環(huán)境工程微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) (2)

1、環(huán)境工程微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)環(huán)境工程微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 一、顯微鏡的結(jié)構(gòu)一、顯微鏡的結(jié)構(gòu)顯微鏡顯微鏡機(jī)械部分機(jī)械部分光學(xué)部分光學(xué)部分鏡座、鏡柱、鏡臂、鏡座、鏡柱、鏡臂、鏡筒鏡筒傾斜關(guān)節(jié)、轉(zhuǎn)換器傾斜關(guān)節(jié)、轉(zhuǎn)換器載物臺(tái)載物臺(tái)目鏡、物鏡目鏡、物鏡遮光器遮光器反光鏡反光鏡二二.顯微鏡的使用顯微鏡的使用一、取鏡和安放一、取鏡和安放1 1右手握住鏡臂，左右手握住鏡臂，左手托住鏡座手托住鏡座 2 2把顯微鏡放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，把顯微鏡放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，略偏左（顯微鏡放在距實(shí)驗(yàn)略偏左（顯微鏡放在距實(shí)驗(yàn)臺(tái)邊緣臺(tái)邊緣7 7厘米左右）。安裝厘米左右）。安裝好目鏡和物鏡。好目鏡和物鏡。顯微鏡的使用顯微鏡的使用二、對(duì)光二、對(duì)光3轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，使

2、低倍物轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，使低倍物鏡對(duì)準(zhǔn)通光孔鏡對(duì)準(zhǔn)通光孔(物鏡的前端物鏡的前端與載物臺(tái)要保持與載物臺(tái)要保持5厘米的距厘米的距離離)。顯微鏡的使用顯微鏡的使用顯微鏡的使用顯微鏡的使用三、觀察三、觀察 5 5把所要觀察的玻片把所要觀察的玻片標(biāo)本放在標(biāo)本放在 載物臺(tái)上，用載物臺(tái)上，用壓片夾壓住，標(biāo)本要正壓片夾壓住，標(biāo)本要正對(duì)通光孔的中心。對(duì)通光孔的中心。6 6轉(zhuǎn)動(dòng)粗準(zhǔn)焦螺旋，使轉(zhuǎn)動(dòng)粗準(zhǔn)焦螺旋，使鏡筒緩緩下降，直到物鏡鏡筒緩緩下降，直到物鏡接近玻片標(biāo)本為止（眼接近玻片標(biāo)本為止（眼 睛看著物鏡，以免物鏡碰睛看著物鏡，以免物鏡碰到玻片標(biāo)本）。到玻片標(biāo)本）。7 7向目鏡內(nèi)看，同時(shí)反向目鏡內(nèi)看，同時(shí)反方向轉(zhuǎn)動(dòng)粗準(zhǔn)焦

3、螺旋，使方向轉(zhuǎn)動(dòng)粗準(zhǔn)焦螺旋，使鏡筒緩緩上升，直到看清鏡筒緩緩上升，直到看清物像為止。再略微轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)物像為止。再略微轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋，使看到的物像準(zhǔn)焦螺旋，使看到的物像更加清晰。更加清晰。顯微鏡的使用顯微鏡的使用8、換高倍物鏡：、換高倍物鏡：如果進(jìn)一步使用高倍物鏡觀察，應(yīng)如果進(jìn)一步使用高倍物鏡觀察，應(yīng)在轉(zhuǎn)換高倍物鏡之前，在轉(zhuǎn)換高倍物鏡之前，把物像中需要放大觀察的部分把物像中需要放大觀察的部分移至視野中央移至視野中央（將低倍物鏡轉(zhuǎn)換成高倍物鏡觀察時(shí)，（將低倍物鏡轉(zhuǎn)換成高倍物鏡觀察時(shí)，視野中的物像范圍縮小了很多）。視野中的物像范圍縮小了很多）。如果換高倍物鏡后如果換高倍物鏡后物像不一定很清晰，可以轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)

4、準(zhǔn)焦螺旋進(jìn)行調(diào)節(jié)物像不一定很清晰，可以轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋進(jìn)行調(diào)節(jié)。 在轉(zhuǎn)換高倍物鏡并且看清物像之后，可以根據(jù)需要調(diào)在轉(zhuǎn)換高倍物鏡并且看清物像之后，可以根據(jù)需要調(diào)節(jié)光圈或聚光器，使光線符合要求（一般將低倍物鏡節(jié)光圈或聚光器，使光線符合要求（一般將低倍物鏡換成高倍物鏡觀察時(shí)，視野要稍變暗一些，所以需要換成高倍物鏡觀察時(shí)，視野要稍變暗一些，所以需要調(diào)節(jié)光線強(qiáng)弱）。調(diào)節(jié)光線強(qiáng)弱）。 1.轉(zhuǎn)動(dòng)反光鏡使視野明亮轉(zhuǎn)動(dòng)反光鏡使視野明亮2.在低倍鏡下觀察清楚后，把要在低倍鏡下觀察清楚后，把要放大觀察的物像移至視野中央放大觀察的物像移至視野中央3.轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，換成高倍物鏡轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，換成高倍物鏡4.觀察并用細(xì)準(zhǔn)焦螺旋

5、調(diào)焦觀察并用細(xì)準(zhǔn)焦螺旋調(diào)焦高倍鏡的使用高倍鏡的使用取鏡和安放對(duì)光（選擇低倍鏡、反光鏡、光圈）固定裝片轉(zhuǎn)動(dòng)粗準(zhǔn)焦螺旋，鏡筒緩緩下降（目視物鏡與裝片之間）反向轉(zhuǎn)動(dòng)粗準(zhǔn)焦螺旋，鏡筒上升，直至看到物像移動(dòng)目標(biāo)至視野中央更換高倍物鏡轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋至標(biāo)本影像清晰為止調(diào)節(jié)反光鏡、光圈光學(xué)顯微鏡光學(xué)顯微鏡載物臺(tái)上升載物臺(tái)下降3.使用顯微鏡的注意事項(xiàng)使用顯微鏡的注意事項(xiàng) （1）顯微鏡安放位置，）顯微鏡安放位置， 顯微鏡應(yīng)安放在離桌邊緣顯微鏡應(yīng)安放在離桌邊緣5 cm、鏡筒向前，、鏡筒向前，并講清顯微鏡位置稍靠左側(cè)的道理（兩眼同時(shí)并講清顯微鏡位置稍靠左側(cè)的道理（兩眼同時(shí)睜開觀察，眼不易疲勞，便于繪圖。）睜開觀察，眼

6、不易疲勞，便于繪圖。） （2） 對(duì)光根據(jù)光線的強(qiáng)弱來選擇平面鏡或凹對(duì)光根據(jù)光線的強(qiáng)弱來選擇平面鏡或凹面鏡；用低倍鏡進(jìn)行對(duì)光，把低倍鏡位置放低；面鏡；用低倍鏡進(jìn)行對(duì)光，把低倍鏡位置放低；在轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器時(shí)，物鏡到位，光圈調(diào)節(jié)好，在轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器時(shí)，物鏡到位，光圈調(diào)節(jié)好，視視野光線均勻、明亮野光線均勻、明亮. （3）正確使用高倍物鏡的方法）正確使用高倍物鏡的方法 由于高倍物鏡的工作距離小，鏡頭易損壞，由于高倍物鏡的工作距離小，鏡頭易損壞，,并且把光圈開大。并且把光圈開大。 （4）重視準(zhǔn)焦螺旋的使用）重視準(zhǔn)焦螺旋的使用 在使用高倍物鏡時(shí)，不要調(diào)節(jié)粗準(zhǔn)焦螺旋，在使用高倍物鏡時(shí)，不要調(diào)節(jié)粗準(zhǔn)焦螺旋，避免物鏡損壞

7、、裝片壓爛。避免物鏡損壞、裝片壓爛。 （5）不是倍數(shù)越大，越清晰）不是倍數(shù)越大，越清晰 如果目鏡倍數(shù)過大，得到的放大虛像則很不如果目鏡倍數(shù)過大，得到的放大虛像則很不清晰。在低倍鏡下能看清楚的物像，不必用高清晰。在低倍鏡下能看清楚的物像，不必用高倍鏡觀察。倍鏡觀察。 3.使用顯微鏡的注意事項(xiàng)使用顯微鏡的注意事項(xiàng)視野中物像與標(biāo)本移動(dòng)的關(guān)系：視野中物像與標(biāo)本移動(dòng)的關(guān)系：如視野中某觀察對(duì)象位于左下方如如視野中某觀察對(duì)象位于左下方如何移到中央，應(yīng)將裝片或切片向左何移到中央，應(yīng)將裝片或切片向左下方移動(dòng)（下方移動(dòng)（同向移動(dòng)同向移動(dòng)）。原因是視）。原因是視野中物像移動(dòng)的方向或切片移動(dòng)的野中物像移動(dòng)的方向或切片

8、移動(dòng)的方向相反方向相反 使用高倍鏡觀察的步驟和要點(diǎn)是：使用高倍鏡觀察的步驟和要點(diǎn)是：（1）首先用低倍鏡觀察，找到要觀察的物）首先用低倍鏡觀察，找到要觀察的物像，移到視野的中央。像，移到視野的中央。 （2）轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，用高倍鏡觀察，并輕輕）轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，用高倍鏡觀察，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋，直到看清楚材料為止。轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋，直到看清楚材料為止。高倍顯微鏡的使用高倍顯微鏡的使用 （1）是低倍鏡還是高倍鏡的視野大，視野明亮？為什么？）是低倍鏡還是高倍鏡的視野大，視野明亮？為什么？低倍鏡的視野大，通過的光多，放大的倍數(shù)?。坏捅剁R的視野大，通過的光多，放大的倍數(shù)?。桓弑剁R的視野小，通過的光少，但放大的倍數(shù)

9、高。高倍鏡的視野小，通過的光少，但放大的倍數(shù)高。 （2）為什么要先用低倍鏡觀察清楚后，把要放大觀察的）為什么要先用低倍鏡觀察清楚后，把要放大觀察的物像移至視野的中央，再換高倍鏡觀察物像移至視野的中央，再換高倍鏡觀察? 如果直接用高倍鏡觀察，往往由于觀察的對(duì)象不在如果直接用高倍鏡觀察，往往由于觀察的對(duì)象不在視野范圍內(nèi)而找不到。視野范圍內(nèi)而找不到。 因此，需要先用低倍鏡觀察清楚，并把要放大觀察因此，需要先用低倍鏡觀察清楚，并把要放大觀察的物像移至視野的中央，再換高倍鏡觀察。的物像移至視野的中央，再換高倍鏡觀察。 （3）用轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)過高倍鏡后，轉(zhuǎn)動(dòng)粗準(zhǔn)焦螺旋行不行？）用轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)過高倍鏡后，轉(zhuǎn)動(dòng)粗準(zhǔn)焦螺

10、旋行不行？不行。用高倍鏡觀察，只需微調(diào)即可。不行。用高倍鏡觀察，只需微調(diào)即可。轉(zhuǎn)動(dòng)粗準(zhǔn)焦螺旋，容易壓壞玻片。轉(zhuǎn)動(dòng)粗準(zhǔn)焦螺旋，容易壓壞玻片。 污點(diǎn)判斷：污點(diǎn)判斷：玻片移，污點(diǎn)移，則污點(diǎn)在玻片上；玻片移，污點(diǎn)移，則污點(diǎn)在玻片上；物鏡換，污點(diǎn)移，則污點(diǎn)在物鏡上；物鏡換，污點(diǎn)移，則污點(diǎn)在物鏡上；目鏡轉(zhuǎn)，污點(diǎn)移，則污點(diǎn)在目鏡上目鏡轉(zhuǎn)，污點(diǎn)移，則污點(diǎn)在目鏡上 目鏡目鏡5X、物鏡、物鏡4X、視野中央有一排、視野中央有一排細(xì)胞共細(xì)胞共15個(gè)。若把物鏡換成個(gè)。若把物鏡換成10X，則，則細(xì)胞數(shù)目為（細(xì)胞數(shù)目為（ ）個(gè)。）個(gè)。因?yàn)橐曇爸械囊驗(yàn)橐曇爸械募?xì)胞數(shù)目與放大倍數(shù)成反比細(xì)胞數(shù)目與放大倍數(shù)成反比；若目鏡；若目鏡5

11、X，物鏡，物鏡4X，視野中共有，視野中共有50個(gè)細(xì)胞，個(gè)細(xì)胞，再把物鏡換成再把物鏡換成10X，則視野中有（，則視野中有（ ）個(gè)細(xì)胞。個(gè)細(xì)胞。因?yàn)橐曇爸锌吹降膶?shí)物的范因?yàn)橐曇爸锌吹降膶?shí)物的范圍與放大倍數(shù)的平方成反比圍與放大倍數(shù)的平方成反比。練習(xí)：練習(xí)：洋蔥鱗葉表皮細(xì)胞(1010)洋蔥鱗葉表皮細(xì)胞(1040)洋蔥鱗葉表皮細(xì)胞(1040)洋蔥鱗葉表皮細(xì)胞裝片（10 40）細(xì)胞壁細(xì)胞壁細(xì)胞核細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞質(zhì)(液泡液泡)微生物細(xì)胞的計(jì)數(shù)微生物細(xì)胞的計(jì)數(shù)目的要求目的要求 1.1.了解血球計(jì)數(shù)板的結(jié)構(gòu)及計(jì)數(shù)了解血球計(jì)數(shù)板的結(jié)構(gòu)及計(jì)數(shù)原理。原理。 2 2、掌握使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行微、掌握使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生

12、物計(jì)數(shù)的方法。生物計(jì)數(shù)的方法。 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 測(cè)定微生物數(shù)量方法很多，通常采用的有顯測(cè)定微生物數(shù)量方法很多，通常采用的有顯微鏡直接計(jì)數(shù)法、平板計(jì)數(shù)法和光電比濁計(jì)數(shù)法。微鏡直接計(jì)數(shù)法、平板計(jì)數(shù)法和光電比濁計(jì)數(shù)法。 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法顯微鏡直接計(jì)數(shù)法 將小量待測(cè)樣品的懸浮液置于一種特別的具將小量待測(cè)樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上，又稱血球計(jì)數(shù)板，有確定面積和容積的載玻片上，又稱血球計(jì)數(shù)板，于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種簡(jiǎn)便、快速、直觀的于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種簡(jiǎn)便、快速、直觀的方法。方法。血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造血球計(jì)數(shù)板的計(jì)算方法血球計(jì)數(shù)板的計(jì)算方法 血球計(jì)數(shù)板上刻有

13、一長(zhǎng)寬各為血球計(jì)數(shù)板上刻有一長(zhǎng)寬各為1 1毫米的方形大格，其毫米的方形大格，其體積為體積為0.1mm0.1mm3 3。計(jì)數(shù)板有兩種刻度，一種是每大格分為。計(jì)數(shù)板有兩種刻度，一種是每大格分為1616個(gè)中格，而每中格又分個(gè)中格，而每中格又分2525個(gè)小格，每大格為個(gè)小格，每大格為16162525小格小格=400=400小格，而另一種，則是每大格分為小格，而另一種，則是每大格分為2525個(gè)中格，而每中個(gè)中格，而每中格又分為格又分為1616個(gè)小格，則每大格為個(gè)小格，則每大格為252516=40016=400小格（計(jì)數(shù)板小格（計(jì)數(shù)板上的標(biāo)識(shí)為上的標(biāo)識(shí)為XBXBK25K25） 計(jì)數(shù)時(shí)，如果使用計(jì)數(shù)時(shí)，如果

14、使用16格格25格規(guī)格的計(jì)數(shù)室，要按對(duì)格規(guī)格的計(jì)數(shù)室，要按對(duì)角線位，取左上、右上、左下、右下角線位，取左上、右上、左下、右下4個(gè)中格（即個(gè)中格（即100個(gè)個(gè)小格）的酵母菌數(shù)。如果使用小格）的酵母菌數(shù)。如果使用25 格格 16格規(guī)格的計(jì)數(shù)室格規(guī)格的計(jì)數(shù)室除了取其除了取其4個(gè)對(duì)角方位外，還需再數(shù)中央的一個(gè)中格個(gè)對(duì)角方位外，還需再數(shù)中央的一個(gè)中格(即即80個(gè)小方格個(gè)小方格)的酵母菌數(shù)。的酵母菌數(shù)。(6)當(dāng)遇到位于大格線上的酵母菌，一般只計(jì)數(shù)大方格的當(dāng)遇到位于大格線上的酵母菌，一般只計(jì)數(shù)大方格的上方和左方線上的酵母細(xì)胞上方和左方線上的酵母細(xì)胞(或只計(jì)數(shù)下方和右方線上的或只計(jì)數(shù)下方和右方線上的酵母細(xì)胞酵

15、母細(xì)胞)。計(jì)數(shù)公式計(jì)數(shù)公式 (1)1625的血球計(jì)數(shù)板計(jì)算公式：的血球計(jì)數(shù)板計(jì)算公式： 酵母細(xì)胞數(shù)酵母細(xì)胞數(shù)ml=（100小格內(nèi)酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)小格內(nèi)酵母細(xì)胞個(gè)數(shù) 100）40010000稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù) (2)25x16的血球計(jì)數(shù)板計(jì)算公式：的血球計(jì)數(shù)板計(jì)算公式： 酵母細(xì)胞數(shù)酵母細(xì)胞數(shù)ml=（80小格內(nèi)酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)小格內(nèi)酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)80）40010000稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)實(shí)驗(yàn)器材實(shí)驗(yàn)器材 顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、酵母菌液、蓋玻顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、酵母菌液、蓋玻片、吸管、吸水紙。片、吸管、吸水紙。操作步驟操作步驟1. 鏡檢計(jì)數(shù)室鏡檢計(jì)數(shù)室 對(duì)計(jì)數(shù)板進(jìn)行鏡檢。若有污物，對(duì)計(jì)數(shù)板進(jìn)行鏡檢。若有污物，則用自來

16、水沖洗，用電吹風(fēng)吹干后則用自來水沖洗，用電吹風(fēng)吹干后 才能才能 進(jìn)行計(jì)數(shù)。進(jìn)行計(jì)數(shù)。2. 加樣品加樣品 在血球計(jì)數(shù)板上蓋上蓋玻片在血球計(jì)數(shù)板上蓋上蓋玻片, , 用滴用滴管將搖勻的酵母菌液由蓋玻片邊的小槽滴一小滴管將搖勻的酵母菌液由蓋玻片邊的小槽滴一小滴, ,菌液菌液會(huì)自動(dòng)進(jìn)入計(jì)數(shù)室，靜置會(huì)自動(dòng)進(jìn)入計(jì)數(shù)室，靜置5 5分鐘。分鐘。3. 計(jì)數(shù)計(jì)數(shù) 將血球計(jì)數(shù)板置于載物臺(tái)上，先用低倍將血球計(jì)數(shù)板置于載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室的位置，再換高倍鏡計(jì)數(shù)。鏡找到計(jì)數(shù)室的位置，再換高倍鏡計(jì)數(shù)。 25個(gè)中格個(gè)中格的的取計(jì)數(shù)板四角和中間位置的五個(gè)中方格計(jì)菌數(shù)。重取計(jì)數(shù)板四角和中間位置的五個(gè)中方格計(jì)菌數(shù)。重復(fù)計(jì)復(fù)

17、計(jì)2-32-3次，取其平均值，按公式計(jì)算每毫升酵母菌液次，取其平均值，按公式計(jì)算每毫升酵母菌液中菌體的個(gè)數(shù)。中菌體的個(gè)數(shù)。4.清洗血球計(jì)數(shù)板清洗血球計(jì)數(shù)板 計(jì)數(shù)后將血球計(jì)數(shù)板用自來水計(jì)數(shù)后將血球計(jì)數(shù)板用自來水沖洗干凈，勿用硬物刷，吹干后鏡檢。若不干凈，則沖洗干凈，勿用硬物刷，吹干后鏡檢。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌干凈為止。必須重復(fù)洗滌干凈為止。結(jié)果記錄結(jié)果記錄 第一個(gè)第一個(gè)中格中格第二個(gè)第二個(gè)中格中格第三個(gè)第三個(gè)中格中格第四個(gè)第四個(gè)中格中格第五個(gè)第五個(gè)中格中格第一次第一次測(cè)測(cè) 定定第二次第二次測(cè)測(cè) 定定第三次第三次測(cè)測(cè) 定定平平 均均思考題思考題 1.1.使用血球計(jì)數(shù)板應(yīng)注意什么問題使用血球計(jì)數(shù)

18、板應(yīng)注意什么問題? ? 2. 2.試分析影響本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差來源并提出試分析影響本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差來源并提出改進(jìn)措施改進(jìn)措施實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二 培養(yǎng)基的配制和滅菌培養(yǎng)基的配制和滅菌 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?1.熟悉玻璃器皿的洗滌和滅菌前的準(zhǔn)備。熟悉玻璃器皿的洗滌和滅菌前的準(zhǔn)備。 2.掌握培養(yǎng)基和無菌水的制備方法。掌握培養(yǎng)基和無菌水的制備方法。 3.掌握高壓蒸氣滅菌技術(shù)。掌握高壓蒸氣滅菌技術(shù)。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 培養(yǎng)基是用人工的辦法將多種營(yíng)養(yǎng)物培養(yǎng)基是用人工的辦法將多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)按微生物生長(zhǎng)代謝的需要配制成的一種質(zhì)按微生物生長(zhǎng)代謝的需要配制成的一種營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。培養(yǎng)基中均應(yīng)含有滿足微生物營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。培養(yǎng)基中均應(yīng)含有滿足

19、微生物生長(zhǎng)發(fā)育且比例合適的水分、碳源、氮源、生長(zhǎng)發(fā)育且比例合適的水分、碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長(zhǎng)因素以及某些特需的微量元無機(jī)鹽、生長(zhǎng)因素以及某些特需的微量元素素外外還應(yīng)具有適宜的酸堿度還應(yīng)具有適宜的酸堿度pH值值、緩、緩沖能力、氧化還原電位和滲透壓。沖能力、氧化還原電位和滲透壓。 實(shí)驗(yàn)器材實(shí)驗(yàn)器材(1)藥品和試劑：牛肉膏、蛋白陳、藥品和試劑：牛肉膏、蛋白陳、NaCl、10NaOH溶液、溶液、l0鹽酸溶液、瓊脂、水鹽酸溶液、瓊脂、水(2)器材：小燒杯、小鋁鍋、天平、牛角匙、器材：小燒杯、小鋁鍋、天平、牛角匙、1000mL刻度燒杯、玻棒、玻璃珠、刻度燒杯、玻棒、玻璃珠、pH試紙、試紙、試管、分裝漏斗

20、、棉花。試管、分裝漏斗、棉花。高壓蒸氣滅菌鍋、高壓蒸氣滅菌鍋、烘箱。烘箱。實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 一、玻璃器皿的洗滌和包裝一、玻璃器皿的洗滌和包裝 清洗并烘干玻璃器皿：如培養(yǎng)皿、移液管、試管等。清洗并烘干玻璃器皿：如培養(yǎng)皿、移液管、試管等。 棉塞的制作棉塞的制作 包裝培養(yǎng)皿和移液管等包裝培養(yǎng)皿和移液管等。 2-1棉塞制作方法2-2移液管滅菌前的包裝二、培養(yǎng)基的配制二、培養(yǎng)基的配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制 （一）（一）培養(yǎng)基配方：培養(yǎng)基配方： 牛肉膏牛肉膏2.5g 蛋白胨蛋白胨5.0g、NaCl2.5g、瓊脂、瓊脂10.0g、自來水、自來水500mL、pH7.27.4。 （二）

21、（二）操作步驟：操作步驟： 1. 取一個(gè)取一個(gè)1000mL燒杯，裝燒杯，裝500mL蒸餾水。蒸餾水。 2. 按配方逐一正確稱取各種成分，依次加入水中溶按配方逐一正確稱取各種成分，依次加入水中溶解。解。注意：注意：a. 前一種成分溶解之后，才能加入下一種成分前一種成分溶解之后，才能加入下一種成分 b. 蛋白胨、肉膏可加熱促進(jìn)溶解蛋白胨、肉膏可加熱促進(jìn)溶解 c. 加熱過程應(yīng)不斷攪拌，以免糊底燒焦，并適當(dāng)補(bǔ)充加熱過程應(yīng)不斷攪拌，以免糊底燒焦，并適當(dāng)補(bǔ)充因蒸發(fā)而損失的水量。因蒸發(fā)而損失的水量。 3. 調(diào)調(diào)pH值值：用：用10 NaOH調(diào)調(diào)pH至至7.27.4，用精密，用精密pH試紙對(duì)試紙對(duì)照。照。 4

22、.過濾過濾 液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基可用液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁層紗布趁熱過濾，以利結(jié)果的觀察。但是供一般使用的培養(yǎng)基，該步可熱過濾，以利結(jié)果的觀察。但是供一般使用的培養(yǎng)基，該步可省略。省略。 5. 分裝分裝：將培養(yǎng)基分裝于：將培養(yǎng)基分裝于5支試管，其余全部倒入支試管，其余全部倒入250mL錐形錐形瓶中，分別塞上棉塞。瓶中，分別塞上棉塞。分裝時(shí)可用漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口分裝時(shí)可用漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上面造成污染或瓶口上面造成污染(見圖見圖23)。分裝量：固體培養(yǎng)基約為試。分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的管高度的15，滅菌后制成斜面（圖，滅菌后制成斜

23、面（圖24）。分裝入錐形瓶?jī)?nèi)）。分裝入錐形瓶?jī)?nèi)以不超過其容積的以不超過其容積的3/53/5為宜。半固體培養(yǎng)基以試管高度的為宜。半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/3為為宜滅菌后垂直待凝。宜滅菌后垂直待凝。注意不要污染棉塞和瓶口注意不要污染棉塞和瓶口。 6. 包扎成捆包扎成捆，掛上標(biāo)簽，注明何種培養(yǎng)基。，掛上標(biāo)簽，注明何種培養(yǎng)基。 7. 滅菌備用滅菌備用：滅菌條件：滅菌條件：1210C（相當(dāng)蒸汽壓力（相當(dāng)蒸汽壓力0.103MPa）培）培養(yǎng)基滅菌后必須在養(yǎng)基滅菌后必須在37下恒溫培養(yǎng)下恒溫培養(yǎng)24h，確定無菌生長(zhǎng)，方可，確定無菌生長(zhǎng)，方可使用。使用。圖 例圖23培養(yǎng)基分裝 圖24 斜面制作 三、稀釋水的制

24、備三、稀釋水的制備 1.取一個(gè)取一個(gè)250mL的錐形瓶裝的錐形瓶裝90(或或99)mL蒸蒸餾水，放餾水，放30顆玻璃珠顆玻璃珠(用于打破活性污泥、用于打破活性污泥、菌塊或土壤顆粒菌塊或土壤顆粒)于錐形瓶?jī)?nèi)，塞棉塞、包于錐形瓶?jī)?nèi)，塞棉塞、包扎，待滅菌。扎，待滅菌。 2.另取另取5支支18mm180mm的試管，分別裝的試管，分別裝9mL蒸餾水，塞棉塞、包扎，待滅菌。蒸餾水，塞棉塞、包扎，待滅菌。 無菌稀釋水為微生物分離實(shí)驗(yàn)中所需要的材料。無菌稀釋水為微生物分離實(shí)驗(yàn)中所需要的材料。 四、滅菌四、滅菌 加熱滅菌有加熱滅菌有干熱滅菌和濕熱滅菌干熱滅菌和濕熱滅菌。 干熱滅菌法：電熱烘箱作為干熱滅菌器干熱滅

25、菌法：電熱烘箱作為干熱滅菌器 干熱滅菌的操作方法干熱滅菌的操作方法 a. 將待滅菌的物品放入恒溫箱，將溫度調(diào)將待滅菌的物品放入恒溫箱，將溫度調(diào)節(jié)至節(jié)至160并維持并維持2h； b. 把恒溫箱的調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)回零處，待溫度把恒溫箱的調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)回零處，待溫度降到降到50左右，才能將物品取出。左右，才能將物品取出。濕熱滅菌：高壓蒸氣滅菌法濕熱滅菌：高壓蒸氣滅菌法 高壓蒸氣滅菌法的操作步驟如下：高壓蒸氣滅菌法的操作步驟如下： 1. 滅菌鍋內(nèi)加入一定量的水。滅菌鍋內(nèi)加入一定量的水。 2. 將待滅菌的物品放入鍋內(nèi)，并關(guān)嚴(yán)鍋蓋。將待滅菌的物品放入鍋內(nèi)，并關(guān)嚴(yán)鍋蓋。 注意：器物不能裝得太滿。注意：器物不能裝得太滿

26、。 3. 接通電源，進(jìn)行加熱。接通電源，進(jìn)行加熱。 4. 排除高壓鍋內(nèi)的冷空氣，可將排氣閥打開，待排除高壓鍋內(nèi)的冷空氣，可將排氣閥打開，待溫度計(jì)指示溫度為溫度計(jì)指示溫度為100時(shí)關(guān)閉排氣閥；或當(dāng)排時(shí)關(guān)閉排氣閥；或當(dāng)排出的蒸氣相當(dāng)猛烈且微帶藍(lán)色時(shí)關(guān)閉排氣閥。出的蒸氣相當(dāng)猛烈且微帶藍(lán)色時(shí)關(guān)閉排氣閥。 5. 當(dāng)壓力達(dá)當(dāng)壓力達(dá)1.05kg/cm2(滅菌器內(nèi)的溫度為滅菌器內(nèi)的溫度為121)即開始滅菌即開始滅菌，使其維持，使其維持1530min。對(duì)。對(duì)熱不穩(wěn)定的培養(yǎng)基如含有葡萄糖、氨基酸等物熱不穩(wěn)定的培養(yǎng)基如含有葡萄糖、氨基酸等物質(zhì)時(shí)，應(yīng)適當(dāng)降低壓力質(zhì)時(shí)，應(yīng)適當(dāng)降低壓力(0.56kg/cm2) ，延長(zhǎng)時(shí)，

27、延長(zhǎng)時(shí)間。間。 6. 滅菌時(shí)間一到，切斷電源，滅菌時(shí)間一到，切斷電源，待壓力降至零時(shí)待壓力降至零時(shí)，才能打開排氣閥，然后打開滅菌器蓋，取出物才能打開排氣閥，然后打開滅菌器蓋，取出物品，排出鍋內(nèi)剩余水。品，排出鍋內(nèi)剩余水。 7. 待培養(yǎng)基冷卻后置于待培養(yǎng)基冷卻后置于37恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，若無菌生長(zhǎng)則放入冰箱或陰涼處保存?zhèn)溆谩Ｈ魺o菌生長(zhǎng)則放入冰箱或陰涼處保存?zhèn)溆?。間歇滅菌法：間歇滅菌法： 即常壓滅菌，用于一些受高溫而破壞的培養(yǎng)基的滅即常壓滅菌，用于一些受高溫而破壞的培養(yǎng)基的滅菌。菌。 操作方法：操作方法： a. 待滅菌的物品放在滅菌器或蒸籠里，每天蒸煮待滅菌的物品放在滅菌器或蒸籠里，

28、每天蒸煮1次，每次在次，每次在100煮沸煮沸3060min，連續(xù)，連續(xù)3d重復(fù)進(jìn)重復(fù)進(jìn)行。行。 b. 在每?jī)纱握糁笾g，將物品（指培養(yǎng)基）放在在每?jī)纱握糁笾g，將物品（指培養(yǎng)基）放在37恒溫條件下培養(yǎng)恒溫條件下培養(yǎng)24h，這樣可以使每次蒸煮后，這樣可以使每次蒸煮后未殺死殘留的芽孢萌發(fā)成營(yíng)養(yǎng)體，以便下次蒸煮時(shí)未殺死殘留的芽孢萌發(fā)成營(yíng)養(yǎng)體，以便下次蒸煮時(shí)殺滅。殺滅。 c. 第三次蒸煮之后基本無菌，但為了確保無菌仍要第三次蒸煮之后基本無菌，但為了確保無菌仍要放在放在 37恒溫條件下培養(yǎng)恒溫條件下培養(yǎng)24h，確定無菌才能使用。，確定無菌才能使用。 過濾除菌法：過濾除菌法：不能用加熱滅菌的液體物質(zhì)（如維

29、生素、血清），一般可用不能用加熱滅菌的液體物質(zhì)（如維生素、血清），一般可用細(xì)菌過濾器進(jìn)行除菌。細(xì)菌過濾器進(jìn)行除菌。用于除菌的濾器：a.蔡氏濾器，b.注射器裝置濾器思考題思考題 1.配制培養(yǎng)基有哪幾個(gè)步驟配制培養(yǎng)基有哪幾個(gè)步驟?在操作過程中應(yīng)注意在操作過程中應(yīng)注意些什么問題些什么問題?為什么為什么? 2.培養(yǎng)基配制完成后，為什么必須立即滅菌培養(yǎng)基配制完成后，為什么必須立即滅菌?若不若不能及時(shí)滅菌應(yīng)如何處理？已滅菌的培能及時(shí)滅菌應(yīng)如何處理？已滅菌的培 養(yǎng)基進(jìn)行無菌檢查？養(yǎng)基進(jìn)行無菌檢查？ 3.3.高壓蒸汽滅菌中為什么要把冷空氣排凈，為什么高壓蒸汽滅菌中為什么要把冷空氣排凈，為什么在滅菌后不能驟然快

30、速降壓，并要再放盡鍋內(nèi)蒸在滅菌后不能驟然快速降壓，并要再放盡鍋內(nèi)蒸汽才能打開鍋蓋汽才能打開鍋蓋? 細(xì)細(xì)菌純種分離、培養(yǎng)和接菌純種分離、培養(yǎng)和接種技術(shù)種技術(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?1.掌握從環(huán)境（土壤、水體、活性污泥、垃掌握從環(huán)境（土壤、水體、活性污泥、垃圾、堆肥等）中分離培養(yǎng)細(xì)菌的方法，從圾、堆肥等）中分離培養(yǎng)細(xì)菌的方法，從而獲得若干種細(xì)菌純培養(yǎng)技能。而獲得若干種細(xì)菌純培養(yǎng)技能。 2.掌握幾種接種技術(shù)。掌握幾種接種技術(shù)。實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 器器 材材 無菌培養(yǎng)皿無菌培養(yǎng)皿(直徑直徑90mm)10套、無菌移套、無菌移液管液管1mL2支、支、10mL1支。支。 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基1瓶，活性污泥或土壤或

31、瓶，活性污泥或土壤或湖水湖水1瓶，無菌稀釋水瓶，無菌稀釋水90mL1瓶、瓶、9mL5管。管。 其它：接種環(huán)、酒精燈、恒溫箱。其它：接種環(huán)、酒精燈、恒溫箱。實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 步步 驟驟一、細(xì)菌的純種分離一、細(xì)菌的純種分離 (一一)稀釋平板法稀釋平板法 1. 取樣取樣 用無菌錐形瓶到現(xiàn)場(chǎng)取一定量的湖水，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。用無菌錐形瓶到現(xiàn)場(chǎng)取一定量的湖水，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。 2. 稀釋水樣稀釋水樣 將將1瓶瓶90mL和和5管管9mL無菌水排列好，用記號(hào)筆依次編上無菌水排列好，用記號(hào)筆依次編上101、 102、103、104、105、106。在無菌操作條。在無菌操作條件下，用件下，用10mL的無菌移液管吸取的無

32、菌移液管吸取10mL水樣水樣(或其它樣品或其它樣品)加入編號(hào)為加入編號(hào)為101無菌水無菌水(內(nèi)含玻璃珠內(nèi)含玻璃珠)中，將移液管吹洗三中，將移液管吹洗三次，用手搖次，用手搖10min將顆粒狀樣品打散。即為將顆粒狀樣品打散。即為101濃度的菌濃度的菌液。用液。用1mL無菌移液管吸取無菌移液管吸取1mL 101濃度的菌液于編號(hào)濃度的菌液于編號(hào)為為102無菌水中，將移液管吹洗三次，搖勻即為無菌水中，將移液管吹洗三次，搖勻即為102濃濃度菌液。同樣方法，依次稀釋到度菌液。同樣方法，依次稀釋到106 。稀釋液的制備稀釋液的制備10mL試樣 90mL蒸餾水 3. 平板的制作平板的制作 取取10套無菌培養(yǎng)皿編

33、號(hào)，套無菌培養(yǎng)皿編號(hào)， 104、105、106各各3個(gè)，另一個(gè)個(gè)，另一個(gè)為空氣對(duì)照。為空氣對(duì)照。 取取1支支1mL無菌移液管從無菌移液管從濃度小的菌液濃度小的菌液開始，以開始，以106、105、104為序分別吸取為序分別吸取0.5mL菌液于相應(yīng)編號(hào)的培養(yǎng)皿內(nèi)菌液于相應(yīng)編號(hào)的培養(yǎng)皿內(nèi)(每次吸取每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混勻前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混勻)。 加熱培養(yǎng)基，當(dāng)其冷至加熱培養(yǎng)基，當(dāng)其冷至45左左右時(shí)，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形右時(shí)，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手拿培養(yǎng)皿，以中指、無瓶，左手拿培養(yǎng)皿，以中指、無名指和小指托住皿底，拇指和食名指和小指托住皿底，拇指和食指

34、夾住皿蓋，靠近火焰，將皿蓋指夾住皿蓋，靠近火焰，將皿蓋掀開，倒入培養(yǎng)基后將培養(yǎng)皿平掀開，倒入培養(yǎng)基后將培養(yǎng)皿平放在桌上，順時(shí)針和逆時(shí)針來回放在桌上，順時(shí)針和逆時(shí)針來回轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基和菌液充轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基和菌液充分混勻，冷凝后即成平板，倒置分混勻，冷凝后即成平板，倒置于于30培養(yǎng)培養(yǎng)2448h，然后觀察，然后觀察結(jié)果。結(jié)果。 a:皿法皿法 b:倒平板倒平板 取對(duì)照無菌培養(yǎng)皿，倒平板待凝固后，打開皿取對(duì)照無菌培養(yǎng)皿，倒平板待凝固后，打開皿蓋蓋10min后蓋上，倒置于后蓋上，倒置于30培養(yǎng)培養(yǎng)2448h，然，然后觀察結(jié)果。后觀察結(jié)果。（二）平板劃線法（二）平板劃線法 1. 平板制作：平板

35、制作：將融化并冷至約將融化并冷至約50的肉膏蛋白的肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，使凝固成平胨瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，使凝固成平板。板。 2. 劃線：劃線：用接種環(huán)挑取一環(huán)樣品，左手拿培養(yǎng)用接種環(huán)挑取一環(huán)樣品，左手拿培養(yǎng)皿，中指、無名指和小指托住皿底，拇指和食皿，中指、無名指和小指托住皿底，拇指和食指夾住皿蓋，將培養(yǎng)皿稍傾斜，左手拇指和食指夾住皿蓋，將培養(yǎng)皿稍傾斜，左手拇指和食指將皿蓋掀半開，右手將接種環(huán)伸入培養(yǎng)皿內(nèi)，指將皿蓋掀半開，右手將接種環(huán)伸入培養(yǎng)皿內(nèi)，在平板上輕輕劃線在平板上輕輕劃線(切勿劃破培養(yǎng)基切勿劃破培養(yǎng)基)。劃線完畢。劃線完畢蓋好皿蓋，蓋好皿蓋，30培養(yǎng)培養(yǎng)2448h

36、后觀察結(jié)果。后觀察結(jié)果。平板劃線分離的劃線方法 左：連續(xù)劃線法（1，2依次劃線的起點(diǎn)）右：分區(qū)劃線法（1，2，3，4依次劃線的起點(diǎn)）二、二、細(xì)菌的接種技術(shù)細(xì)菌的接種技術(shù) 接種方法：常用的有接種方法：常用的有斜面接種法、平板接種法、液體接種法、斜面接種法、平板接種法、液體接種法、試管深層固體培養(yǎng)基的穿刺接種法。試管深層固體培養(yǎng)基的穿刺接種法。 接種工具：常用的有接種針、接種環(huán)、接種鉤、接種圈、接接種工具：常用的有接種針、接種環(huán)、接種鉤、接種圈、接種鏟或接種鋤、玻璃涂棒等。種鏟或接種鋤、玻璃涂棒等。（一）斜面接種法（一）斜面接種法 左手平托兩支試管，拇指壓住兩支試左手平托兩支試管，拇指壓住兩支試管

37、。外側(cè)是菌種試管，內(nèi)側(cè)是待接種的空管。外側(cè)是菌種試管，內(nèi)側(cè)是待接種的空白斜面白斜面(兩支試管的斜面同時(shí)向上兩支試管的斜面同時(shí)向上) 。右手。右手將棉塞旋松，以便在接種時(shí)容易拔出。將棉塞旋松，以便在接種時(shí)容易拔出。 右手拿接種環(huán)，在火焰上先將右手拿接種環(huán)，在火焰上先將環(huán)端環(huán)端燒燒紅滅菌，然后紅滅菌，然后將有可能伸入試管的其余部將有可能伸入試管的其余部位位也過火滅菌。也過火滅菌。 將兩支試管的上端并齊，靠近火焰，將兩支試管的上端并齊，靠近火焰，用右手小指、無名指和手掌將兩支試管的用右手小指、無名指和手掌將兩支試管的棉塞一并夾住拔出，棉塞一并夾住拔出，棉塞仍?shī)A在手中棉塞仍?shī)A在手中，然，然后讓試管口緩

38、緩過火焰。后讓試管口緩緩過火焰。123 將已灼燒過的接種環(huán)伸入菌種試管內(nèi)。將已灼燒過的接種環(huán)伸入菌種試管內(nèi)。先冷卻先冷卻，而，而后再用環(huán)挑取少許菌種，將接種環(huán)抽出并迅速伸入后再用環(huán)挑取少許菌種，將接種環(huán)抽出并迅速伸入待接種試管底部，在斜面上待接種試管底部，在斜面上由底部向上劃線由底部向上劃線。抽出。抽出接種環(huán)，塞上棉塞將試管插在試管架上，最后再次接種環(huán)，塞上棉塞將試管插在試管架上，最后再次燒紅接種環(huán)，則接種完畢。燒紅接種環(huán)，則接種完畢。45678（二）液體接種和穿刺接種（二）液體接種和穿刺接種1.液體接種法液體接種法(從斜面菌種接入培養(yǎng)液從斜面菌種接入培養(yǎng)液)：用：用接種環(huán)接種環(huán)挑取斜面菌挑取

39、斜面菌種送入培養(yǎng)液中，使環(huán)在液體表面與管壁接觸輕輕研磨，將種送入培養(yǎng)液中，使環(huán)在液體表面與管壁接觸輕輕研磨，將環(huán)上的菌種全部洗入培養(yǎng)液中，取出接種環(huán)塞上棉塞。將試環(huán)上的菌種全部洗入培養(yǎng)液中，取出接種環(huán)塞上棉塞。將試管輕輕撞擊手掌使菌體在培養(yǎng)液中均勻分布。最后將接種環(huán)管輕輕撞擊手掌使菌體在培養(yǎng)液中均勻分布。最后將接種環(huán)燒紅滅菌。燒紅滅菌。2.穿刺接種法穿刺接種法(從斜面菌種接入從斜面菌種接入(半半)固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基)：用：用接種針接種針經(jīng)火經(jīng)火焰滅菌后，挑取少量菌種，垂直地穿入試管固體培養(yǎng)基中心焰滅菌后，挑取少量菌種，垂直地穿入試管固體培養(yǎng)基中心至底部，然后穿刺線緩慢將針抽出，塞上棉塞。燒紅

40、接種針至底部，然后穿刺線緩慢將針抽出，塞上棉塞。燒紅接種針滅菌，則接種完畢。滅菌，則接種完畢。（三）稀釋平板涂布法（三）稀釋平板涂布法1.稀釋樣品：方法同稀釋平板分離法稀釋樣品：方法同稀釋平板分離法2.倒平板：將融化并冷至倒平板：將融化并冷至50左右的培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，左右的培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，冷凝后即成平板冷凝后即成平板3.用無菌移液管吸取一定量的經(jīng)適當(dāng)稀釋的標(biāo)志樣品液于平板用無菌移液管吸取一定量的經(jīng)適當(dāng)稀釋的標(biāo)志樣品液于平板上，換上無菌玻璃刮刀在平板上旋轉(zhuǎn)涂布均勻上，換上無菌玻璃刮刀在平板上旋轉(zhuǎn)涂布均勻4.將培養(yǎng)皿正擺在恒溫箱中，調(diào)節(jié)一定溫度進(jìn)行培養(yǎng)。如果培將培養(yǎng)皿正擺在恒溫箱中

41、，調(diào)節(jié)一定溫度進(jìn)行培養(yǎng)。如果培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，次日把培養(yǎng)皿倒置繼續(xù)培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出菌落。養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，次日把培養(yǎng)皿倒置繼續(xù)培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出菌落。（四）液體培養(yǎng)基中的菌種接入液體培養(yǎng)基（四）液體培養(yǎng)基中的菌種接入液體培養(yǎng)基 接種工具：無菌移液管和無菌滴管接種工具：無菌移液管和無菌滴管 移液管和滴管不能在火焰上燒，應(yīng)預(yù)先滅菌移液管和滴管不能在火焰上燒，應(yīng)預(yù)先滅菌 用無菌移液管自菌種管中吸取一定量的菌液接用無菌移液管自菌種管中吸取一定量的菌液接 到另一管液體培養(yǎng)基中，將試管塞好棉塞即可。到另一管液體培養(yǎng)基中，將試管塞好棉塞即可。思考題 1. 斜面接種取菌前為什么要將灼燒過的接種斜面接種取菌前為什么要將灼燒過的

42、接種針在無菌培養(yǎng)基上沾一下？針在無菌培養(yǎng)基上沾一下？ 2.2.用一根無菌移液管接種幾種濃度的水樣時(shí)，用一根無菌移液管接種幾種濃度的水樣時(shí)，應(yīng)從哪個(gè)濃度開始？為什么？應(yīng)從哪個(gè)濃度開始？為什么？實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康娜旧砣旧砣旧椒ㄈ旧椒▽?shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)四實(shí)驗(yàn)四 革蘭氏染色法革蘭氏染色法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?shí)驗(yàn)?zāi)康?1. 學(xué)習(xí)微生物涂片，染色原理和染色的基本操作技術(shù)，從而掌握微生物的一般染色法和革蘭氏染色法。 2. 鞏固顯微鏡（油鏡）的使用方法和無菌操作技術(shù)。二、染色原理二、染色原理 由于微生物細(xì)胞含有大量水分，對(duì)光線的吸收和反射與水

43、溶液的差別不大,機(jī)體是無色透明的，與周圍背景沒有明顯的反差,在普通光學(xué)顯微鏡下不易識(shí)別，必須對(duì)它們進(jìn)行染色，使經(jīng)染色后的菌體與背景形成明顯的色差菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。 微生物細(xì)胞是由蛋白質(zhì)、核酸等兩性電解質(zhì)及其他化合物組成。所以，微生物細(xì)胞表現(xiàn)出兩性電解質(zhì)的性質(zhì)。兩性電解質(zhì)兼有堿性基和酸性基，在酸性溶液中離解出堿性基呈堿性帶正電。在堿性溶液中離解出酸性基呈酸性帶負(fù)電。 經(jīng)測(cè)定，細(xì)菌等電點(diǎn)pH在2-5之間，故在中性、堿性或偏酸性溶液中，細(xì)菌的等電點(diǎn)均低于上述溶液的pH值，所以細(xì)菌帶負(fù)電荷，容易與帶正電荷的堿性染料結(jié)合，故用堿性染料染色的較多。微生物體內(nèi)各結(jié)構(gòu)

44、與染料結(jié)合力不同，故可用各種染料分別染微生物的各結(jié)構(gòu)以便觀察。 三、染色方法三、染色方法(一一)簡(jiǎn)單染色法簡(jiǎn)單染色法 簡(jiǎn)單染色法又叫作普通染色法，只用一種染料使細(xì)菌染上顏色，如果僅為了在顯微鏡下看清細(xì)菌的形態(tài)，用簡(jiǎn)單染色即可。(二二)復(fù)染色法復(fù)染色法 用兩種或多種染料染細(xì)菌，目的是為了鑒別不同性質(zhì)的細(xì)菌，所以又叫鑒別染色法。主要的復(fù)染色法有革革蘭氏染色法和抗酸性染色法。蘭氏染色法和抗酸性染色法。 革蘭氏染色法：不僅能觀察到細(xì)菌的形態(tài)，而且還可將所有細(xì)菌區(qū)分為兩大類：染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色的稱為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，用G+表示；染色反應(yīng)呈紅色（復(fù)染顏色）的稱為革蘭氏陰性細(xì)菌革蘭氏陰性細(xì)菌，用G

45、-表示。細(xì)菌對(duì)革蘭氏染色的不同反應(yīng)，是由于它們細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。四、實(shí)驗(yàn)材料四、實(shí)驗(yàn)材料1. 顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙、接種環(huán)、載玻片、酒精燈等。2. 石炭酸復(fù)紅染液、草酸銨結(jié)晶紫染液、碘液、95乙醇、番紅（沙黃）染液3. 菌種：表皮球菌、變形桿菌五、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟五、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟(一一)細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色步驟細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色步驟 涂片干燥固定染色水洗干燥鏡檢1涂片涂片 取干凈的載玻片于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，在載玻片的中央滴一滴無菌蒸餾水，將接種環(huán)在火焰上燒紅，待冷卻后從斜面挑取少量菌種(表皮球菌或變形桿菌)與玻片上的水滴混勻后，在載玻片上涂布成一均勻的薄層，涂布

46、面不宜過大涂布面不宜過大。2干燥 涂片最好在室溫下使其自然干燥，有時(shí)為了使之干得更快些，可將標(biāo)本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時(shí)間切勿緊靠火焰或加熱時(shí)間過長(zhǎng)，以防標(biāo)本烤枯而變形。過長(zhǎng)，以防標(biāo)本烤枯而變形。 3 3固定固定 固定常常利用高溫，手持載玻片的一端，標(biāo)本向上，在酒精燈火焰外層盡快的來回通過23次，共約23秒鐘，并不時(shí)以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超不覺過燙為宜（不超過過60）,放置待冷后，放置待冷后，進(jìn)行染色。4 4染色染色 在涂片薄膜上滴加染色液(石炭酸復(fù)紅、草酸銨結(jié)晶紫或美藍(lán)任選一種)一滴，使染色液覆蓋涂片，

47、染色約1min。5 5水洗水洗 斜置載玻片，在自來水龍頭下用小股水流沖洗，直至洗下的水呈無色為止。洗下的水呈無色為止。6 6干燥干燥 用吸水紙吸去涂片邊緣的水珠，置于室溫下自然干燥。用吸水紙時(shí)切勿將菌體擦掉。切勿將菌體擦掉。 7鏡檢 用顯微鏡觀察，并用鉛筆繪出細(xì)菌形態(tài)圖。(二二)細(xì)菌的革蘭氏染色步驟細(xì)菌的革蘭氏染色步驟 涂片干燥固定初染水洗媒染水洗脫色水洗復(fù)染水洗干燥觀察1取表皮球菌和變形桿菌(均以無菌操作)分別在同一張載玻片上做涂片、干燥、固定涂片、干燥、固定，方法均與簡(jiǎn)單染色的相同。2用草酸銨結(jié)晶紫草酸銨結(jié)晶紫染色1min后水洗。3加碘液碘液媒染1min后水洗。4斜置載玻片，滴加95乙醇乙醇脫色，至流出的乙醇不現(xiàn)紫色 為止，大約需時(shí)2030s，隨即水洗，隨即水洗。5用沙黃沙黃染液復(fù)染1min，水洗。6用吸水紙吸掉水滴，待標(biāo)本片干后置顯微鏡下，用低倍鏡觀察，發(fā)現(xiàn)目的物后用油鏡觀察，注意細(xì)菌細(xì)胞的顏色。繪出細(xì)菌的形態(tài)圖并說明革蘭氏染色的結(jié)果革蘭氏染色的結(jié)果。六、注意事項(xiàng)六、注意事項(xiàng)1革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是脫色