不同提取方法趕黃草提取物清除DPPH自由基的作用研究

1、不同提取方法趕黃草提取物清除DPPH自由基的作用研究作者：賀曉華，許龍，談滿良，杜方麓，曾建國【摘要】目的研究趕黃草提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用。方法采用不同溶劑、不同提取方法制得趕黃草提取物，以抗壞血酸為對(duì)照，研究其對(duì)DPPH自由基的清除作用。結(jié)果不同溶劑提取物對(duì)DPPH自由基清除率強(qiáng)弱依次為95%乙醇水丙酮，不同極性部分對(duì)DPPH自由基清除率強(qiáng)弱依次為醋酸乙酯部分正郝丁醇部分水部分石油醚部分，趕黃草姆提取物濃度達(dá)到一定濃度后與抗壞血酸對(duì)阼DPPH自由基清除能力相當(dāng)。結(jié)論回流梳提取法是最適合提取趕黃草中有效成分的方法，趕黃草95%乙醇回流提取物具有蛀良好的清除DPPH自由基的能力，醋酸乙

2、酯部分清除DPPH自由基能力最強(qiáng)。濡【關(guān)鍵詞】趕黃草；DPPH自由基謀；清除率Abstract：ObjectiveTostudytheext噓ractsfromPenthorumchinensePurshonsca鏑vengingDPPHfreerad籩ical.MethodsTheDPPHscavengingactivitiesofPenthorumchin孫ensePurshextracted唄bydifferentmethods洶anddifferentsolven閣tswerestudiedandco暨mparedwiththatofas籩corbicacid.Results悄Thes

3、cavengingactiv噱itywasdecreasedint匏heorderofPenthorum鉛chinensePurshextra慫ctsobtainedfrom95%丘ethanolwateracetone,andPolardifferentpartsonDPPHfree锃radicalstrongscavengingactivitywerep陔artofethylN-butan霎olwaterpetroleum鬲ether.PenthorumchinensePurshextracta茉ndascorbicacidinac庶ertainconcentratio磨nhadthesa

4、meDPPHfreeradicalscavengingrefluxisthebestmet殷hod,95%ethanolextr剝acthasgoodactivity撻toscavengetheDPPHf此reeradical,andethy宅lacetatethemoststr綦ongseavengingactiv早itytoDPPHfreeradic遐al.Keywords：PenthorumchinensePursh;何DPPHfreeradical;鮭Scavengingactivity酬趕黃草為虎耳草科扯根菜屬PenthorumGronvexl植物扯根菜P蟬enthorumchine

5、nsePu锍rsh的干燥地上部分1。趕黃草為沁苗族民間的草藥，主要分布于四川、貴州廄、湖南等地，具有清熱解毒、退黃利濕、活血散瘀、利水消腫之功效2。趕黃鰈草中含有黃酮、有機(jī)酸、揮發(fā)油等成分，品其中沒食子酸和槲皮素為趕黃草中有效成吞分3，具有抗乙肝病毒和保肝的作用。對(duì)于趕黃草清除DPPH自由基的活性氤研究及其抗氧化研究尚未見報(bào)道。衰老準(zhǔn)、癌癥及炎癥等疾病與體內(nèi)脂質(zhì)過氧化和自由基有直接關(guān)系，因?yàn)樽杂苫膳c生物近體內(nèi)的許多物質(zhì)如脂肪酸、蛋白質(zhì)等作用獺，奪取它們的氫原子，造成相關(guān)細(xì)胞的結(jié)璣構(gòu)與功能的破壞，更重要的是其氧化產(chǎn)物酆和中間產(chǎn)物會(huì)傷害生物膜、酶、維生素、蛋白質(zhì)及活細(xì)胞功能，其中一些還被認(rèn)為臠是

6、致癌物質(zhì)，因此對(duì)消除自由基的探討已橘得到普遍關(guān)注4。清除自由基的檢測(cè)狃方法很多，如電子順磁共振法、電子自旋共振法、化學(xué)發(fā)光法等，但這些方法大多習(xí)需用昂貴的儀器，一般實(shí)驗(yàn)室難以應(yīng)用。蒡DPPH分析法是一種篩選自由基清除劑吞，評(píng)價(jià)抗氧化活性的簡便方法5。當(dāng)白有自由基清除劑存在時(shí)，由于其與DPP睿H中電子配對(duì)使DPPH液吸收逐漸消失溯，DPPH液褪色程度與配對(duì)電子數(shù)成化學(xué)計(jì)量關(guān)系，因而可用分光光度法進(jìn)行定淳量分析。為了了解趕黃草的抗氧化性質(zhì)，市進(jìn)而闡明其所具有的抗病毒保肝作用機(jī)制，本文對(duì)趕黃草提取物清除DPPH自由鱸基的活性進(jìn)行了研究。1儀器與試劑瀟雙光束紫外可見分光光度計(jì)TU-19粕01(北京普析

7、通用儀器有限公司)，電俏子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)右，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器有限公俑司)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(北京市永光绔明醫(yī)療儀器廠)，超聲清洗儀(昆明市超憨聲儀器有限公司)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(江晦蘇省榮華儀器制造有限公司)。二苯基瞽苦味?；诫?DPPH)，購自sig節(jié)ma公司。供試藥材趕黃草XX-10仿下旬采自湖南瀏陽，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)周煉日寶教授鑒定為虎耳草科植物趕黃草Pe詛nthorumchinensePur枕sh。2方法趕黃草有效成分的提取回流提取法準(zhǔn)確稱取藥材g，加渥入10倍量的溶劑，回流提取2h，重復(fù)揶兩次，將提取液過濾，濾液真空濃縮至浸焰膏，干燥待用。超聲提取法

8、準(zhǔn)確稱取蚯藥材g，加入10倍量的溶劑，加熱超聲踴2h，重復(fù)兩次，將提取液過濾，濾液真空濃縮至浸膏，干燥待用。溫浸法準(zhǔn)觫確稱取藥材g，加入10倍量的溶劑，溫祁浸2h，重復(fù)兩次，將提取液過濾，濾液韋真空濃縮至浸膏，干燥待用。不同極性溶劑萃取法準(zhǔn)確稱取藥材g，以“”方法用75%乙醇提取兩次，提取液經(jīng)真空蝻濃縮至小體積，依次用石油醚、醋酸乙酯和正丁醇萃取，所得各萃取部分濃縮成浸柒膏，干燥待用。趕黃草提取物清除DPPH自由基能力的測(cè)定清除率的測(cè)灌定精密稱取mgDPPH于50ml容量苧瓶中，用95%乙醇溶解；樣品溶解于9默5%乙醇溶液中。取樣品溶液1ml加入嘬到離心管，再加入3ml的DPPH溶液配成樣品溶

9、液。95%乙醇溶液1ml加入到離心管，再加入DPPH溶液3ml配成未加樣品液的DPPH溶液。取樣品賚溶液1ml加入到離心管，再加入3ml的95%乙醇配成樣品空白溶液。上述溶液在室溫下離心20min后用紫外分光梏光度計(jì)在517nm下檢測(cè)。測(cè)定樣品溶葺液吸光度Ai，未加樣品液的DPPH溶暨液吸光度Ac，樣品空白溶液吸光度Aj碇。根據(jù)下列公式計(jì)算清除率：清除率=靛1Ac100%半清除率拈的測(cè)定抗氧化劑清除自由基能力采用清除DPPH的半清除率表示。將待測(cè)液配制磺成不同濃度溶液，測(cè)定DPPH自由基清雇除率，并繪制DPPH自由基清除率對(duì)待測(cè)液濃度曲線，由曲線讀取或用方程計(jì)算玎出DPPH自由基清除率為50時(shí)

10、所需嗡趕黃草提取液濃度，計(jì)算出趕黃草提取液蚜中溶質(zhì)質(zhì)量，按公式計(jì)算IC50值。溶透質(zhì)質(zhì)量所需濃度越低，表明半清除率越高針。IC50=50消耗的DPPH質(zhì)量加入的試樣溶液中溶質(zhì)的質(zhì)量3嘍結(jié)果DPPH吸收光譜與測(cè)定波長的確定DPPH在溶液中具有典型紫紅色骶，當(dāng)它與能提供1個(gè)電子的自由基清除劑仕作用時(shí)，生成淺色產(chǎn)物，使溶液的典型紫紅色變淺。測(cè)定DPPH溶液在200箴600nm之間的光譜圖，由圖1可知，嶼DPPH溶液在醇-水體系中其327nm和517nm處吸光度都具有極大值，涕但517nm處的極大值在加入槲皮素后贊降低較顯著，故選用在95%乙醇體系下伽517nm處DPPH含量的變化來進(jìn)行謝測(cè)定。DPP

11、H溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)測(cè)定籜DPPH在95%乙醇中吸光度變化與時(shí)慎間的關(guān)系，結(jié)果顯示DPPH的吸光度在閌40min內(nèi)基本不變。加入樣品后，測(cè)湎定吸光度與時(shí)間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)吸光度隨時(shí)翊間增長呈線性降低，但30min后，吸卵光度的變化已經(jīng)很小。結(jié)果見圖2。為了澤提高測(cè)試準(zhǔn)確度，在加入樣品反應(yīng)20m羹in后，迅速測(cè)定吸光度?？寡趸瘎舛扰c其清除DPPH的關(guān)系抗壞血酸、镅沒食子酸和槲皮素是常見的抗氧化劑6安，配制槲皮素、抗壞血酸、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐級(jí)稀釋使用。按“”方法測(cè)定腥，圖3可見抗氧化劑濃度在一定范圍內(nèi)，灤隨著濃度的增高，清除DPPH自由基的練能力逐漸增大。各抗氧化劑濃度與清除率過之間線性方程分別表示

12、如下，槲皮素：Y寄=6103C+7，R2=9；沒食子蕙酸：Y=1103C+4，R2=0；李抗壞血酸：Y=6103C+4，R2庀=5。可見，在一定范圍里，可以用清除率來表示抗氧化劑SPPH自由基的清除柜能力。從圖3曲線可知，采用清除率極大艟值點(diǎn)或其他特征點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的抗氧化劑含量稟來比較DPPH自由基清除能力的方法比較合理。由于極值點(diǎn)測(cè)定比較困難，誤差洌較大，而自由基清除率在50%時(shí)對(duì)應(yīng)的偈點(diǎn)較容易在曲線上標(biāo)定，因此選定抗氧化劑的自由基半清除率IC50值為測(cè)定指繚標(biāo)。采用該法測(cè)定的槲皮素、抗壞血酸、趁沒食子酸的IC50為，。結(jié)果見圖4豹。不同提取方法清除DPPH自由基蹌的能力按“”，“”，“”不同方

13、法提取，使用相同溶劑得到提取物，逐級(jí)稀釋，按“”方法測(cè)定，結(jié)果見圖5。不同提取方法得到的提取物都具有一定的清除自玫由基的能力，在一定濃度范圍內(nèi)，呈現(xiàn)正熬向變化，但隨著濃度增加到一定值后，清詈除率趨于平緩?；亓魈崛〉玫降奶崛∥锏腎C50為，超聲提取得到的提取物的I態(tài)C50為，溫浸提取得到的提取物的IC踮50為，回流提取得到的提取物的IC5弈0最高。不同溶劑提取物清除DPP譯H自由基的能力按“”回流提取法分別用95%乙醇，水，丙酮提取，逐級(jí)稀釋，湓按“”方法測(cè)定。結(jié)果見圖6。3種溶總劑提取物都具有一定的清除自由基活性的能力，且隨著提取物濃度增加，清除率逐漸增高，但隨著濃度增加到一定值后，清鯊除率趨

14、于平緩。在濃度范圍內(nèi)，趕黃草9簧5%醇提物的IC50為，水提物的IC鍥50為，丙酮提取物的清除能力最弱，I敲C50為。其差異可能是因?yàn)槿軇┑臉O性宰不同，使其對(duì)趕黃草中抗氧化活性物質(zhì)的溶解度不同，所提取的抗氧化物質(zhì)的總量銓和種類也就不同，導(dǎo)致了不同溶劑提取液鐮的清除DPPH自由基能力不同。不楝同極性部分清除DPPH自由基的能力根厲據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇回流提取法，按“”方攴法將提取液萃取為極性不同的4個(gè)部分：詹石油醚部分，醋酸乙酯部分，正丁醇部分酡以及水部分。按方法“”測(cè)定。結(jié)果見圖兌7。從圖7看出，在4個(gè)不同的極性部分中，清除DPPH自由基能力最強(qiáng)的部囂分是醋酸乙酯部分。趕黃草有效成分主要硫是黃酮化

15、合物如槲皮素等存在于該極性部鬩分，表明趕黃草中黃酮化合物具有較強(qiáng)的熳清除自由基的能力。與抗壞血酸的清桃除自由基能力比較抗壞血酸是常用的抗氧化劑，將乙醇提取物按不同濃度用“”項(xiàng)下方法測(cè)定，與相應(yīng)濃度抗壞血酸比較，吡由圖8可知，趕黃草乙醇提取物的清除自儡由基能力在達(dá)到一定濃度后接近抗壞血酸莊用的水平。4結(jié)論回流提取法是最鏟適合提取趕黃草中有效成分的方法，其具有操作簡單，方法穩(wěn)定的特點(diǎn)。趕黃草琰提取物均具有清除DPPH自由基的作用桿，95%乙醇提取物的清除DPPH自由基作用最強(qiáng)，以下依次為水、丙酮提取物嫌。不同方法提取物清除DPPH自由基的蘋結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，趕黃草提取物濃度越大，其清除自

16、由基能力越強(qiáng)。在石油醚、醋酸乙酯、正丁醇和水4個(gè)不飛同極性部分中，清除DPPH自由基能力例最強(qiáng)的部分是在醋酸乙酯萃取部分。趕珈黃草種質(zhì)資源在四川、貴州、湖南都有分閿布，但目前其經(jīng)濟(jì)價(jià)值被開發(fā)利用(藥用奪、保健)的還很少。本研究通過對(duì)趕黃草紐提取物中具有抗氧化作用的活性物質(zhì)對(duì)DPPH自由基的清除能力進(jìn)行了考察，證悱明了趕黃草具有很強(qiáng)的抗氧化作用，這對(duì)姚于趕黃草的綜合利用和進(jìn)一步開發(fā)具有重屈要意義。【參考文獻(xiàn)】1中國赦科學(xué)院植物研究所中國高等植物屬檢索煤表M北京：科學(xué)出版社，1979騁：2052全國中草藥匯編編寫組全國中草藥匯編，下冊(cè)，第2版M垃北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：覡4803張旭，楊明趕黃草有珍效成分研究J成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)趑，XX，25：464Meyd岸aniMBlumbergA.Anti耩oxidantsandagingim遒muneresponseINBen琢dichA，PhillipsM,Te網(wǎng)ngerdyRedsantioxidantsNutri