有關(guān)免疫調(diào)節(jié)劑篩選及評(píng)估機(jī)體免疫狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)

1、 第五篇 有關(guān)免疫調(diào)節(jié)劑篩選及評(píng)估機(jī)體免疫狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)第一章 檢測(cè)非特異免疫功能的實(shí)驗(yàn)第一節(jié) 小白鼠碳粉廓清試驗(yàn)基本原理靜脈注射一定大小的顆粒物質(zhì)，迅速被肝、脾等器官內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞吞噬而使其在血漿濃度降低，因此可從其廓清率了解整個(gè)單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬功能。材料和儀器l 印度墨汁l 0.1%Na2CO3溶液l 毛細(xì)滴管l 72分光光度計(jì)操作步驟1 體重18一22g小白鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組。2 每鼠尾靜脈注射印度墨汁0.05ml/kg體重，于l（t1）和5（t5）分鐘后分別從眼眶靜脈取血20ul，加到2ml、0.1%Na2CO3溶液中搖勻；3 用72型分光光度計(jì)在680mm下比色,

2、測(cè)光密度（以下分別用OD1和OD5來(lái)表示l分鐘和5分鐘所取血樣的光密度）；4 按下式計(jì)算廓清指數(shù)K值： 廓清指數(shù)K=LogOD1logOD5=LogOD1/OD5T5-t14 K值經(jīng)體重及肝脾重?fù)Q算后得吞噬指數(shù)值： 吞噬指數(shù)體重肝脾重 以X來(lái)表示給藥組與對(duì)照組的 k值和 值，進(jìn)行組間 t檢驗(yàn)，比較差異的顯著性。 注意事項(xiàng)1. 印度墨汁應(yīng)用生理鹽水稀釋l一5倍左右。最好經(jīng)超聲處理后離心，棄出沉淀物，以免凝集的碳粒阻塞肺毛細(xì)血管，引起動(dòng)物致死。2. 尾靜脈注射要熟練，取血時(shí)間也可延長(zhǎng)至10分鐘，但必須準(zhǔn)確無(wú)誤。參考文獻(xiàn)劉輝2000研究生免疫學(xué)教程大連大連出版社258-259（張璐劉輝）第二節(jié) 小白

3、鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn) 基本原理通過(guò)定量地觀察巨噬細(xì)胞對(duì)雞紅細(xì)胞的吞噬情況，反映小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力。 材料和儀器l 5雞紅細(xì)胞生理鹽水懸液l 37孵箱l 固定液：1:1丙酮甲醇溶液l 染色液：4（VV）Glemsa一磷酸緩沖液 l 墊有濕紗布的搪瓷盒操作步驟 1 取體重 18一22g 的健康小白鼠隨機(jī)分成給藥組試驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。2每鼠腹腔注射 5雞紅細(xì)胞生理鹽水懸液0.5ml。 3 8-12小時(shí)后,頸推脫臼處死小鼠；正中剪開(kāi)腹壁皮膚，經(jīng)腹膜注入生理鹽水2m1，輕輕按揉鼠腹部 1分種，然后吸出腹腔洗液 lml，分滴于兩片載玻片上，放人墊有濕紗布的搪瓷盒內(nèi)，移置37孵箱溫育30分

4、鐘。4以生理鹽水漂洗，以除去未粘片的細(xì)胞，晾干。51:1丙酮甲醇溶液固定5分鐘。64（VV）Glemsa一磷酸緩沖液染色3分鐘，用流水沖洗，晾干。 7結(jié)果判定：油鏡下計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞，每片 200個(gè)按下式計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。吞噬百分率吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù) 100%200個(gè)巨噬細(xì)胞（吞及未吞噬的） 吞噬指數(shù)被吞噬的雞紅細(xì)胞2個(gè)巨噬細(xì)胞 在計(jì)數(shù)時(shí)，應(yīng)同時(shí)觀察雞紅細(xì)胞被消化的程度，借以判定巨噬細(xì)胞吞噬和消化功能通常分為4級(jí)： 級(jí)：未消化。被吞噬的雞紅細(xì)胞完整，胞質(zhì)淺紅或淺黃綠色，胞核淺紫紅色。 II級(jí)；輕度消化。胞質(zhì)淺黃綠色，胞核固縮呈紫藍(lán)色。 III級(jí)：重度消化。胞質(zhì)淡染，胞核呈淺灰黃色。

5、IV級(jí)：完全消化。巨噬細(xì)胞內(nèi)僅見(jiàn)形態(tài)類(lèi)似雞紅細(xì)胞大小的空泡，邊緣整齊胞核隱約可見(jiàn)。 注意事項(xiàng)1. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)注意無(wú)菌操作。2. 若篩選免疫抑制藥，預(yù)先可用巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)劑，在實(shí)驗(yàn)前34天，腹腔注射 0.5淀粉生理鹽水溶液，每鼠 0.5ml。免疫增強(qiáng)劑多可激活小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，并增強(qiáng)其吞噬功能一般不再使用巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)劑。3. 若滴片染色過(guò)深，可用1HCI脫色；過(guò)淺則可復(fù)染。4. 每鼠兩片的計(jì)數(shù)應(yīng)基本一致，若差距過(guò)大，應(yīng)予淘汰。由小鼠腹腔吸出的液體為出血性滲出液時(shí)，不宜使用。5. 必要時(shí)用低滲法溶解胞外紅細(xì)胞，這樣容易鑒別細(xì)胞內(nèi)外的雞紅細(xì)胞。6. 本法簡(jiǎn)便但難于測(cè)定吞噬速率及其動(dòng)力學(xué)改變，而且費(fèi)時(shí)

6、。參考文獻(xiàn)1. 巴德年1998當(dāng)代免疫學(xué)技術(shù)與應(yīng)用北京：北京醫(yī)科大學(xué)中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，261263（張璐劉輝）第三節(jié) 溶菌酶測(cè)定法（光學(xué)法）基本原理體液或分泌物中溶菌酶活性可以通過(guò)檢查其對(duì)指定敏感菌株的裂解作用來(lái)進(jìn)行測(cè)定，將檢品與菌液混合，用分光光度計(jì)觀察指定時(shí)間內(nèi)透光度改變的百分?jǐn)?shù)反映溶菌酶的活性。 材料與儀器l 菌種；溶壁微球菌（Micrococus Lysodeilicus）是從空氣中分離出的一種革蘭氏陽(yáng)性球菌，菌落呈黃色，普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好， 個(gè)月傳代次或凍干成菌種保存。l PH6.4,1/15M磷酸鹽緩沖鹽水（）：1/15M磷酸二氫鉀溶液：磷酸二氫鉀9.04g,，加蒸餾水

7、至1000ml。1/15M磷酸氫二鈉溶液：磷酸氫二鈉2H2O11.87g，加蒸餾水至1000ml。PH6.4, 1/15M PBS： 1/15M磷酸二氫鉀溶液73ml, 1/15M磷酸氫二鈉溶液27ml，氯化鈉0.5g 混勻，溶解即成。l 溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品：結(jié)晶純品。l 5N氫氧化鉀：氫氧化鉀56g加蒸餾水至200ml。l 分光光度計(jì)操作步驟1. 菌液制備：將溶壁微球菌接種于普通瓊脂斜面上，37 培養(yǎng) 24一36小時(shí)用 PH6.4、1/15M PBS洗下，配成混懸菌液。用分光光度計(jì)波長(zhǎng)640nm測(cè)定，并調(diào)整其濃度達(dá)到透光率40。2. 溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)液：稱取溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)純品，用PH6.4、l15M PBS

8、配成1000ug/ml原液，放冰箱保存。臨用時(shí)再稀釋成100、50、25及10ugml標(biāo)準(zhǔn)液。3. 檢品應(yīng)根據(jù)估計(jì)溶菌酶含量作適當(dāng)稀釋取適當(dāng)稀釋?zhuān)ɑ虿幌♂專(zhuān)z品0.2ml放小試管內(nèi)。置37 水浴箱預(yù)熱5分鐘，再向管內(nèi)加人預(yù)熱的菌液1.8ml混勻，立即記下開(kāi)始時(shí)間，至2分鐘時(shí)加入1滴5N氫氧化鉀停止反應(yīng)，立即將菌液倒入比色杯內(nèi)用640nm濾光板，0.5cm比色杯測(cè)其透光率T1%。4. 另取同樣濃度的檢品 0.2ml先加入 1滴 5N氫氧化鉀搖勻，在37預(yù)熱分鐘，再加入1.8ml經(jīng)37預(yù)熱的菌液，在同樣溫度下2分鐘后同法測(cè)定其透光率0。T一0為透光率差值，即溶菌酶所致透光率的變化，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查

9、得檢品中溶菌酶含量。5. 計(jì)算：以0.2ml各種濃度的溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)液代替檢品，操作步驟與待檢品相同。以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)得的透光率差值為縱坐標(biāo)（ 對(duì)數(shù)坐標(biāo)），溶菌酶濃度為橫坐標(biāo)，在半對(duì)數(shù)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按檢品的T（2分鐘的讀數(shù)減去零時(shí)的讀數(shù)）查出其對(duì)數(shù)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出稀釋的檢品中溶菌酶的含量，乘以稀釋倍數(shù)，即為檢品中溶菌酶的含量。注意事項(xiàng)溶菌酶是一種小分子蛋白質(zhì)，存在于機(jī)體的淚液、唾液、痰、鼻涕、白細(xì)胞和血清等。測(cè)定它在體液或分泌物中的含量及其變動(dòng)情況，可作為側(cè)面了解機(jī)體防御功能一個(gè)指標(biāo)。在選擇標(biāo)本及評(píng)價(jià)其意義時(shí)應(yīng)予以注意。參考文獻(xiàn)劉輝2000研究生免疫學(xué)教程大連大連出版社260261（張璐劉

10、輝）第四節(jié) 溶菌酶測(cè)定法（平板法）基本原理體液或分泌物中溶菌酶活性可以通過(guò)檢查其對(duì)指定敏感菌株的裂解作用來(lái)進(jìn)行測(cè)定，在混有菌液的瓊脂疑膠上打孔，將檢品放在孔內(nèi)，一定時(shí)間后測(cè)定溶菌環(huán)的直徑?？煞从橙芫傅幕钚?。 材料與儀器l 菌種：溶壁微球菌（Micrococus Lysodeilicus）是從空氣中分離出的一種革蘭氏陽(yáng)性球菌，菌落呈黃色，普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好， 個(gè)月傳代次或凍干成菌種保存。l PH6.4,1/15M磷酸鹽緩沖鹽水（）1/15M磷酸二氫鉀溶液：磷酸二氫鉀9.04g,，加蒸餾水至1000ml。1/15M磷酸氫二鈉溶液：磷酸氫二鈉2H2O11.87g，加蒸餾水至1000ml。PH6.

11、4, 1/15M PBS： 1/15M磷酸二氫鉀溶液73ml, 1/15M磷酸氫二鈉溶液27ml，氯化鈉0.5g 混勻，溶解即成。l 溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品：結(jié)晶純品。l 普通瓊脂培養(yǎng)基 操作步驟1. 菌液制備：將溶壁微球菌接種于普通瓊脂斜面上，37 培養(yǎng) 24一36小時(shí)用 PH6.4、1/15M PBS洗下，配成混懸菌液。用72型分光光度計(jì)波長(zhǎng)640nm測(cè)定，并調(diào)整其濃度達(dá)到透光率40。2. 溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)液：稱取溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)純品，用PH6.4、l15M PBS配成1000ug/ml原液，放冰箱保存。臨用時(shí)再稀釋成100、50、25及10ugml標(biāo)準(zhǔn)液。3. 加熱融化1.2%瓊脂粉，待冷卻至60-70時(shí)將溶

12、壁微球菌混入搖勻，使其濃度為1mg/ml，立即傾入已夾好的兩玻片中（厚度為4mm）。4. 待瓊脂凝固后，以15mm間隔，用打孔器穿鉆2.5mm直徑小孔，每孔中加入20ul檢樣品，并在同一板上加上不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶菌酶樣品，置24-26，12-18小時(shí)，用測(cè)微尺測(cè)溶菌環(huán)的直徑。5. 用半對(duì)數(shù)紙（以溶菌酶濃度為縱坐標(biāo)，即對(duì)數(shù)坐標(biāo)，溶菌環(huán)直徑為橫坐標(biāo)）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從線上查出每毫升樣品所含溶菌酶的ug數(shù)。注意事項(xiàng)在缺乏培養(yǎng)細(xì)菌的條件下也可使用干菌粉，將溶壁微球菌24小時(shí)培養(yǎng)物用60倍體積蒸餾水洗下，離心沉淀?xiàng)壣锨逡?，沉積的菌體加約5倍體積的丙酮，用玻棒攪勻，放冰箱內(nèi)30分鐘、取出離心沉淀?xiàng)壣锨逡?。按?/p>

13、法用丙酮浸洗3次，再用乙醚洗2次，將菌體放于燥器內(nèi)過(guò)夜，即得干菌粉。用乳體研碎備用，使用時(shí)稱干菌粉500mg，放人上述磷酸緩沖液約50ml，如上調(diào)整菌液濃度約30一40%.參考文獻(xiàn)劉輝2000研究生免疫學(xué)教程大連大連出版社260261（張璐劉輝）第二章 檢測(cè)特異性免疫功能的實(shí)驗(yàn)第一節(jié) 血清溶血素測(cè)定基本原理經(jīng)綿羊紅細(xì)胞（SRBC）免疫動(dòng)物的淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生抗SRBC抗體（溶血素）。并釋放至外周血。這種抗體在試管內(nèi)與SRBC溫育在補(bǔ)體參與下可產(chǎn)生溶血反應(yīng)免疫動(dòng)物血清中溶血素的含量可以通過(guò)溶血過(guò)程中釋放的血紅蛋白來(lái)測(cè)出。材料與儀器l SRBC保存液（Alsever液）；葡萄糖2.05g，氯化鈉 0.

14、42g，檸檬酸鈉 0.8g，蒸溜水100ml，無(wú)菌過(guò)濾（漏斗）或8磅10分鐘滅菌后備用。l 都氏試劑（測(cè)血紅蛋白用）；碳酸氫鈉 1.0g，高鐵氰化鉀 0.2g，氰化鉀0.05g，蒸餾水1000ml。l 補(bǔ)體：新鮮豚鼠（至少3只）混合血清經(jīng)SRBC（10:1）于4吸收30分鐘后置-20以下備用。l SRBC：在無(wú)菌條件下，自健康成年綿羊外頸靜脈取血，置血液于有玻璃珠的三角燒瓶中輕搖10分鐘以除去纖維蛋白，加人2 倍量的保存液，置4冰箱備用。臨用時(shí)用生理鹽水洗滌3次，經(jīng)2000rpm10分鐘得壓積紅細(xì)胞，再按所需濃度稀釋。 操作步驟1. 免疫；小鼠腹腔注射20SRBC 0.2ml天，免疫后第4天去

15、眼球或腹動(dòng)脈取血，分離血清，將血清稀釋?zhuān)ㄒ话?00倍以上）后供測(cè)定。2. 溶血反應(yīng)：反應(yīng)管內(nèi)依次加人經(jīng)稀釋的血清lml，5SRBC0.5ml，10補(bǔ)體lml置3. 37恒溫水浴中保溫30分鐘，然后移至冰浴中終止反應(yīng)，1500rpm離心5分鐘，取血清液lml加都氏試劑3ml，搖勻放置10分鐘，于540nm波長(zhǎng)比色讀取吸光度。4. SRBC半數(shù)溶血值：取SRBC 0.25ml加都氏液至 4ml，比色讀取吸光度值，即為實(shí)驗(yàn)中所用SRBC半數(shù)溶血時(shí)的吸光度值。5. 計(jì)算：樣品管中數(shù)溶血值 CH50按下式計(jì)算：每只鼠的血清CH50 =樣品的吸光度值稀釋倍數(shù)SRBC半數(shù)溶血時(shí)的吸光度值注意事項(xiàng)免疫用SRB

16、C濃度可根據(jù)不同品系小鼠的敏感度和試驗(yàn)藥物的作用強(qiáng)度作調(diào)整。參考文獻(xiàn)劉輝2000研究生免疫學(xué)教程大連大連出版社261262（張璐劉輝）第二節(jié) 抗體形成細(xì)胞測(cè)定基本原理將經(jīng)SRBC免疫的小鼠脾細(xì)胞、SRBC（靶細(xì)胞）及補(bǔ)體一起混合于瓊脂內(nèi)，抗體形成細(xì)胞分泌的抗體在補(bǔ)體參與下；使其周?chē)腟RBC溶解形成肉眼可見(jiàn)的溶血空斑，這種溶血空斑數(shù)大體上可以反映抗體形成細(xì)胞數(shù)。材料與儀器l SRBC保存液（Alsever液）；葡萄糖2.05g，氯化鈉 0.42g，檸檬酸鈉 0.8g，蒸溜水100ml，無(wú)菌過(guò)濾（漏斗）或8磅10分鐘滅菌后備用。l SRBC：在無(wú)菌條件下，自健康成年綿羊外頸靜脈取血，置血液于有玻

17、璃珠的三角燒瓶中輕搖10分鐘以除去纖維蛋白，加人2 倍量的保存液，置4冰箱備用。臨用時(shí)用生理鹽水洗滌3次，經(jīng)2000rpm10分鐘得壓積紅細(xì)胞，再按所需濃度稀釋。l 100目尼龍網(wǎng)紗布l Hanks液（見(jiàn)附錄）l 瓊脂粉l 0.4%臺(tái)盼藍(lán)l 生理鹽水l 補(bǔ)體：新鮮豚鼠（至少3只）混合血清經(jīng)SRBC（10:1）于4吸收30分鐘后置-20以下備用。l 戊二醛l 37溫箱等操作步驟1. 免疫：用 20SRBC 0.2ml只腹腔注射免疫小鼠。免疫后第 4天處死供實(shí)驗(yàn)。2. 制備脾細(xì)胞懸液：脫頸處死經(jīng)SRBC免疫的小鼠，立即剖取脾臟，在冰浴中，將脾置于100目尼龍網(wǎng)紗布上，加少許 Hanks液，輕輕擠壓

18、出脾細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)用 0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色觀察活細(xì)胞應(yīng)在90以上。將脾細(xì)胞懸液配成107個(gè)ml濃度。3. 制備瓊脂底層；平皿中加人用Hanks液配成的溶化的14瓊脂23ml制備瓊脂底層。4. 加樣：取脾細(xì)胞懸液和 5SRBC各 0.lml及原補(bǔ)體 0.05ml混合加入保溫于 45水浴的含0.4瓊脂糖0.8ml的試管中，搖勻后倒人平皿，旋轉(zhuǎn)平皿使混合物均勻平鋪于底層瓊脂上，凝固后將平皿裝人溫盒并置37溫箱中孵育34小時(shí)后計(jì)數(shù)PFC。如需保存，可加入生理鹽水或PBS配制的0.25戊二醛6ml加以固定。5. 計(jì)算：以每106個(gè)脾細(xì)胞或整個(gè)脾臟所含的PFC數(shù)表示結(jié)果。注意事項(xiàng)PFC代表抗體產(chǎn)生細(xì)胞的數(shù)

19、量，PFC的面積代表抗體的活性，討論試驗(yàn)意義時(shí)應(yīng)予以注意。參考文獻(xiàn)巴德年1998，當(dāng)代免疫學(xué)技術(shù)與應(yīng)用北京：北京醫(yī)科大學(xué)中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社， 207208（張璐劉輝）第三節(jié)特異性淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)基本原理 先用抗原刺激機(jī)體，再用該抗原在體外刺激有關(guān)淋巴細(xì)胞，通過(guò)觀察淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化情況評(píng)定機(jī)體的免疫功能。材料和儀器l 反應(yīng)細(xì)胞：取自體內(nèi)免疫后小鼠淋巴結(jié)的T細(xì)胞l 抗原：1mg/ml 抗原溶于PBSl 輔助細(xì)胞：經(jīng)照射或絲裂霉素C處理后同系小鼠脾細(xì)胞（或非T脾細(xì)胞）l Freunds完全佐劑l 96孔圓底或平底細(xì)胞培養(yǎng)板l 3H-標(biāo)記甲基胸腺嘧啶l 100%乙醇l 閃爍液l 多孔收集器l 玻璃

20、纖維濾紙l 液體閃爍計(jì)數(shù)儀l 液閃管等【操作步驟】 免疫小鼠：制備抗原水溶液與Freunds完全佐劑的混懸液。若為引起淋巴結(jié)細(xì)胞的免疫應(yīng)答，可經(jīng)足墊免疫；若主要引起脾細(xì)胞免疫應(yīng)答，可經(jīng)腹腔免疫。皮下免疫后再經(jīng)尾靜脈免疫也是一條有效的免疫途徑。細(xì)胞抗原可經(jīng)腹腔免疫。需免疫2-3周才可進(jìn)行體外試驗(yàn)。 將抗原做4倍或10倍稀釋?zhuān)靠准尤?0 ul蛋白質(zhì)抗原。對(duì)照孔加入30 ul培養(yǎng)基。 無(wú)菌取免疫后小鼠淋巴結(jié)和未免疫同系小鼠淋巴結(jié)，制成細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)。 每孔加入100 ul反應(yīng)細(xì)胞。反應(yīng)細(xì)胞最好為純化后T細(xì)胞，否則可能會(huì)因非抗原特異細(xì)胞的增殖反應(yīng)使對(duì)照值增高。若使用未分離的淋巴結(jié)細(xì)胞，每孔可加入1

21、-2106 細(xì)胞。 每孔加入100 ul 5106輔助細(xì)胞。 37，5% CO2培養(yǎng)4-5天。結(jié)束培養(yǎng)前6-18h每孔加入0.5-1.0Ci3H-胸腺嘧啶。 用細(xì)胞收集器將細(xì)胞收集在濾紙上，反復(fù)（至少10次）充吸培養(yǎng)孔，以保證DNA留在濾紙上，而未摻入的3H胸腺嘧啶被完全除去。100%乙醇處理以助于濾紙干燥?；蜢o置過(guò)夜。將干燥的濾紙片加入液閃瓶，每瓶含5ml 閃爍液。液閃儀計(jì)數(shù)cpm值。注意事項(xiàng)多數(shù)情況下，1106/ml細(xì)胞濃度對(duì)多數(shù)刺激能產(chǎn)生良好的增殖反應(yīng)。否則需預(yù)先滴定出合適的細(xì)胞濃度。當(dāng)細(xì)胞濃度低時(shí)，改用96孔圓底培養(yǎng)板能提高增殖反應(yīng)。 細(xì)胞在培養(yǎng)前應(yīng)具有良好的活力。 3H-胸腺嘧啶摻入

22、時(shí)間長(zhǎng)，會(huì)提高實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。每批實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)固定摻入時(shí)間和摻入量。參考文獻(xiàn)葉應(yīng)嫵1997全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程南京：東南大學(xué)出版社379-381（張璐劉輝）第三章 有關(guān)免疫實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物模型第一節(jié) 免疫功能低下動(dòng)物模型基本原理利用淋巴細(xì)胞敏感的細(xì)胞毒藥物抑制或殺傷淋巴細(xì)胞，使機(jī)體免疫功能低下。試劑與器材l 環(huán)磷酰胺l 氫化可的松操作步驟方法一：健康小鼠，每鼠皮下注射環(huán)磷酰胺：80100mg/kg，5天后免疫功能顯著降低。方法二：健康小鼠，每鼠每天皮下注射氫化可的松：50100mg/kg，68天后免疫功能顯著受抑。注意事項(xiàng)1. 必須設(shè)對(duì)照組，隨機(jī)分配。在用免疫功能障礙的動(dòng)模型時(shí)，亦應(yīng)加設(shè)正常動(dòng)物對(duì)照組，

23、以檢驗(yàn)?zāi)Ｐ褪欠癯晒Α?. 由于免疫反應(yīng)與基因類(lèi)型有關(guān)，應(yīng)盡可能采用純系動(dòng)物，并控制鼠齡、性別和體重，以減少個(gè)體差異。 參考文獻(xiàn)余傳霖1998，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)免疫學(xué)上海：上海醫(yī)科大學(xué)出版社，12021214（張璐劉輝）第二節(jié)大鼠同種被動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng)基本原理將致敏大鼠的血清（內(nèi)含豐富的lgE抗體）皮內(nèi)注射于正常大鼠腹壁或背部，每點(diǎn)形成一皮丘。IgE與局部皮膚肥大細(xì)胞的FC受體結(jié)合，使之被動(dòng)致敏。當(dāng)抗原攻擊時(shí)，引起局部肥大細(xì)胞釋放過(guò)敏介質(zhì)，從而使局部血管的通透性增加，注入伊文思藍(lán)，可滲出于皮丘內(nèi)，形成一個(gè)藍(lán)斑。根據(jù)藍(lán)斑范圍或深淺程度，判定血管通透性變化，以反映皮膚過(guò)敏反應(yīng)的程度。試劑與儀器l 天花粉l 4

24、氫氧化鋁l 5伊文思藍(lán)溶液（內(nèi)含天花粉1mg）操作步驟1. 抗血清制備：取體重 90100g健康大鼠，天花粉以4氫氧化鋁凝膠配成5mgml的混懸液，給大鼠4個(gè)足跖注射各0.lml，共0.4ml。于致敏后1014天，處死動(dòng)物采血，血經(jīng)低速離心，分離血清，置冰箱備用。2. 被動(dòng)皮膚致敏及抗原攻擊：另取體重150200g健康大鼠，在乙醚麻醉下剪去背部的毛，將稀釋的抗血清（稀釋度可在I：20一1：80）皮內(nèi)注射于鼠背部，每一稀釋度注射二點(diǎn)。每點(diǎn)0.lml，至少注射兩個(gè)稀釋度。48小時(shí)后進(jìn)行抗原攻擊，靜脈注射 lml、0.5伊文思藍(lán)溶液（內(nèi)含天花粉1mg）。20分鐘后斷頭處死動(dòng)物，翻轉(zhuǎn)背部皮膚，測(cè)定藍(lán)色

25、反應(yīng)斑的直徑大小。注意事項(xiàng)1. 本法是抗I型變態(tài)反應(yīng)藥物常用的篩選方法，方法簡(jiǎn)便，篩選的結(jié)果與臨床效果基本吻合。2. 注意假陽(yáng)性的發(fā)生，有些藥物可以降低血管通透性，也能得到陽(yáng)性結(jié)果，但不一定影響過(guò)敏反應(yīng)，應(yīng)予排除。3. 為使結(jié)果更加客觀，可剪下藍(lán)斑皮膚，每點(diǎn)以5ml丙酮生理鹽水溶液(3:7VV），浸泡48小時(shí)，離心，取出上清液，以590nm測(cè)定光密度。PCA抑制百分率可用下式計(jì)算：抑制百分率對(duì)照組藍(lán)斑直徑或光密度一用藥組藍(lán)斑直徑或光密度100%對(duì)照組藍(lán)斑直徑或光密度參考文獻(xiàn)劉輝2000研究生免疫學(xué)教程大連大連出版社266267（張璐劉輝）第三節(jié)型變態(tài)反應(yīng)動(dòng)物模型基本原理經(jīng)綿羊紅細(xì)胞（SRBC）

26、免疫動(dòng)物的淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生抗SRBC抗體（溶血素）。將這種抗體注射于正常動(dòng)物的皮內(nèi)組織，在補(bǔ)體參與下，可引起皮膚血管炎，使血管通透性增加。皮膚血管炎反應(yīng)輕重可以通過(guò)血管通透性來(lái)反映。亦稱Forssmam皮膚血管炎反應(yīng)。試劑與儀器l SRBC保存液（Alsever液）；葡萄糖2.05g，氯化鈉 0.42g，檸檬酸鈉 0.8g，蒸溜水100ml，無(wú)菌過(guò)濾（漏斗）或8磅10分鐘滅菌后備用。l SRBC：在無(wú)菌條件下，自健康成年綿羊外頸靜脈取血，置血液于有玻璃珠的三角燒瓶中輕搖10分鐘以除去纖維蛋白，加人2 倍量的保存液，置4冰箱備用。臨用時(shí)用生理鹽水洗滌3次，經(jīng)2000rpm10分鐘得壓積紅細(xì)胞，再按

27、所需濃度稀釋。操作步驟抗SRBC血清制備：將109 SRBC混懸于 lml磷酸鹽緩沖液，給正常兔靜脈注射，隔天l次，共10次。于最后一次注射后14天，收集兔血清。本血清即為抗SRBC血清亦即溶血素。抗血清接種及觀察：取體重200300g健康豚鼠，剪去背部，將1：8以生理鹽水稀釋的抗血清皮內(nèi)注射于背部，每點(diǎn)0.lrnl?？筛鶕?jù)實(shí)驗(yàn)要求，注射多個(gè)稀釋度的抗血清，每個(gè)稀釋度至少注射兩點(diǎn)。 24小時(shí)后可見(jiàn)注射局部有炎癥反應(yīng)。靜脈注射 0.5伊文思藍(lán)溶液 lrnl，半小時(shí)后注射局部有一明顯的藍(lán)斑。處死動(dòng)物，測(cè)定皮膚藍(lán)斑的直徑。注意事項(xiàng)為使結(jié)果客觀，可用比色法測(cè)定藍(lán)斑中伊文思藍(lán)的含量，每點(diǎn)以5ml丙酮生理

28、鹽水溶液(3:7VV），浸泡48小時(shí)，離心，取出上清液，以590nm測(cè)定光密度?？捎孟率接?jì)算抑制百分率：抑制百分率對(duì)照組藍(lán)斑直徑或光密度一用藥組藍(lán)斑直徑或光密度100%對(duì)照組藍(lán)斑直徑或光密度參考文獻(xiàn)劉輝2000研究生免疫學(xué)教程大連大連出版社268269（張璐劉輝）第四節(jié) III型變態(tài)反應(yīng)動(dòng)物模型基本原理本模型的形成需要有抗原的持續(xù)存在，將抗原物質(zhì)反復(fù)注射，抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合形成游離的免疫復(fù)合物，在一定條件下這種復(fù)合物沉積在血管壁基底膜或組織間隙，通過(guò)激活補(bǔ)體、中性粒細(xì)胞或血小板，造成沉積部位炎癥變化。亦稱Arthus反應(yīng)。試劑與儀器l 硫酸鈉l 卵白蛋l(fā) Freunds完全佐劑（有商品出售）操作步驟取體重l2.5kg健康免，雌雄不拘。 將經(jīng)3次重結(jié)晶的卵白蛋白乳化于Freunds完全佐劑中，乳化必需充分。 每周肌肉注射 lml，共4次。 最后 1次注射后第 9天，背部剪毛，第天背部皮內(nèi)注射 10卵白蛋白，每點(diǎn)注射量為0.2ml。 抗原攻擊后 2、3、4、6、8、12、24小時(shí)觀察每點(diǎn)局部皮膚紅腫的最大直徑與反應(yīng)的程度，求其平均值。反應(yīng)程度標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)；：2或5小時(shí)明顯充血、出血，呈融合狀；24小時(shí)明顯出血性變色。：2或5小時(shí)中度充血、出血，呈斑塊狀；24小時(shí)中度出血性變色。十：