凌丹康復(fù)方配合DC-CIK治療白血病臨床研究概要

1、凌丹康復(fù)方配合 DC-CIK治療白血病臨床研究劉清池吳維海 李剛榮 胡曉東馮新旺 梁春耕武大勇李慧慧宋淑花 馬傳寶 李建英王榮孝 張慧敏牛景月摘要目的 觀察中藥凌丹康復(fù)方配合樹突狀細(xì)胞聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(DC-CIK)治療白血病的臨床效果和安全性。方法 病例選擇血液學(xué)緩解但未達(dá)到分子生物學(xué)緩解的白血 病患者或殘留白血病檢測(cè)陽(yáng)性患者，其中急性白血病19例，慢性粒細(xì)胞白血病1例。用血細(xì)胞分離機(jī)采集患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞,分別培養(yǎng)D(和CIK，然后再混合培養(yǎng)獲得DC-CIK,將 DC-CIK經(jīng)靜脈回輸給患者，每1520天回輸一次，共輸注46次。同時(shí)服用扶正祛邪中藥凌丹 康復(fù)方。觀察治療效果與

2、安全性。結(jié)果 凌丹康復(fù)方配合DC-CIK治療20例緩解期白血病患者， 達(dá)分子生物學(xué)緩解，標(biāo)志基因轉(zhuǎn)陰4例，其中1例為AML1/ETO , 1例CBF/MYH11 , 1例IgH基 因重排，1例bcr/abl;微小殘留白血病轉(zhuǎn)為陰性者3例。治療后3年CR為75 %，中位CR期25月 (1037月)。DC-CIK輸注后除5例出現(xiàn)一過性發(fā)熱，畏寒,無其它嚴(yán)重副作用。結(jié)論 中藥 凌丹康復(fù)方配合DC-CIK細(xì)胞治療血液學(xué)緩解后白血病，具有明顯清除微小殘留白血病細(xì)胞的 作用,是血液學(xué)緩解后白血病患者合適的選擇，靜脈輸注安全，有較好的臨床應(yīng)用前景。【關(guān)鍵詞】白血病，免疫治療，樹突狀細(xì)胞，殺傷細(xì)胞/細(xì)胞因子誘

3、導(dǎo)，中藥Clinical study of Chinese herbs -ingdan kangfu fang and DC-CIK(dendritic cells and cytok in e-i nduced killer)combi ned treatme nt for leukemiaLIU Qin g-chi,WU Wei-hai,LI Ga ng-ro ng,HU Xiao-do ng,FENG Xi n-wan g,LIANG Chu n-ge ng WU Da-yo ng,LI Hui-hui,SONG Shu-hua,MA Chua n-bao,LI Jia n-yi ng,

4、WANG Ro ng-xiao, ZHANG Hui-min,NIU Jing-yue1,Department of Hematology, Ping an Hospital, 2, Molecular Biology Laboratory of Ping an Hospital, Shijiazhua ng 050021 , ChinaAbstract: Objective: To evaluate the effective ness and safety of Chin ese herbsi ngda n kangfu fang and DC-CIK(de ndritic cells a

5、nd cytok in e-i nduced killer)combi ned treatme nt of leukemia patie nts Methods: Selected 20 patie nts achieved hematological complete remissio n(HCR) but not achieved molecular biological remissio n(MBR) or mi ni mal residual Leukemia (MRL) positive.Am ong 20 patie nts 19 cases with acute leukemia

6、 and one cases with chronic myelocytic leukemia. Used COBE Separator to separate the peripheral blood mono cyte of the patie nts to Culture DC and CIK respective,a nd the n mixed to Culture, and the mixed cultures were in trave nous injected to the patients self. Once every 1520days to intravenous i

7、nject,and the total were 46. All patie nts were adm ini stered orally with Chin ese herbsl in gda n kangfu fang every day. To observed the effective ness and safety R esults:I n 20 patie nts received the treatme nt of Chin ese herbs -in gda n kangfu fang and DC-CIK ,4 case achieved MBR,that marked g

8、ene cha nge n egative including 2 AML1/ETO,1 CBF B /MYH11and 1 bcr/abl,and 3 case (all were acute non-lymphocytic leukemia-M 2) MRL change negative. The 3 yearsCR probability after Chinese herbs-ngdan kangfu fang and autologous DCCIK s therapy was 80 % in 20 cases in hematological remissio n whe n t

9、he Chin ese herbs-ngda n kangfu fang and autologous DC-CIK were in fused , with the medium CR period 25 mon ths (1C37 mon ths) . Except tran sie nt fever , chill etc , no remarkable作者單位： 1. 河北省石家莊平安醫(yī)院（ 050021）通訊作者：劉清池， TelEmai:side effects happened during or after AutoC- IKs infusion.

10、C. onclusion:The combined treatment of Chin ese herbsT in gda n kangfu fang and autologous DC-CIK can clear out MRL in patie nts with HCR,and is proper for curing Leukemia. Intravenous infusion of autologous DC-CIK is demonstrated to be safe and has potential clinical prospect.Key words:Leukemia;Den

11、dritic cell; Cytokine induced killer; Chinese herbs； Immunotherapy近年來隨著細(xì)胞免疫學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展 , 細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞 （cytokine induced killer cells , 簡(jiǎn)稱 CIK） 是一種高效、新型免疫活性細(xì)胞 ,CIK 細(xì)胞用于治療白血病已經(jīng)成為白 血病過繼免疫治療的重要手段之一 1-4 。樹突狀細(xì)胞 （dendritic cells, DC） 是目前發(fā)現(xiàn)的功能 最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞 ,它通過處理、呈遞抗原而介導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答。由于許多白血病患者缺乏 功能性 DC 而不能誘發(fā)抗原特異性 T 細(xì)胞應(yīng)

12、答 ,故在體外誘導(dǎo)功能性 DC 用于主動(dòng)免疫治療 具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值5-6。 DC-CIK是分別培養(yǎng)DC與CIK，然后再共同培養(yǎng)，使 DC誘 導(dǎo) CIK 特異性應(yīng)答，較單純 CIK 更完善 2,7?，F(xiàn)代中藥藥理研究發(fā)現(xiàn)，許多中藥可調(diào)節(jié) DC 和 T 淋巴細(xì)胞功能 8-9?，F(xiàn)今急性白血病的緩解率已達(dá) 5090%，但多數(shù)患者最終因?yàn)闅埩?白血?。?MRL ）的存在會(huì)復(fù)發(fā)而死亡 10。清除 MRL 是治愈白血病的關(guān)鍵。本研究觀察中藥 凌丹康復(fù)方配合樹突狀細(xì)胞調(diào)節(jié)聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（簡(jiǎn)稱 DC-CIK） 治療血液學(xué)緩解后白血病，清除 MRL 的臨床效果和安全性。資料與方法1臨床資料 20例

13、為 2005年 3 月至 2007年 3 月期間我院收治的白血病患者 （本組病例 不含PML/RAR a陽(yáng)性急性髓系白血病），均為血液學(xué)緩解（CR）期，診斷標(biāo)準(zhǔn)按照 WH急性白 血病診斷分型標(biāo)準(zhǔn) 11。但未達(dá)分子生物學(xué)緩解，或流式細(xì)胞儀檢測(cè)微小殘留白血病陽(yáng)性。其 中男16例，女4例，年齡1563歲，平均29.6土 10.2歲，病程848個(gè)月，平均26.5 9.1月。 包括急性 B 淋巴細(xì)胞白血病 （ALL） 5 例,其中復(fù)發(fā) ALL1 例,化療緩解 14年后仍持續(xù) IgH 基因 重排陽(yáng)性患者 4例；急性非淋巴細(xì)胞白血病 14例，其中急性髓性白血病 （AML） M2 型 10 例, AML/ET

14、O陽(yáng)性急性髓性白血病2例，BCFB /MYH11基因陽(yáng)性急性髓系白血病 1例,AML-M4 型 1 例；血液學(xué)緩解期 bcr/abl 陽(yáng)性慢性粒細(xì)胞白血病 1 例。 DC-CIK 治療前患者均接受了反 復(fù)化療 ,其中 4 例接受自體造血干細(xì)胞移植。2DC-CIK 培養(yǎng)、擴(kuò)增2.1DC、CIK 細(xì)胞的體外分離 在平安醫(yī)院細(xì)胞培養(yǎng)室完成。用 COBE SPECTRA 機(jī) 按 Auto-PBSC 程序行血細(xì)胞分離 ,采集外周血單個(gè)核細(xì)胞 （MNC） 。并用淋巴細(xì)胞分離液 （ Ficoll ） 再次分離出MNC，用AIM-V無血清培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度為（46）X106個(gè)/ ml，置于37C、5 %CO2培

15、養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。收集非貼壁細(xì)胞用于誘導(dǎo)培養(yǎng) CIK細(xì)胞，貼壁細(xì)胞誘導(dǎo)分化出成 熟 DC。2.2CIK 細(xì)胞培養(yǎng)、 擴(kuò)增 用含 10%人 AB 血清的 IMDM ，將收集的非貼壁細(xì)胞調(diào)細(xì)胞 濃度為（12）X 106個(gè)/ml ,并加入1000U/ml的IFN- a懸浮培養(yǎng),24h后加入1卩g/ml的CD3單 抗和1000U/ml的rh IL-2 ,每隔3天半量換液1次補(bǔ)充rh IL-2 ,調(diào)整細(xì)胞濃度始終為（12）X 106 個(gè)/ ml 。2.3DC 的體外培養(yǎng)、擴(kuò)增 MNC 培養(yǎng) 2 h 后的貼壁細(xì)胞中 ,加入含 1000 U/ml 的 GM-CSF和1000U/ ml的IL-4的AIM2V 培

16、養(yǎng)液,37C、5 %C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每3天換液1 次并補(bǔ)充細(xì)胞因子，第6天加入上述細(xì)胞因子的同時(shí)還加入 IL-1 B、TNF-a、PGE-2等細(xì)胞 因子誘導(dǎo) DC 成熟,共培養(yǎng) 89 天。2.4DC與CIK細(xì)胞共培養(yǎng) 收獲的DC計(jì)數(shù)后和CIK,按1 : 5混合培養(yǎng)，共培養(yǎng)3天。2.5DC/CIK細(xì)胞群表型檢測(cè) 在DC培養(yǎng)的第9天應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行免疫表型分析, 在CIK細(xì)胞培養(yǎng)的第9、14、21天分別取少量細(xì)胞應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞表型 QC-CIK培養(yǎng) 物共培養(yǎng) 3 天后測(cè)細(xì)胞表型。由平安醫(yī)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成，采用熒光標(biāo)記的單抗（International Immunotech公司）進(jìn)行

17、染色，用COULTER EPICS XL型四色流式細(xì)胞儀檢測(cè)， 用 Cell Quest 軟件分析數(shù)據(jù)。3DC-CIK 細(xì)胞回輸 做細(xì)菌、霉菌培養(yǎng)均陰性 ,活性細(xì)胞占 95 %,淋巴細(xì)胞比例 70 % , 則準(zhǔn)備回輸DC-CIK細(xì)胞。將37 C恒溫箱中的DC-CIK回輸液（約250 mL）運(yùn)至病房，立即 快速靜脈回輸。回輸前,地塞米松 5 mg 靜脈注射（防止過敏） ,生理鹽水 250 mL 回輸時(shí)前后沖。 當(dāng)天回輸后46 h再輸入生理鹽水100 mL+白細(xì)胞介素2 20萬U ,次日起輸入生理鹽水100 mL+白細(xì)胞介素2 20萬U , 1次/ d共4 d。每15天20天回輸一次，輸注46次后

18、判斷療效。4 藥物治療 采用凌丹康復(fù)方（組成冬凌草 30、漆谷草20、白英20、 貓抓草 20、旱蓮 草30、墓頭回 15、丹皮 20、太子參20、黃芪 20、生地黃 20、白術(shù)20、當(dāng)歸 20等）。每日 1 劑，水煎服， 90 天以上。5 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法5.1 臨床安全性監(jiān)測(cè)指標(biāo) 在每次 CD-CIK 輸注前后檢查肝腎功能、心電圖、尿液常規(guī)、 大便常規(guī)。5.2療效監(jiān)測(cè)CD-CIK輸注次數(shù)和輸注量；疾病狀態(tài)；白血病特異基因；殘留白血病免疫表型組合。 CD-CIK 回輸后復(fù)查白血病特異基因、殘留白血病免疫表型組合， 如連續(xù)2 次均為陰性,每36 個(gè)月再檢測(cè) 1 次; 持續(xù)陰性1 年以上,每6

19、12 個(gè)月檢測(cè)1 次， 再檢測(cè) 2 次。5.3 不良反應(yīng)監(jiān)測(cè) 在回輸 DC-CIK 過程中及回輸后每天觀察出現(xiàn)的毒性反應(yīng)。觀察項(xiàng) 目及分級(jí)參照世界衛(wèi)生組織規(guī)定的急性及亞急性毒性反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn) 12。6療效判斷 血液學(xué)緩解標(biāo)準(zhǔn)采用 1987 年全國(guó)白血病化療討論會(huì)制定的標(biāo)準(zhǔn) 13,分子 生物學(xué)緩解標(biāo)準(zhǔn)為白血病特異基因陰轉(zhuǎn)，殘留白血病免疫表型組合陰轉(zhuǎn)標(biāo)準(zhǔn)為，經(jīng)四色流式 細(xì)胞儀多抗體組合檢測(cè)白血病細(xì)胞w 10-4為陰轉(zhuǎn)。6.1白血病特異基因檢測(cè) 包括AML1/ETO, CBF 3 /MYH11 , bcr/abl基因，IgH、TCRs 基因重排，由平安醫(yī)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成，采用多聚酶鏈反應(yīng)（ PCR）

20、方法14,15。6.2殘留白血病免疫表型組合檢測(cè) 殘留白血病免疫表型組合的設(shè)計(jì)參照患者發(fā)病時(shí) 或復(fù)發(fā)時(shí)的免疫表型設(shè)計(jì)，檢測(cè)由平安醫(yī)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。結(jié)果1DC-CIK 輸注次數(shù)及輸注量 20 例共接受 63 次 DC-CIK 治療,其中 1 例接受 7次治 療,1 例接受 5 次治療,15 例接受 3 次治療,3例接受 2 次治療。每次回輸?shù)?DC-CIK 總數(shù)為 1 X 109 26.5X 109,平均（8.7土 3.4）X 10902DC-CIK回輸后患者疾病狀況本組化療或/和自體造血干細(xì)胞移植治療后血液學(xué)緩解者20例,經(jīng)用靈丹康復(fù)方配合DC-CIK細(xì)胞輸注，15例CR達(dá)3年以上，C

21、CR為75 %。20例中 位CR期28月（1057月 ），3例在兩年內(nèi)復(fù)發(fā)。靈丹康復(fù)方配合DC-CIK治療后6例患者未再 接受化療，其余14例患者延長(zhǎng)化療間歇期。說明靈丹康復(fù)方配合 DC-CIK治療有延長(zhǎng)緩解期防止復(fù)發(fā)的作用。3白血病特異基因 白血病特異基因陰轉(zhuǎn)，達(dá)分子生物學(xué)緩解 4 例，其中 1 例輸注 DC-CIK1 次后陰轉(zhuǎn)， 3例3次以上輸注后轉(zhuǎn)陰，達(dá)分子生物學(xué)緩解所需時(shí)間 1560天，平均 41.2 18.9天。4例特異基因轉(zhuǎn)陰患者包括1例AML1/ETO陽(yáng)性急性髓性白血病、1例BCF3 /MYH11基因陽(yáng)性急性髓系白血病、1例IgH基因重排B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血?。ㄔg斷 化療4年

22、IgH基因重排仍為陽(yáng)性）、1例bcr/abl基因陽(yáng)性慢性粒細(xì)胞白血病患者。 達(dá)分子生物 學(xué)緩解的這例BCFB /MYH11基因陽(yáng)性急性髓系白血病患者，男性， 24歲，化療取得緩解后只鞏固1個(gè)療程，即采用靈丹康復(fù)方配合DC-CIK治療，DC-CIK細(xì)胞輸注3次后BCF 3 /MYH11陰轉(zhuǎn)，至今保持陰性達(dá) 28個(gè)月。 1 例緩解后鞏固治療的 B 細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病患者，堅(jiān) 持間斷化療 4年， IgH 基因持續(xù)陽(yáng)性， 停用化療，采用靈丹康復(fù)方配合 DC-CIK 治療 3次， IgH 基因陰轉(zhuǎn)，保持陰性至今達(dá) 28個(gè)月?？梢姴捎渺`丹康復(fù)方配合 DC-CIK 治療白血病 ,對(duì)促進(jìn) 白血病特異基因陰

23、轉(zhuǎn)，取得分子生物學(xué)緩解有確切的作用。4殘留白血病細(xì)胞免疫表型組合 轉(zhuǎn)為陰性水平者 3 例，均為輸注 DC-CIK3 次以上者， 陰轉(zhuǎn)所用時(shí)間分別為 45 天、 45 天， 60 天。 3 例殘留白血病免疫表型組合轉(zhuǎn)為陰性者均為 ANLL-M 2患者。殘留白血病細(xì)胞免疫表型組合檢測(cè)表明采用靈丹康復(fù)方配合 DC-CIK 治療白 血病有清除微小殘留白血病細(xì)胞的作用。5不良反應(yīng)發(fā)生情況回輸后4例（4/20）發(fā)熱，T37. 5C40. 2C。多發(fā)生于細(xì)胞輸注后0. 52h，持續(xù)13h消退?？砂橛腥矸α?、肌肉酸痛，用地塞米松能很快緩解。未見 導(dǎo)致外周血紅細(xì)胞、白細(xì)胞及血小板的明顯降低。無肝功、腎功、心肌

24、酶、血糖及電解質(zhì)的 異常變化。討論目前, 化療可使50%90%的急性白血病獲得 CR10 。 CR 后如繼續(xù)化療或自體造血干細(xì)胞移 植治療,除M3型及兒童標(biāo)危組B細(xì)胞ALL外，其它患者的長(zhǎng)期CC率50%，多數(shù)單位30%。自 體造血干細(xì)胞移植治療 ALL 1 年內(nèi)復(fù)發(fā)率為 50%以上, 甚至可高達(dá) 70%。異基因造血干細(xì)胞移植 治療的復(fù)發(fā)率雖然低 , 但大多數(shù)患者不能找到 HLA 配型相合的供者 , 且并發(fā)癥較多 , 費(fèi)用高。因 此急性白血病CR后微小殘留白血病的清除仍是治療的難點(diǎn)。 本組化療或/和自體造血干細(xì)胞移 植治療后血液學(xué)緩解者20例,經(jīng)用靈丹康復(fù)方配合DC-ClKffl胞輸注，3年CC

25、R概率高達(dá)75% 4 例白血病特異基因陰轉(zhuǎn)， 3例殘留白血病細(xì)胞免疫表型組合達(dá)陰性水平，說明靈丹康復(fù)方配合DC-CIK治療有延長(zhǎng)緩解期，促進(jìn)白血病特異基因陰轉(zhuǎn)，清除微小殘留白血病細(xì)胞，防止復(fù)發(fā)的作用。新近研究證實(shí)，DC與CIK共培養(yǎng)過程中,CIK細(xì)胞中CD3+CD8+、CD3+CD56+的比例 較單純 CIK 細(xì)胞有不同程度的增高 ,說明大量成熟 DC 進(jìn)一步促進(jìn)了 CIK 細(xì)胞的成熟 16,17。 DC-CIK 細(xì)胞抗白血病機(jī)理 （1）CIK 細(xì)胞對(duì)白血病細(xì)胞的直接殺傷：在體內(nèi)受某些淋巴因子作 用后， CIK 細(xì)胞大量釋放具有細(xì)胞毒性的胞漿顆粒到胞外，這些顆粒直接破壞瘤細(xì)胞。（2）進(jìn)入體內(nèi)活

26、化的DC-CIK細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子如干擾素r、腫瘤壞死因子（TNF-a ）和白介素-2（IL-2）等，不僅對(duì)白血病細(xì)胞有直接抑制作用，而且還可通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)間接殺傷白血病 細(xì)胞。（3）CIK細(xì)胞通過表達(dá)Fasl可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡，CIK細(xì)胞由于有抗凋亡基因表達(dá)， 因此在體內(nèi)能抵抗Fasl陽(yáng)性白血病細(xì)胞對(duì)CIK的反作用，故CIK能對(duì)白血病細(xì)胞能持久的發(fā) 揮作用。 DC 在體外的培養(yǎng)條件 , 加入當(dāng)歸多糖誘導(dǎo) CML 原始細(xì)胞分化生成的 DC 更成熟 , 激活 T 細(xì)胞能力更強(qiáng) 18。大劑量黃芪可提高急性白血病患者外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)生成 DC 的 數(shù)量并增強(qiáng) DC 的抗原呈遞功能 19。黃芪

27、總甙可調(diào)節(jié) T 細(xì)胞亞群的比例 ,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋 亡20。亡。白血病患者邪毒內(nèi)蘊(yùn)，耗氣傷陰，加之反復(fù)應(yīng)用化療，患者脾胃受損，故中醫(yī)辨證為邪 毒內(nèi)蘊(yùn)，氣陰兩虛。治以益氣養(yǎng)陰，清解毒邪。本研究將中醫(yī)辨證用藥與現(xiàn)代藥理研究相結(jié) 合，組成具有益氣養(yǎng)陰、清解毒邪作用的凌丹康復(fù)方。本研究表明益氣養(yǎng)陰解毒祛邪中藥凌 丹康復(fù)方配合自體 DC-CIK 細(xì)胞免疫治療血液學(xué)緩解期白血病有較好的臨床療效，能夠促進(jìn)白血病分子生物學(xué)緩解， 有很好的清除殘留白血病 , 防止白血病復(fù)發(fā)的作用。 其中輸注 3 次以 上，療效更佳。其作用機(jī)制不同于化療，可以清除微小殘留白血病，是繼造血干細(xì)胞移植之 后，又一腫可以治愈白血病的方

28、法，但無造血干細(xì)胞移植的風(fēng)險(xiǎn)，無明顯毒副反應(yīng)，醫(yī)療費(fèi) 用低，有很好的應(yīng)用前景。參考文獻(xiàn)1 童春容 ,耿彥彪 , 陸道培 . 自體細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞治療急性白血病的臨床研究. 北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) ,2000,32(5):473-477.2 Linn YC,Hui KM. Cytokine-induced killer cells:NK-like Tcells with cy-totolytic specificity against leukemiaJ .Leuk Lymphoma, 2003, 44 (9) :1457.3秦福麗綜述，張紹林，孫慧審校 CIK細(xì)胞的特點(diǎn)及臨床應(yīng)用.2004,3

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