蘭州熊蜂(膜翅目：蜜蜂科)卵黃原蛋白基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

1、蘭州熊蜂(膜翅目：蜜蜂科)卵黃原蛋白基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控 在生殖過程中 ,卵黃原蛋白作為卵黃前體 , 是卵生生物包括昆蟲中非常重要 的。卵黃原蛋白的轉(zhuǎn)錄通常是由激素調(diào)控的 , 比方保幼激素、蛻皮激素及某些神 經(jīng)肽。關(guān)于昆蟲卵黃原蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究主要集中在雙翅目與鱗翅目, 膜翅目昆蟲的卵黃原蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究較少。蘭州熊蜂作為一種重要的授粉昆蟲 , 擴大其 繁殖量, 產(chǎn)生更多的工蜂后代可更好地滿足實際應(yīng)用中授粉的需求。基于此, 研究蘭州熊蜂的轉(zhuǎn)錄調(diào)控具有十分重要的意義。主要結(jié)果如下 :1、 蘭州熊蜂卵黃原蛋白基因結(jié)構(gòu)及表達特性蘭州熊蜂卵黃原蛋白基因 (Genbank 號:MF632304)全長為722

2、7bp,包含7個外顯子和6個內(nèi)含子,其mRNA(Genbank 號:MF632303)序列長度為5319bp,編碼的蛋白長度為1772個氨基酸、分子量 201.5 kDa 及等電點為 6.21 。對蘭州熊蜂的卵黃原蛋白 (BlVg) 進行保守域分析 , 發(fā)現(xiàn)其具有典型的卵黃原 蛋白結(jié)構(gòu)域：第一，在N端附近的Vitellogenin_N保守域從第28個氨基酸開始，到第750個氨基酸終止；第二，中間部位有保守域DUF1943自第783個氨基酸起 至第1043氨基酸；第三，在C端第1450個氨基酸至第1620個氨基酸為保守域VWD 通過系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn) , 其與其他熊蜂物種位于一個分支上。分別取處女

3、蜂王及產(chǎn)卵蜂王的頭、飛行肌、卵巢與脂肪體組織 ， 采用實時熒 光定量PCF方法檢測BlVg的mRN表達量。qRT-PCR吉果顯示，相同生殖狀態(tài)下 的蜂王， 在脂肪體中表達量最高 (處女王為 383.9- 倍； 產(chǎn)卵蜂王為 3357.07 倍)， 飛 行肌、頭次之 ， 卵巢最低 ， 且不同組織之間均存在顯著性差異 (p<；0.05)。在相同組織中，產(chǎn)卵蜂王的BlVg的mRNAft達量顯著高于處女蜂王(p<0.05) 。2、蘭州熊蜂轉(zhuǎn)錄因子 Broad-Complex 基因的特征及真核表達蘭州 熊蜂Broad-Complex基因選擇性剪切體眾多,通過PCR獲得Z1-Z4這四種剪切體, 分

4、別命名為 BlBrC-Z1 、2、BlBrC-Z3 和 BlBrC-Z4, 它們的核苷酸長度分別為 1491 bp、1293 bp 、1257 bp 與 1239 bp 。蘭州熊蜂BIBrC蛋白具有典型的Broad-Complex蛋白應(yīng)有的保守域：第一， 在N端附近的中心區(qū)域由BTB保守域及Linker組成；第二,在C端為各種選擇性 剪切體特異的鋅指結(jié)構(gòu)域。通過與蘭州熊蜂基因組數(shù)據(jù) (未發(fā)表)比對,發(fā)現(xiàn)這四 種剪切體在DNA上的排列順序為Z4、Z3、Z2、Z1。通過熒光定量PCR發(fā)現(xiàn),與處女蜂王相比,產(chǎn)卵蜂王的卵巢中BlBrC-Z1與 BlBrC-Z3表達量顯著升高。將這四種剪切體構(gòu)建至 pB

5、mFlag-B1BrC重組質(zhì)粒進 行真核表達。通過 Western blot 證明這四個蛋白均成功表達。 3、蘭州熊蜂卵黃原蛋白基 因BlVg啟動子的活性分析采用染色體步移法,以蘭州熊蜂腹部DNA為模板,獲得 卵黃原蛋白基因BlVg起始密碼子上游1517 bp長度的5側(cè)翼序列。生物信息學分析顯示,該序列具有TATAbox CAATbox C/EBP等根本元件和 DBrC3 DE74等響應(yīng)蛻皮激素信號的重要結(jié)合元件。隨后構(gòu)建不同長度的啟動子 缺失片段 , 最后利用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)分析該基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性及調(diào)控應(yīng)答激素 的相關(guān)元件。結(jié)果顯示, 保幼激素誘導沒有顯著改變 BlVg 啟動子的活性 ,而 20-羥基蛻皮 酮對BlVg啟動子活性具有明顯的誘導作用。4、轉(zhuǎn)錄因子Broad-Complex對BlVg 啟動子活性的調(diào)控作用運用點突變技術(shù)，發(fā)現(xiàn)啟動子上DBrC3結(jié)合位點堿基的突 變會導致其不能被20-羥基蛻皮酮誘導；此外