生化實驗設(shè)計自制

1、生化實驗設(shè)計自制u案例：u 患兒，男性，3歲，因面色蒼白伴血尿1天入院。1天前食用新鮮蠶豆后，今日出現(xiàn)惡心、嘔吐、排尿呈醬油樣色，面色蒼白。據(jù)家長反映，患者的姐姐也曾發(fā)生過類似情況。 u臨床表現(xiàn)：u 體格檢查為體溫38，脈搏150次/分，呼吸40次/分，血壓80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色蒼白，皮膚及鞏膜黃染，體型較同齡人瘦小。心、肺未及異常，肝、脾未觸及，雙腎區(qū)無叩擊痛，神經(jīng)系統(tǒng)檢查未及異常。實驗室檢查：紅細胞 1.981012/L，血紅蛋白53g/L，血清總膽紅素85.5mol/L，結(jié)合膽紅素13.7mol/L，未結(jié)合膽紅素71.8mol/L，尿蛋白+，潛血(+)，尿膽紅素(

2、)，尿膽素原(+)，尿液鏡下未見紅細胞。u1.根據(jù)上述患兒的臨床表現(xiàn)和實驗室檢查，初步判斷患兒是何種疾??？u2.請設(shè)計實驗進一步明確診斷。u要求：實驗名稱，實驗方法，主要試劑和儀器，實驗操作流程及本卷須知，結(jié)果如何分析。u3. 從生化代謝解釋患兒的臨床表現(xiàn)和實驗室檢查結(jié)果。u4. 要想探討該病發(fā)生的分子根底，可以用哪些技術(shù)檢測什么目的基因?u5. 患者體型瘦小與該病癥是否有關(guān)，為什么？1.根據(jù)上述患兒的臨床表現(xiàn)和實驗室檢查，初步判斷患兒是何種疾病？答：根據(jù)上述患兒的臨床表現(xiàn)和實驗室檢查，初步判斷患兒患 急性溶血貧血癥蠶豆病 。蠶豆病的病癥：在生吃蠶豆后數(shù)小時至數(shù)日1-3日內(nèi)突然發(fā)熱、頭暈、煩躁

3、、惡心，尿呈醬油樣或葡萄酒色，一般發(fā)作26天后能自行恢復(fù)，但假設(shè)重者不及時搶救，會因循環(huán)衰竭危及生命。與上述患兒的臨床表現(xiàn)大致相同，所以初步判定該病為蠶豆病。蠶豆病簡介uG6PD缺乏癥俗稱蠶豆病，是遺傳性葡萄糖-6-磷酸脫氫酶G6PD缺乏癥是最常見的一種遺傳性酶缺乏病。u發(fā)生機制：有遺傳缺陷的敏感紅細胞，因G6PD的缺陷不能提供足夠的NADPH以維持復(fù)原型谷胱甘肽GSH的復(fù)原性抗氧化作用，在遇到蠶豆種某種因子后更誘發(fā)了紅細胞膜被氧化，產(chǎn)生溶血反響。G-6-PD有保護正常紅細胞免遭氧化破壞的作用，新鮮蠶豆是很強的氧化劑，當(dāng)G-6-PD缺乏時那么紅細胞被破壞而致病。 u根據(jù)蠶豆病的診斷原理本組設(shè)計

4、的實驗檢查高鐵血紅蛋白復(fù)原試驗來進一步明確診斷實驗名稱 高鐵血紅蛋白復(fù)原法u實驗原理：u正常血紅蛋白是亞鐵血紅蛋白，可被亞硝酸氧化為高鐵血紅蛋白。當(dāng)紅細胞內(nèi)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶含量正常時，通過戊糖循環(huán)形成的復(fù)原型輔酶可作為血液中高鐵血紅復(fù)原酶的輔酶，并在遞氫體美藍的參與下，使形成的高鐵血紅蛋白復(fù)原為亞鐵血紅蛋白。當(dāng)紅細胞內(nèi)缺少葡萄糖-6-磷酸脫氫酶時，那么高鐵血紅蛋白不能被復(fù)原。高鐵血紅蛋白為灰暗色，在630650nm波長處吸光度最高，故可加以測定。 u實驗方法：u本試驗用亞硝酸鈉使HbFe+氧化為HbFe+暗棕色以美藍的遞氫作用加強磷酸戊糖旁路的糖代謝。如果紅細胞內(nèi)G-6PD含量正常，那么

5、有足量NADPH產(chǎn)生，它作為高鐵血紅蛋白復(fù)原酶的輔酶，在美藍遞氫體參與下使HbFe+很快復(fù)原成HbFe+。GSSG復(fù)原成GSH：如果紅細胞缺乏G-6PD那么NADPH生成減少，HbFe+復(fù)原成HbFe+也減少，本試驗即以高鐵血紅蛋白復(fù)原率來反映NADPH生成狀況而間接測知G-6PD是否缺乏。u主要試劑:u1/mL亞硝酸葡萄糖溶液 取亞硝酸納，葡萄糖5g，蒸餾水加至100ml。u2/L美藍溶液 取美藍，蒸餾水加至100ml。u3/L磷酸鹽緩沖溶u 稱取磷酸氫二鈉Na2HPO412H2O51mg，磷酸二氫鉀，加蒸餾水至100ml。 u主要儀器：u可見分光光度計 離心機 恒溫水浴箱 移液器 小試管u

6、實驗操作流程 ： u1靜脈取血，加于含有3.8%檸檬酸鈉抗凝劑的小試管內(nèi)，血液和抗凝劑按9:1混合，加葡萄糖20mg。u2將此標(biāo)本離心沉淀5min 1000 r/min或放置4冰箱過夜，待紅細胞下沉后吸去局部血漿，使紅細胞與血漿比列約為1:1相當(dāng)紅細胞比容35%40%。u3搖勻后取此血液1ml，加亞硝酸鈉-葡萄糖溶液和美藍溶液各，顛倒混合15次，使與空氣中的氧氣充分接觸，加塞，置于37水浴或保溫箱3h。 u4取出后搖勻，吸取此液，加于磷酸鹽緩沖液10ml中，2min后于波長634nm處比色，測其吸光度為S。u5吸取未加上述試劑但同樣保溫的血液，加于磷酸鹽緩沖液10ml中，2min后按上法進行比

7、色，測其吸光度為B，再于此液內(nèi)加亞硝酸鈉-葡萄糖溶液1滴，搖勻，5min后同樣方法測其吸光度為St。u本卷須知：u1受檢者紅細胞比容對結(jié)果有一定影響，比容低于30%時，高鐵血紅蛋白復(fù)原率可明顯降低故貧血患者應(yīng)先調(diào)整紅細胞比容后再測定。u2抗凝劑以38g / L檸檬酸或輸血時用的抗凝劑ACD為好，血液標(biāo)本可保存1周左右。肝素抗凝劑可用每毫升血液用肝素，但標(biāo)本只能保存3天。草酸鹽抗凝不適于本法。u3ACD抗凝劑不宜太多，血液與ACD抗凝劑按混合即可，否那么可因PH降低，而使高鐵血紅蛋白復(fù)原速度減慢，以致出現(xiàn)假陽性。u計算：u高鐵血紅蛋白復(fù)原百分率=1SB)/( StB) 100u結(jié)果判定：u正常人

8、高鐵血紅蛋白復(fù)原百分率為75%以上，31%74%為中間數(shù)值雜合子，30%以下為顯著缺陷。u假設(shè)是該患者高鐵血紅蛋白復(fù)原百分率應(yīng)在30%以下那么可說明其紅細胞內(nèi)缺乏葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，再結(jié)合其他附屬實驗臨床診斷可判定該患者患有蠶豆病。u意義：u在臨床上，通過葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的測定，對于研究藥物試驗引起的溶血性貧血具有診斷價值。根據(jù)不同敏感人體內(nèi)紅細胞中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性水平的變化情況，可分為：1藥物引起的變化；2非藥物引起的變化；3蠶豆病以及其他疾病引起的變化。u對于那些可能接觸過敏感藥劑的人員，特別是那些使用抗瘧疾藥的人，業(yè)已推薦葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性缺陷作為一種鑒別指標(biāo)

9、。甚至當(dāng)輸血后因溶血作用而使紅細胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷，這是由于輸血者的血液中可能隱藏了潛在的溶血因素。6-磷酸葡萄糖G-6-PD6-磷酸葡萄糖酸酯NADP+NADPH(復(fù)原型輔酶)谷胱甘肽復(fù)原酶2G-SH抗氧化活性5-磷酸核糖多步反響氧化型GS-SG尿三膽尿膽素+、尿膽紅素()、尿膽素原(+)肝腸循環(huán)增多膽紅素單核吞噬系統(tǒng)降解血紅素紅細胞破裂血紅蛋白滲出尿蛋白(+)(1.0g/l)運氧功能障礙溶血性貧血循環(huán)血量減少血壓下降脈搏加快(心率加快)呼吸加快過多34.2umol/L時，黃疸血清總膽紅素 結(jié)合膽紅素變化不大水溶性大，隨尿排出未結(jié)合膽紅素水溶性小，不能隨尿排出，有毒醬油尿 4. 要

10、想探討該病發(fā)生的分子根底，可以用哪些技要想探討該病發(fā)生的分子根底，可以用哪些技術(shù)檢測什么目的基因？術(shù)檢測什么目的基因？ 蠶豆病的患者紅細胞葡萄糖蠶豆病的患者紅細胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶磷酸脫氫酶G6PD有遺傳缺陷有遺傳缺陷 ，故需要檢測能指導(dǎo)合成葡萄糖，故需要檢測能指導(dǎo)合成葡萄糖-6-磷磷酸脫氫酶的基因酸脫氫酶的基因uDNA芯片uPCR技術(shù)uDNA探針技術(shù) u熒光斑點法uDNA印記技術(shù)u凝膠電泳u酵母雙雜交系統(tǒng)uDNA測序u目的基因：G6PD基因位于人類基因組的X染色體的長臂28帶Xq28片段5.體型體型瘦小與該疾病是否有關(guān)，為什么？核酸DNA,RNA受影響蛋白質(zhì)合成與表達受限營養(yǎng)不良某些肽類激素如甲狀腺激素，生長激素NADPH脂肪酸合成瘦弱吞噬細胞的免疫作用體弱多病15-磷酸核糖有一定關(guān)系2其他因素營養(yǎng)攝入缺乏，不均衡父母遺傳缺乏運動u所以，本組成員認為：所以，本組成員認為：u 兩者是有關(guān)的，患者由于兩者是有