎn)速加大后,DNA帶的變化不太明顯,但是10 000 rpm的離心轉(zhuǎn)速提取的DNA帶亮度略強(qiáng)。所提取的DNA質(zhì)量和數(shù)量逐漸減少,DNA降解明顯。說明離心轉(zhuǎn)速以10000rpm以下為宜，隨著DNA提取進(jìn)程的深入,離心轉(zhuǎn)速要逐漸下降,這是獲得高純度DNA

20、條件。2、 離心時(shí)間的確定隨著提取的深入，離心時(shí)間應(yīng)該逐漸減短，避免機(jī)械力對(duì)DNA的破壞，而我們實(shí)驗(yàn)中卻是時(shí)間增長(zhǎng)，這樣不是很合理。3、 離心管滲漏問題在加入Tris飽和酚之后，許多組出現(xiàn)離心管倒轉(zhuǎn)過程中易滲漏的問題，而Tris飽和酚有極強(qiáng)的腐蝕性，十分危險(xiǎn)。張慧、楊圓圓組跟換一個(gè)離心管后即不漏。但是陳斌輝和陳志丹組跟換了3個(gè)離心管還是出現(xiàn)這個(gè)問題。建議可以在離心管關(guān)口外圈纏上生膠帶，再蓋蓋子，并且在倒轉(zhuǎn)過程中一定要帶上手套。試劑用量與用法1、 增加試劑用量及次數(shù)：除蛋白質(zhì)的步驟中,可適當(dāng)增加氯仿/ 異戊醇的量和使用次數(shù),直到DNA溶液和抽提有機(jī)溶劑界面上無白色沉淀（蛋白質(zhì)）為止，這樣有利于更

21、加完全地去除蛋白質(zhì),從而提高產(chǎn)物的純度。文獻(xiàn)中的實(shí)驗(yàn)說明,通過連續(xù)三次氯仿/ 異戊醇來去除蛋白質(zhì)，效果很好。尤其是樣品較多時(shí)，增加氯仿/ 異戊醇的量更利于得到高質(zhì)量的DNA.。6 2、減少試劑用量及次數(shù)95%乙醇是用于沉淀核酸，它的用量也會(huì)影響DNA的提取。賀巧巧在實(shí)驗(yàn)報(bào)告中提到，如果加入2倍體積95%乙醇，就有一種黃色干擾物7和DNA同時(shí)沉淀，而且在共沉淀時(shí)與DNA形成復(fù)合物，以后的純化步驟很難將其與DNA分離。另外，這個(gè)復(fù)合物對(duì)以后的純化步驟除去與DNA結(jié)合的組蛋白有一些影響，不利于DNA負(fù)超螺旋的解開，從而導(dǎo)致DNA樣品中蛋白質(zhì)不易除盡，導(dǎo)致吸光度結(jié)果是蛋白質(zhì)含量過高。但其實(shí)用一倍體積時(shí)

22、，絕大多數(shù)DNA已被沉淀，對(duì)DNA提取率無大影響。綜合說明，只要用一倍體積95%乙醇沉淀核酸就可以。3、Tris飽和苯酚的加入時(shí)間8在水浴加熱時(shí)，直接加入Tris飽和苯酚，這樣可加強(qiáng)苯酚對(duì)蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的變性能力。4、 用乙醇沉淀時(shí)，要沿離心管壁倒入，可以做到充分沉淀。5、 分別在水浴前和水浴后加KCl試劑對(duì)DNA提取的影響4上表為KCI對(duì)提取DNA質(zhì)量的影響。從上表可以看出：水浴前加KCl 的OD260值均大于水浴后加KC1的值，說明水浴前加KC1提取的DNA含量高于水浴后，水浴后加KC1的OD280和OD320值小于水浴前加KC1的，且OD260OD280值均大于水浴前加KC1的，說明水浴后

23、加KC1比水浴前加KC1的RNA含量和雜質(zhì)含量低，DNA濃度和純度相對(duì)較高。不加KC1的(材料1、2，對(duì)照)OD260值雖然較高，但OD280和OD 320值均高于水浴前和水浴后加KC1，且OD260OD280值均小于水浴前和水浴后加KC1，說明不加KC1比水浴前和水浴后加KC1提取的DNA 中含RNA和雜質(zhì)多。綜上說明，水浴后加KC1比水浴前加KCl及不加KC1的RNA 含量和雜質(zhì)含量低，OD260/OD280比值大，DNA濃度和純度有所提高。機(jī)械力及高溫在整個(gè)提取過程中，機(jī)械力或高溫會(huì)使DNA分子發(fā)生斷裂。應(yīng)盡量避免過多的溶液轉(zhuǎn)移及劇烈震蕩等，避免過高溫度，操作時(shí)輕緩。程旭東猜測(cè)，大部分A

24、260/A280比值較小的原因是在玻璃棒攪拌時(shí)，DNA都纏繞在玻璃棒上了，未用玻璃棒攪拌的組比值都在1.6左右。這與機(jī)械力有關(guān)。1、保持DNA長(zhǎng)度的完整性的對(duì)策：（1）離心管倒轉(zhuǎn)要輕柔，避免DNA斷裂。（2）吸取DNA的槍頭尖端應(yīng)用刀削去，吸取用大口徑的吸管。吸取時(shí)動(dòng)作要輕柔。（3）如果要保存DNA提取液，應(yīng)將DNA稀釋液在4度保存，原液在-20度或-70度的冰箱保存，避免DNA的反復(fù)凍容。9 2、溫度要求提取條件應(yīng)盡量保持低溫，因?yàn)楫?dāng)氣溫超過15度時(shí)，易引起DNA降解。在夏季高溫時(shí)，可使用冰水浴。10 但是，值得注意的是，高溫下苯酚對(duì)蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的變性能力大大加強(qiáng)。因此，應(yīng)注意找到合適的提取

25、溫度。3、干燥程度對(duì)DNA提取的影響11不同的干燥程度和方法對(duì)DNA的提取率也有影響。從上圖中可看出,不論是玉米還是高羊茅草,用新鮮葉片提取的DNA,無任何降解,電泳呈現(xiàn)清晰而明亮的一條帶(圖1 - 1, 8) ;微波爐處理后DNA完全降解(圖1 - 2, 9) ;室溫下自然干燥的玉米DNA也降解,但草的DNA降解不嚴(yán)重(圖1 - 3, 10) ;不同的烘干溫度對(duì)DNA的影響作用是溫度越高降解越嚴(yán)重, 45下烘干的DNA降解較少;硅膠干燥的葉片提取的DNA基本無降解,電泳條帶清晰。綜上可以看出，在45下烘干的新鮮葉片的DNA提取率最高。吸光度測(cè)定吸光度測(cè)定方式和條件不同也會(huì)影響到DNA的提取率

26、。1、測(cè)量時(shí)的pHpH為7.4時(shí)，OD值最大，DNA提取率較高，偏離該值越遠(yuǎn)提取率越低（具體可見下表）12，因此在實(shí)驗(yàn)改進(jìn)的過程中，可以通過用pH試紙跟蹤測(cè)試不同時(shí)期溶劑的pH值，而本次實(shí)驗(yàn)中所選用的TE緩沖液pH為8.0，可以適當(dāng)降低pH。 2、 測(cè)定時(shí)間測(cè)定時(shí)間的不同也會(huì)影響到DNA的提取率。王占薇報(bào)告中提到，測(cè)試DNA吸光度時(shí)，應(yīng)該在DNA配制后內(nèi)測(cè)試，靈敏度較高。（目前仍待考證，還未找到相關(guān)文獻(xiàn)） DNA提取方法的比較與總結(jié)13迄今為止國內(nèi)外報(bào)道的植物DNA提取方法多達(dá)好幾十種。1、 采用CTAB（十六烷基三乙基溴化銨）代替SDS，CTAB法能很好地去除糖類物質(zhì)，對(duì)于含糖較高的材料可優(yōu)

27、先采用。 但由于步驟多、試劑組成復(fù)雜、易污染等缺點(diǎn)，在使用上受到了一定的限制。DNA純度高，色澤純白。 2、采用基因釋放劑提取DNA，省略了復(fù)雜的提取步驟，對(duì)某些難得的樣品組織標(biāo)本等微量即可使用。 3、用試劑盒，包含了提取植物DNA所需試劑，能直接用于提取高質(zhì)量DNA，無需酚、氯仿和SDS等，操作簡(jiǎn)單、快捷，所得DNA濃度高。 4、NaOH法，用時(shí)短，簡(jiǎn)單，但提純的DNA純度不高。6、 其他方法：如高鹽pH法，簡(jiǎn)易操作方法，堿裂解法，脲法，S法，苯酚法。凝膠電泳之前已經(jīng)描述過我們實(shí)驗(yàn)的DNA凝膠電泳結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)DNA條帶出現(xiàn)了DNA條帶模糊、條帶弱或無帶的現(xiàn)象。從下圖中，我們就可以分析出出現(xiàn)

28、這些情況的原因以及相應(yīng)的解決辦法。另外，其他一些因素也會(huì)影響DNA凝膠電泳的結(jié)果。1、重制凝膠我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過程中只做了2塊膠，有一塊膠在拔膠的過程中損壞，因此必須重熔再制備。但隨著融化次數(shù)的增加，水分丟失也越多，凝膠濃度會(huì)越來越高，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定。應(yīng)該在重制膠時(shí)進(jìn)行補(bǔ)水：是在容器上標(biāo)記煮膠前的刻度，煮膠后補(bǔ)充水分到原刻度；是在煮膠前稱重，煮膠后補(bǔ)充水至原重量。粗略一點(diǎn)的辦法是通過多次較恒定的煮膠條件得出一個(gè)經(jīng)驗(yàn)補(bǔ)水值，以保證凝膠濃度基本維持在原濃度。2、 拔梳板的方法和時(shí)間點(diǎn)樣孔的破壞與拔梳板的時(shí)間和方法有關(guān)，一般凝膠需冷卻30min以上方可拔出梳板，應(yīng)急的情況下可以將成型的凝膠塊放入2度冰箱冷卻15min左右。拔梳板的方法是將制膠槽放置在電泳槽中的電泳緩沖液中，然后垂直向上慢慢