基因工程試驗報告的試驗步驟

1、實驗一：大腸桿菌5 a和21感受態(tài)細胞的制備【實驗步驟】1從平板上挑取新活化的大腸桿菌5a單菌落，接種到5培養(yǎng)基中，37C振蕩培養(yǎng)過夜。2取1培養(yǎng)物接種到100培，養(yǎng)基（250三角瓶）中，37C振蕩培養(yǎng)23h。3將菌液轉(zhuǎn)移到50離心管（2管）中，冰上放置15。4 4C 4000離心5,棄去上清液，倒置使培養(yǎng)液流盡。5用20冷2溶液懸浮菌體沉淀合并成一管，在4C 4000離心5,棄去上清液。6用10冷2溶液懸浮菌體沉淀，冰浴30o7 4C4000離心5,棄去上清液，用2的冷2溶液懸浮。載體的轉(zhuǎn)化（無菌條件，冰上進行）1、取200新鮮制備的感受態(tài)細胞，分別加入質(zhì)粒2 （32a, 18）,混勻，冰上

2、放置30。8分裝到數(shù)個管中，每管200,冷凍保存?zhèn)溆?。實驗二：目的基因質(zhì)粒（或218）和表達載體質(zhì)粒（32或30）的轉(zhuǎn)化及大量提取【實驗步驟】2 /42、將管放到42C保溫90s,冰浴2。3、加入800液體培養(yǎng)基，37 C慢搖復蘇1 h。4、將100的復蘇細胞涂布在含有（100）的培養(yǎng)皿中，正置平皿30 （使液被培養(yǎng)基吸收）。5、倒置平皿37C培養(yǎng)16h,出現(xiàn)落。二、質(zhì)粒的提取1挑取單菌落接種于100加入50的液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)過夜。2過夜培養(yǎng)的液加入1.5的小指管（20個每組）中，每次1 , 4C, 12000,離心1 ,4次，棄上清。3加入150溶液I懸浮細胞，漩渦振蕩，室溫靜置 10

3、。4加入350溶液H （新鮮配制），輕微顛倒混勻20次，冰浴5。（不能再劇烈震蕩）5加入300溶液川（冰上預冷），顛倒混勻20次，不能劇烈震蕩，冰浴10o6 4C, 12000,離心10,取上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中。7向上清中加入0.6倍異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置 20o8 4C, 12000,離心10,棄上清，倒扣于吸水紙上，吸凈液體。9用170%乙醇洗滌質(zhì)粒沉淀2次，每次4 C, 12000,離心3,吸去上清。10 55C烘干至無酒精，加入20 ,所有集成一管后加入12, 37C消化12h, 20C保存。11電泳分析。制膠：0.14g瓊脂糖，20 1 X緩沖液，溶解后倒入制膠板,放入梳子，冷

4、 卻凝固待用。點樣：6質(zhì)粒+1上樣緩沖液。電壓:180V,電泳至藍色帶距離點樣孔3o實驗三目的基因質(zhì)粒和表達載體質(zhì)粒的酶切及其產(chǎn)物的分離純化【實驗步驟】1酶切酶切體系試劑小量酶切大量酶切火菌水5質(zhì)粒1088I0.51出0.51終體積20100按以上酶切體系加入0.5管中，37C放置3h,電泳回收片段。（點樣：酶切體系100上樣緩沖液20o ）2酶切產(chǎn)物的回收1） 將單一的目的條帶從瓊脂糖凝膠中切下（盡量切除多余部分放入干凈的離心管中，稱取重量。2）向膠塊中加入3倍體積溶膠液（如果凝膠重為0.1g,其體積可視為100,則加入300溶膠液），50-55C水浴放置10,期間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，

5、以確保膠塊充分溶解。注意：溶膠時，如果溶膠液變?yōu)榧t色（正常情況下為淡黃色），可向含有的膠溶液中加10-303N醋酸鈉（5.2）將溶液調(diào)為淡黃色，否則將會影響與吸附柱的結(jié)合，影響回收效果。3）將上一步所得的溶液加入一個吸附柱中（吸附柱放入收集管中），13, 000離心30-60S,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。注意：膠塊完全溶解后最好將膠溶液溫度降至室溫再上柱，因為吸附柱在較高溫度時結(jié)合的能力較弱。4）向吸附柱中加入700漂洗液（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），13, 000離心30-60S,倒掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中。5）向吸附柱中加入500漂洗液，13, 000離

6、心30-60S,倒掉廢液。6）將離心吸附柱放回收集管中，13, 000離心2,盡量出去漂洗液，將吸附柱開蓋于室溫12,徹底晾干，防止殘留的漂洗液影響下一步的實驗。7）將吸附柱放到一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量65-70 C預熱的洗脫液，室溫放置2o 13, 000離心2收集溶液。8）產(chǎn)物-20 C保存。完畢后電泳檢測回收與純化效果：回收純化后，電泳檢測應為單一的一條帶，如果切膠過程中不慎帶上染帶，回收后電泳結(jié)果可能會出現(xiàn)兩條以上的帶，這時應重復上述方法進行回收與純化。實驗四目的基因與表達載體的重組及重組子的篩選與鑒定【實驗步驟】1載體與目的基因的連接1）在一 1.5管中加入2

7、酶切后的載體與6目的片段。2）添加1的10 X以及1的T4連接酶，總體積10。3）16C水浴條件下保溫過夜連接。2感受態(tài)細胞與連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化1）取感受態(tài)細胞21 （實驗一制備）200,加入6連接產(chǎn)物，輕輕用槍吹打混勻（不可震蕩）。2）冰浴30。3）熱激：42C保溫90S,冰浴2。4）加入800培養(yǎng)基，37 C慢慢復蘇30o5)將復蘇菌液4000離心1,先吸去800卩L上清，再將細胞吹散成細胞懸液,取50卩L細胞懸液直接涂布在含氨節(jié)青霉素（）100、和的選擇平板上。6）將平板正向放置30左右至液體被吸收，倒置平板37C培養(yǎng)16 20h出現(xiàn)菌落，其中白色為重組質(zhì)粒。37C振蕩培養(yǎng)過夜。3重組子的鑒

8、定（藍白斑篩選，小提質(zhì)粒比大小和酶切分析）1）將白色單菌落接入3含抗生素（）的液體培養(yǎng)基中,2）按實驗二的方法提取質(zhì)粒，20溶解沉淀。5/43）雙酶切質(zhì)粒20體系，方法同上。4）1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測重組質(zhì)粒和它的酶切產(chǎn)物。（酶切鑒定重組子可見重組成功的重組子有兩個條帶：一為切為線性的32a質(zhì)粒條帶，一為目的基因條帶。）實驗五目的基因在大腸桿菌中的誘導表達及表達產(chǎn)物的分析 實驗I、外源基因在大腸桿菌中的誘導表達【實驗步驟】1. 分別挑取白斑菌落（重組菌株）、藍斑菌落（非重組菌株）于5含的液體培養(yǎng)基中，37C,190振蕩培養(yǎng)過夜（注意取菌株要在超靜工作臺上操作，一定注意無菌）。2. 分別取過夜

9、培養(yǎng)菌1接種到5含的液體培養(yǎng)基中（藍，白斑各 3管，作好標記），于37 C 搖床培養(yǎng)4h左右，達到1個值。3. 因為誘導劑的量，誘導條件，誘導時間，培養(yǎng)基成分都可影響誘導表達，所以可按如下6組設(shè)計培養(yǎng)搖瓶時間0575757575757溫度C樣液32白37白42白32藍37藍42藍8/44. 分別取6支試管按上述表格控制條件，搖瓶培養(yǎng)5h。5. 取1搖瓶后菌液于離心管，共6支，4C低溫離心，12000, 5,收獲菌體，棄上清，取 沉淀（菌體 可放-20 C存放備用）。6. 向每支試管沉淀均加入200卩L液,將細胞懸浮。7. 每管加入200卩L2Xo開水煮沸5,再冰浴2, 4C ,12000, 5

10、,取上清液做凝膠電 泳。8. 觀測結(jié)果及分析（實驗n）。實驗n檢測表達蛋白【實驗步驟】1.配制分離膠分離膠配方雙蒸水分離膠緩沖液30%交貯液6.7581010200 卩 L15卩L150 卩 L 按要求裝好膠板 按比例調(diào)好分離膠，混勻后加入兩玻璃夾縫中，到上口約2處，并小心在膠面上加入1蒸f留水，約40,等膠自然凝聚后傾斜倒，出蒸f留水，并在兩玻璃板夾縫中水平插入1.5的梳子（在膠 面上加入蒸f留水稱水封，其目的是保持膠面平整和防止空氣進入，影響凝膠）。2.按配方配制好濃縮膠濃縮膠配方雙 蒸水濃縮膠緩沖液膠貯液1010100 卩 L15L75 L混勻后加入到分離膠上，并沒過梳子，待凝固后小心撥出梳子。3.樣品制備體樣品與2X