儀器分析高效液相色譜課件

1、高效液相色譜法高效液相色譜法 High Performance Liquid Chromatography第一節(jié)、概述第一節(jié)、概述 一、含義一、含義 液相色譜液相色譜 (LC) ：以溶劑液體為流動以溶劑液體為流動相的色譜方法相的色譜方法 高效液相色譜（高效液相色譜（HPLC）：）： 高效能固體細微粒為固定相高效能固體細微粒為固定相 高壓溶劑為流動相高壓溶劑為流動相 高靈敏度檢測器高靈敏度檢測器二、高效液相色譜與其它色譜方法的比較二、高效液相色譜與其它色譜方法的比較1. HPLC與經(jīng)典與經(jīng)典LC的比較的比較經(jīng)典經(jīng)典LCHPLC固定相顆粒固定相顆粒100m, ,不均勻不均勻 固定相顆粒固定相顆粒B

2、C正、反相色譜中極性和保留時間的關系正、反相色譜中極性和保留時間的關系HPLC方法方法按流動相和固定相特征分為按流動相和固定相特征分為 正相色譜、反相色譜正相色譜、反相色譜按分離目的分為按分離目的分為 分析型、制備型分析型、制備型按分離機理分為按分離機理分為 吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、空間排阻色譜等?？臻g排阻色譜等。第三節(jié)第三節(jié) HPLC方法及原理方法及原理 一、液一、液-液分配色譜法（液分配色譜法（LLPC）二、化學鍵合相色譜法（二、化學鍵合相色譜法（CBPC）三、液三、液-固吸附色譜法固吸附色譜法(LSAC)四、離子交換色譜法（四、離子交換色譜法（

3、IEC）五、離子對色譜法（五、離子對色譜法（IPC）六、六、尺寸排阻色譜法（尺寸排阻色譜法（SEC）七、親和色譜法（七、親和色譜法（AC） 一、液一、液-液分配色譜法（液分配色譜法（LLPC） 1.固定相固定相強極性強極性固定液：固定液：，一氧二丙睛一氧二丙睛中等極性中等極性固定液：聚乙二醇固定液：聚乙二醇非極性非極性固定液：角鯊烷固定液：角鯊烷 要求：要求：流動相不與固定相互溶，流動相不與固定相互溶，流動相與固定相極流動相與固定相極性差別顯著性差別顯著避免固定液流失避免固定液流失 2.流動相流動相 一、液一、液-液分配色譜法（液分配色譜法（LLPC）適于各種極性化合物的分離適于各種極性化合物

4、的分離 4. 用途用途 根據(jù)物質在兩種互不相溶的液體中溶解度的不根據(jù)物質在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。同，具有不同的分配系數(shù)。 3.分離原理分離原理缺點：固定液機械涂漬、缺點：固定液機械涂漬、固定液易流失固定液易流失1、反相鍵合相色譜法（、反相鍵合相色譜法（RPBPC）p 固定相：固定相： 采用極性較小的鍵合固定相，如硅膠采用極性較小的鍵合固定相，如硅膠-C18H37（ODS，C18）、硅膠）、硅膠-苯基等苯基等二、化學鍵合相色譜法（二、化學鍵合相色譜法（CBPC）p流動相：流動相： 采用極性較強的溶劑，如甲醇、乙睛采用極性較強的溶劑，如甲醇、乙睛-水、水和水、水和無

5、機鹽的緩沖溶液等。無機鹽的緩沖溶液等。 分離機理分離機理疏溶劑作用理論疏溶劑作用理論非極性的烷基鍵合相非極性的烷基鍵合相硅膠表面的硅膠表面的十八烷十八烷基基“分子毛分子毛”較強的疏水特性。較強的疏水特性。二、化學鍵合相色譜法（二、化學鍵合相色譜法（CBPC）1、反相鍵合相色譜法（、反相鍵合相色譜法（RPBPC）分子中非極性部分分子中非極性部分疏水烷基疏水烷基 締合作用，分子保留締合作用，分子保留分子極性部分分子極性部分極性流動相極性流動相 離開固定相，減小保留離開固定相，減小保留兩種作用力之差，決定分子在色譜中的保留行為兩種作用力之差，決定分子在色譜中的保留行為流動相流動相極性溶劑極性溶劑分離

6、物分離物極性官能團有機極性官能團有機物物改變流動相配比可分離極性化合物改變流動相配比可分離極性化合物用水和無機鹽的緩沖液為流動相可分離易離解的用水和無機鹽的緩沖液為流動相可分離易離解的樣品有機酸、有機堿等。樣品有機酸、有機堿等。 用途用途 1、反相鍵合相色譜法（、反相鍵合相色譜法（RPBPC） 主要用于分離非極性至中等極性的各類有機化合物主要用于分離非極性至中等極性的各類有機化合物二、化學鍵合相色譜法（二、化學鍵合相色譜法（CBPC）p固定相：固定相：極性的有機基團，極性的有機基團，CN、NH2。雙羥基等雙羥基等鍵合在硅膠表面鍵合在硅膠表面p流動相：流動相：非極性或極性小的溶劑（如正已烷）中非

7、極性或極性小的溶劑（如正已烷）中加入適量極性溶劑（如氯仿、醇等）加入適量極性溶劑（如氯仿、醇等） p分離機理：分離機理：范德華力、誘導力或氫鍵力范德華力、誘導力或氫鍵力p用途：用途：多用于分離極性或中等極性化合物多用于分離極性或中等極性化合物2、正相鍵合相色譜法（、正相鍵合相色譜法（NPBPC）二、化學鍵合相色譜法（二、化學鍵合相色譜法（CBPC）3、離子鍵合相色譜法離子鍵合相色譜法 固定相：固定相：硅膠為基質，鍵合各種離子交換基團，如硅膠為基質，鍵合各種離子交換基團，如一一SO3H、一、一CH2NH2、C00H流動相：流動相：一般采用緩沖溶液。一般采用緩沖溶液。二、化學鍵合相色譜法（二、化學

8、鍵合相色譜法（CBPC）分離原理：分離原理：與離子交換色譜類同與離子交換色譜類同用途：用途：多用于分離離子形化合物如酸、無機陰陽離多用于分離離子形化合物如酸、無機陰陽離子、氨基酸等子、氨基酸等分離原理分離原理：物質在固定相上的吸附作用不同物質在固定相上的吸附作用不同三、液三、液-固吸附色譜法固吸附色譜法(LSAC)固定相固定相：吸附活性強弱不等的吸附劑吸附活性強弱不等的吸附劑 硅膠、氧化鋁、聚酸膠等硅膠、氧化鋁、聚酸膠等。流動相：流動相：各種極性的洗脫劑各種極性的洗脫劑用途：用途：非極性溶劑中、具有中等相對分子質量且為非非極性溶劑中、具有中等相對分子質量且為非離子型的試樣。離子型的試樣。 特別

9、適用于分離異構體特別適用于分離異構體原理：原理：不同不同待測離子待測離子對固定相對固定相親和力的差別親和力的差別固定相：固定相：基質：合成樹脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠基質：合成樹脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠表面鍵合離子：陽離子和陰離子交換樹脂表面鍵合離子：陽離子和陰離子交換樹脂四、離子交換色譜法（四、離子交換色譜法（IEC）流動相：流動相：一定一定pH和鹽濃度的緩沖溶液和鹽濃度的緩沖溶液用途：用途：適用無機離子、有機離子混合物的分離例如適用無機離子、有機離子混合物的分離例如氨基酸、核酸、蛋白質等生物大分子。氨基酸、核酸、蛋白質等生物大分子。 有機相有機相水相水相水相水相BABA 離子對離子對

10、AB具有疏水性，被非極性固定相提取具有疏水性，被非極性固定相提取 不同待測離子不同待測離子A1，A2與與B離子間成對能力不同，形離子間成對能力不同，形成不同疏水性離子對，從而保留值不同成不同疏水性離子對，從而保留值不同原理：原理：將與待測物離子將與待測物離子A電荷相反的離子電荷相反的離子B加入到流加入到流動相中形成離子對動相中形成離子對AB，間接改變待測離子保留特性，間接改變待測離子保留特性五、離子對色譜法（五、離子對色譜法（IPC）如：固定相為非極性鍵合相，流動相為水溶液如：固定相為非極性鍵合相，流動相為水溶液用途：用途：主要用來分離強極性有機酸和有機堿主要用來分離強極性有機酸和有機堿固定相

11、：固定相： 化學惰性的多孔性材料，如聚苯乙烯凝膠、化學惰性的多孔性材料，如聚苯乙烯凝膠、親水凝膠、無機多孔材料。親水凝膠、無機多孔材料。 流動相：流動相： 作用不是為了控制分離，而是為了溶解樣作用不是為了控制分離，而是為了溶解樣品或減小流動相粘度。品或減小流動相粘度。 六、尺寸排阻色譜法（六、尺寸排阻色譜法（SEC）常用流動相常用流動相四氫呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水四氫呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水原理：原理：利用被測組分分子大小不同、在固定相上選擇利用被測組分分子大小不同、在固定相上選擇性滲透實現(xiàn)分離。性滲透實現(xiàn)分離。凝膠過濾色譜：凝膠過濾色譜： 以水或緩沖液作流動相以水或緩沖液作流

12、動相主要適合于水溶性高分子的分離主要適合于水溶性高分子的分離凝膠滲透色譜：凝膠滲透色譜： 以有機溶劑作流動相以有機溶劑作流動相主要適合于脂溶性高分子的分離主要適合于脂溶性高分子的分離用途用途六、尺寸排阻色譜法（六、尺寸排阻色譜法（SEC）特點：特點：固定相與分子間作用力趨于零，柱壽命長固定相與分子間作用力趨于零，柱壽命長相對分子質量差別必須大于相對分子質量差別必須大于10才能分離才能分離七、親和色譜法（七、親和色譜法（AC） 原理：原理：利用生物大分子和固定相表面存在生利用生物大分子和固定相表面存在生化特異性親和力，進行選擇性分離化特異性親和力，進行選擇性分離固定相：固定相：生物專一性配基生物

13、專一性配基+載體載體流動相：流動相：一定一定pH的緩沖液的緩沖液具有親和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保具有親和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保留；沒有親和力作用的分子不被保留。留；沒有親和力作用的分子不被保留。用途：用途： 蛋白、酶、抗體分離，生物和醫(yī)藥分析蛋白、酶、抗體分離，生物和醫(yī)藥分析第四節(jié)第四節(jié) HPLC分離條件的選擇分離條件的選擇kk114nR ;CuuBAH 根據(jù)根據(jù)van Deemter方程和色譜分離方程式選擇分析條件方程和色譜分離方程式選擇分析條件 在高效液相色譜中在高效液相色譜中, 速率方程中的分子擴散項速率方程中的分子擴散項B/U較小，可以忽略不計，而只有兩項，即

14、：較小，可以忽略不計，而只有兩項，即： H = A + C u（1）固定相：）固定相：粒度小，均勻，以減小渦流擴散和流動粒度小，均勻，以減小渦流擴散和流動相傳質阻力；相傳質阻力；改進結構，采用大孔徑和淺孔道的表面改進結構，采用大孔徑和淺孔道的表面多孔型載體或全多孔微粒型載體，減少多孔型載體或全多孔微粒型載體，減少滯留流動相傳質阻力。滯留流動相傳質阻力。第四節(jié)第四節(jié) HPLC分離條件的選擇分離條件的選擇kknRCuAH114 ;（2）流動相：）流動相：低粘度的流動相低粘度的流動相增大組分增大組分 在溶劑中的擴散在溶劑中的擴散系數(shù)系數(shù)Dm減少傳質阻力減少傳質阻力（3）流速：）流速：最佳流速在流速很

15、小處，減小流速有利提高柱效最佳流速在流速很小處，減小流速有利提高柱效常采用比最佳流速高數(shù)倍的流速常采用比最佳流速高數(shù)倍的流速加快分析速度加快分析速度第四節(jié)第四節(jié) HPLC分離條件的選擇分離條件的選擇kknRCuAH114 ;（4）柱溫：）柱溫：提高柱溫提高柱溫降低流動相粘度降低流動相粘度減少減少傳質阻力傳質阻力分辨率降低，柱壽命短，分辨率降低，柱壽命短，易產(chǎn)生氣泡，易產(chǎn)生氣泡，一般在室溫下進行一般在室溫下進行第四節(jié)第四節(jié) HPLC分離條件的選擇分離條件的選擇kknRCuAH114 ;第五節(jié)第五節(jié) HPLC的建立與應用的建立與應用一、建立一、建立HPLC分析方法的一般步驟分析方法的一般步驟 1、

16、根據(jù)被分析樣品的特性選擇適用于、根據(jù)被分析樣品的特性選擇適用于樣品分析的一種樣品分析的一種HPLC分離方式。分離方式。p材料來源、濃度范圍材料來源、濃度范圍p組分特性、結構、分子量、溶解性等組分特性、結構、分子量、溶解性等一、建立一、建立HPLC分析方法的一般步驟分析方法的一般步驟 一、建立一、建立HPLC分析方法的一般步驟分析方法的一般步驟 2、選擇、選擇合適的分析方法合適的分析方法p適用的色譜柱：適用的色譜柱：柱的規(guī)格（柱內(nèi)徑及柱的規(guī)格（柱內(nèi)徑及柱長）和選用固定相（粒徑及孔徑）柱長）和選用固定相（粒徑及孔徑）p流動相流動相p檢測器檢測器p樣品預處理樣品預處理一、建立一、建立HPLC分析方法

17、的一般步驟分析方法的一般步驟 3.分析條件的優(yōu)化分析條件的優(yōu)化p流動相種類與配比流動相種類與配比p梯度梯度p溫度溫度p流速流速p檢測波長檢測波長p進樣量進樣量一、建立一、建立HPLC分析方法的一般步驟分析方法的一般步驟 4、由獲得的色譜圖進行定性分析和定、由獲得的色譜圖進行定性分析和定量分析。量分析。二、二、HPLC定性定量分析方法定性定量分析方法1 1、定性分析、定性分析色譜鑒定法：色譜鑒定法：保留時間對照保留時間對照化學鑒定法：化學鑒定法：利用專屬化學反應對分離利用專屬化學反應對分離 后收集的組分定性后收集的組分定性色譜色譜-光譜聯(lián)用定性光譜聯(lián)用定性 非在線色譜光譜聯(lián)用法：非在線色譜光譜聯(lián)

18、用法： 色譜光譜聯(lián)用儀色譜光譜聯(lián)用儀二、二、HPLC定性定量分析方法定性定量分析方法2 2、定量分析、定量分析外標法：外標法：外標工作曲線法、外標一點法、外標工作曲線法、外標一點法、外標二點法等外標二點法等 不需知道校正因子，但需進樣量準確不需知道校正因子，但需進樣量準確內(nèi)標法：內(nèi)標法：內(nèi)標工作曲線法、內(nèi)標一點法、內(nèi)標工作曲線法、內(nèi)標一點法、內(nèi)標二點法、內(nèi)標對比法內(nèi)標二點法、內(nèi)標對比法1、在食品分析中的應用、在食品分析中的應用p食品營養(yǎng)成分分析：食品營養(yǎng)成分分析：蛋白質、氨基酸、糖類、蛋白質、氨基酸、糖類、色素、維生素、香料、礦物質等；色素、維生素、香料、礦物質等；p食品添加劑分析：食品添加劑

19、分析：甜味劑、防腐劑、著色劑、甜味劑、防腐劑、著色劑、抗氧化劑等；抗氧化劑等；p食品污染物分析：食品污染物分析：霉菌毒素、微量元素、多霉菌毒素、微量元素、多環(huán)芳烴等。環(huán)芳烴等。 2、在環(huán)境分析中的應用、在環(huán)境分析中的應用 多環(huán)芳烴、農(nóng)藥（如氨基甲酸脂類）殘留等。多環(huán)芳烴、農(nóng)藥（如氨基甲酸脂類）殘留等。三、三、HPLC的應用的應用3、在生命科學中的應用、在生命科學中的應用 分子水平上研究生命科學、遺傳工程、臨分子水平上研究生命科學、遺傳工程、臨床化學、分子生物學等必不可少的工具床化學、分子生物學等必不可少的工具p低分子量物質：氨基酸、有機酸、有機胺、低分子量物質：氨基酸、有機酸、有機胺、類固醇、

20、卟啉、糖類、維生素等分離和測定類固醇、卟啉、糖類、維生素等分離和測定p高分子量物質：多肽、核糖核酸、蛋白質和高分子量物質：多肽、核糖核酸、蛋白質和酶的純化、分離和測定酶的純化、分離和測定三、三、HPLC的應用的應用4、在醫(yī)學檢驗中的應用、在醫(yī)學檢驗中的應用 體液中代謝物測定；藥代動力學研究；臨體液中代謝物測定；藥代動力學研究；臨床藥物監(jiān)測：床藥物監(jiān)測：p合成藥物：抗生素、抗憂郁藥、黃胺類藥等合成藥物：抗生素、抗憂郁藥、黃胺類藥等p天然藥物：生物堿（吲哚堿、強心甙）等天然藥物：生物堿（吲哚堿、強心甙）等5、在無機分析中的應用、在無機分析中的應用 陽、陰離子的分析等。陽、陰離子的分析等。三、三、H

21、PLC的應用的應用我國藥典收載我國藥典收載HPLC法項目和數(shù)量比較表法項目和數(shù)量比較表項目項目數(shù)數(shù) 量量1985版版1990版版1995版版2000版版2010版版鑒別鑒別934150檢查檢查1240160含量含量測定測定7601173871385色譜柱類型色譜柱類型 品種數(shù)品種數(shù)C18柱柱1210個個C8柱柱93個個氰基柱氰基柱21個個硅膠柱硅膠柱31個個苯基柱苯基柱9個個色譜柱類型色譜柱類型品種數(shù)品種數(shù)氨基柱氨基柱5個個丁基柱丁基柱3個個三甲基硅烷三甲基硅烷柱柱2個個二羥基丙基硅烷鍵合二羥基丙基硅烷鍵合硅膠硅膠柱柱1個個苯乙烯苯乙烯-二乙烯基二乙烯基柱柱1個個20102010版藥典二部中色

22、譜柱的使用情況版藥典二部中色譜柱的使用情況纈沙坦纈沙坦a-酸性糖蛋白柱酸性糖蛋白柱鹽酸帕羅西汀鹽酸帕羅西汀瑞格列奈瑞格列奈手性色譜柱手性色譜柱1酸性蛋白柱酸性蛋白柱瑞格列奈片瑞格列奈片苯磺酸順阿曲庫銨苯磺酸順阿曲庫銨手性色譜柱手性色譜柱chiralcel OD-RH注射用苯磺酸順阿曲庫銨注射用苯磺酸順阿曲庫銨甲氨蝶呤甲氨蝶呤牛血清白蛋白鍵合硅膠柱牛血清白蛋白鍵合硅膠柱甲氨蝶呤片甲氨蝶呤片注射用甲氨蝶呤注射用甲氨蝶呤第六節(jié)毛細管電泳法第六節(jié)毛細管電泳法Capillary Electrophoresis一、含義一、含義電泳：電泳：在電場作用下，電解質溶液中的在電場作用下，電解質溶液中的帶電質點向電

23、荷相反的電極方向遷移的帶電質點向電荷相反的電極方向遷移的過程。過程。毛細管電泳：毛細管電泳：在毛細管中進行的電泳。在毛細管中進行的電泳。電泳電泳：帶電粒子在電場作用下遷移：帶電粒子在電場作用下遷移電滲：電滲：溶劑在電場作用下的單向流動正溶質離子所受的力：電場力正溶質離子所受的力：電場力 + + 電滲力電滲力負溶質離子所受的力：電場力負溶質離子所受的力：電場力 電滲力電滲力中性分子所受的力：電滲力中性分子所受的力：電滲力二、基本原理二、基本原理 電滲流速度是電泳流速度的電滲流速度是電泳流速度的5-7倍，混合物倍，混合物中所有的組份隨電滲流朝一個方向遷移。中所有的組份隨電滲流朝一個方向遷移。 流出

24、順序：流出順序：正離子正離子中性粒子中性粒子負離子負離子q（CZE）三、分類三、分類1 1、毛細管區(qū)帶電泳、毛細管區(qū)帶電泳 CZE帶電粒子的遷移速度帶電粒子的遷移速度= =電泳和電滲流速度的矢量和。電泳和電滲流速度的矢量和。正離子：正離子：兩種效應的運動方向一致，在負極最先流出兩種效應的運動方向一致，在負極最先流出中性粒子：中性粒子：無電泳，受電滲流影響，在陽離子后流出無電泳，受電滲流影響，在陽離子后流出最基本、應用廣的分離模式最基本、應用廣的分離模式 陰離子：陰離子：兩種效應的運動方向相反；兩種效應的運動方向相反；電滲流電滲流 電泳電泳時時,陰離子在負極最后流出陰離子在負極最后流出2 2、毛

25、細管凝膠電泳、毛細管凝膠電泳 CGE 將聚丙烯酰胺等在毛細管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。將聚丙烯酰胺等在毛細管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。 其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分擴散，所得峰型尖銳，大小分離。能夠有效減小組分擴散，所得峰型尖銳，分離效率高。分離效率高。 蛋白質、蛋白質、DNADNA等采用等采用CGECGE能獲得良好分離，能獲得良好分離，DNADNA排排序的重要手段。序的重要手段。 特點：抗對流性好，散熱性好，分離度極高。特點：抗對流性好，散熱性好，分離度極高。 （1 1）緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度達）緩沖溶液中加入

26、離子型表面活性劑，其濃度達到臨界濃度，形成一疏水內(nèi)核、外部帶負電的膠束。到臨界濃度，形成一疏水內(nèi)核、外部帶負電的膠束。3 3、 膠束電動毛細管色譜膠束電動毛細管色譜（MECC ，MEKC） 在電場力的作用下，在電場力的作用下，膠束在柱中移動。膠束在柱中移動。 （2 2）電泳流和電滲流）電泳流和電滲流的方向相反，且的方向相反，且電滲流電滲流 電泳電泳 ，負電膠束以較慢，負電膠束以較慢的速度向負極移動；的速度向負極移動； （5 5）色譜與電泳分離模式的結合。）色譜與電泳分離模式的結合。 （3 3）中性分子在膠束相和溶液（水相）間分配，）中性分子在膠束相和溶液（水相）間分配，疏水性強的組分與膠束結合

27、的較牢，流出時間長；疏水性強的組分與膠束結合的較牢，流出時間長； （4 4）可用來分離中性物質，擴展了高效毛細管電）可用來分離中性物質，擴展了高效毛細管電泳的應用范圍；泳的應用范圍；加電滲流改性劑使電滲流反向，用于淌度很大的離子的分離，主要是無機陰離子的分離。負高壓 。加陽離子表面活性劑，如十六烷基三甲基溴化銨電滲流XXXXX（）（）高壓（）（）地4、 毛細管離子分析毛細管離子分析三、高效毛細管電泳儀器三、高效毛細管電泳儀器清洗清洗記錄記錄檢檢測測器器高高壓壓電電源源毛細毛細管管電解液電解液1、高壓電源：產(chǎn)生、高壓電源：產(chǎn)生030kV 穩(wěn)定連續(xù)可調(diào)電壓穩(wěn)定連續(xù)可調(diào)電壓2、進樣系統(tǒng)進樣系統(tǒng)進樣量：毛細管長度的進樣量：毛細