第16章同位素示蹤在植物病理學研究中的應(yīng)用

1、第第16章章.示蹤技術(shù)在植物病理學示蹤技術(shù)在植物病理學研究中的應(yīng)用研究中的應(yīng)用中國農(nóng)業(yè)大學中國農(nóng)業(yè)大學齊孟文齊孟文第第16章章.示蹤技術(shù)在植物病理學研究中的示蹤技術(shù)在植物病理學研究中的應(yīng)用應(yīng)用1 1 病原微生物的標記病原微生物的標記 1.11.1直接法直接法 通過標記培養(yǎng)基而標記病原微生物的方通過標記培養(yǎng)基而標記病原微生物的方法。將適合的放射性核素或其標記化合物法。將適合的放射性核素或其標記化合物, ,加入培養(yǎng)基加入培養(yǎng)基, ,然后接種病原微生物然后接種病原微生物, , 通過培通過培養(yǎng)使其攝取放射性而獲得標記養(yǎng)使其攝取放射性而獲得標記, ,該法僅限于該法僅限于非專性寄生微生物的標記。非專性寄生

2、微生物的標記。q 方法要點方法要點1)1) 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 適合的普通培養(yǎng)基。適合的普通培養(yǎng)基。2)2) 標記核素標記核素 常用常用1414c c、3232p p、3535s s，如，如1414c-c-葡萄葡萄糖，糖，1414c-c-蔗糖，蔗糖， 3232p -khp -kh2 2popo4 4。 3)3) 放射性活度放射性活度 mbq/mlmbq/ml的范圍的范圍 為了避免刮取菌落時被放射性培養(yǎng)基粘為了避免刮取菌落時被放射性培養(yǎng)基粘污可用雙層培養(yǎng)法。污可用雙層培養(yǎng)法。 平板培養(yǎng)時，先在含放射性的培養(yǎng)平板培養(yǎng)時，先在含放射性的培養(yǎng)基上接種培養(yǎng)，待菌落鋪滿后，再在上基上接種培養(yǎng)，待菌落鋪滿后，再在

3、上面鋪上一層非放射性培養(yǎng)基，經(jīng)過一段面鋪上一層非放射性培養(yǎng)基，經(jīng)過一段時間，菌絲將透過上層培養(yǎng)基，這樣獲時間，菌絲將透過上層培養(yǎng)基，這樣獲得的標記菌落，可避免放射性培養(yǎng)基污得的標記菌落，可避免放射性培養(yǎng)基污染。染。 1.2 1.2 間接法間接法 對專性寄生菌，如銹菌，白粉菌，病毒等應(yīng)對專性寄生菌，如銹菌，白粉菌，病毒等應(yīng)先標記寄主，通過寄生關(guān)系使病原微生物得到標先標記寄主，通過寄生關(guān)系使病原微生物得到標記。記。1 1）寄主植物）寄主植物 先標記后接種，用一般植物標記先標記后接種，用一般植物標記法進行標記，干組織應(yīng)具有法進行標記，干組織應(yīng)具有0.37 0.37 10104 4 3.7 3.7 1

4、0104 4 bq/mlbq/ml。2 2）寄主真菌）寄主真菌 如以真菌為食料的線蟲體如以真菌為食料的線蟲體, ,先培養(yǎng)先培養(yǎng)并標記交鏈孢霉菌并標記交鏈孢霉菌, ,取得標記的孢霉菌后取得標記的孢霉菌后, ,在其體在其體上接種線蟲體進行標記。上接種線蟲體進行標記。 3 3）寄主細菌）寄主細菌 通過標記細菌使其專性寄生噬通過標記細菌使其專性寄生噬菌體得到標記。先標記細菌，菌體得到標記。先標記細菌， 洗去放射性洗去放射性粘污，配成放射性菌液，然后接種噬菌斑，粘污，配成放射性菌液，然后接種噬菌斑，經(jīng)培養(yǎng)止混濁懸浮液變清，表明細菌已幾經(jīng)培養(yǎng)止混濁懸浮液變清，表明細菌已幾乎被吞食，用細菌過濾器過濾，可獲得

5、純乎被吞食，用細菌過濾器過濾，可獲得純的標記噬菌體。的標記噬菌體。 1.31.3標記檢測標記檢測 制備的標記病原微生物可用于病原微生物與制備的標記病原微生物可用于病原微生物與寄主間相互關(guān)系、病害侵染規(guī)律、致病機理等方寄主間相互關(guān)系、病害侵染規(guī)律、致病機理等方面研究。在應(yīng)用前要洗凈表面的放射性粘污和測面研究。在應(yīng)用前要洗凈表面的放射性粘污和測定其濃度或比活度。定其濃度或比活度。1 1）洗滌）洗滌 一般采用徒手振蕩，減壓抽濾或離心洗一般采用徒手振蕩，減壓抽濾或離心洗滌法，洗至下洗液無明顯放射性或接近本底為止。滌法，洗至下洗液無明顯放射性或接近本底為止。2 2）測定）測定 3232p p標記的真菌，

6、可用固型閃爍倍杯法測標記的真菌，可用固型閃爍倍杯法測量，量，1414c-c-標記的真菌、線蟲、細菌等病原生物，標記的真菌、線蟲、細菌等病原生物，可取其懸浮液，用液閃測量，感病生物的患病部可取其懸浮液，用液閃測量，感病生物的患病部位，可用相應(yīng)制樣法制備樣品并測量。位，可用相應(yīng)制樣法制備樣品并測量。 2 2 病害侵染途經(jīng)的研究病害侵染途經(jīng)的研究 探明病害的侵染途經(jīng)可為制定防冶措施提供探明病害的侵染途經(jīng)可為制定防冶措施提供依據(jù)。通過一定方法接種病菌后，定時對客體依據(jù)。通過一定方法接種病菌后，定時對客體進行空間取樣檢測或進行自顯影，便可確定病進行空間取樣檢測或進行自顯影，便可確定病菌的侵染途經(jīng)、過程及

7、規(guī)律。菌的侵染途經(jīng)、過程及規(guī)律。2.1 2.1 土壤病害侵染途經(jīng)土壤病害侵染途經(jīng) 土傳病害，主要由真菌或線蟲引起。進行研土傳病害，主要由真菌或線蟲引起。進行研究時，病原微生物常用直接拌土壤法究時，病原微生物常用直接拌土壤法, ,或制成或制成菌液或孢子懸浮液澆灌植株周圍土壤的方法引菌液或孢子懸浮液澆灌植株周圍土壤的方法引進進, ,使其繁殖達到侵染的目的使其繁殖達到侵染的目的, ,然后定期對植珠然后定期對植珠取樣進行放射測定或自顯影取樣進行放射測定或自顯影, ,判明示蹤菌的侵判明示蹤菌的侵染途經(jīng)及其在寄主中的分布。染途經(jīng)及其在寄主中的分布。 2.2 2種子傳播病害途經(jīng)種子傳播病害途經(jīng) 種子傳播的病

8、害也為數(shù)不少種子傳播的病害也為數(shù)不少, ,如水稻白葉如水稻白葉枯病枯病, ,小麥黑粉病小麥黑粉病, ,棉花炭疽病。通常用侵種棉花炭疽病。通常用侵種法標記病原生物法標記病原生物, ,檢測病原菌由種子侵入幼苗檢測病原菌由種子侵入幼苗及其過程及其過程, ,以揭示侵染規(guī)律和發(fā)病機制以揭示侵染規(guī)律和發(fā)病機制, ,開花開花期侵染的病菌期侵染的病菌, ,可在花期于穗部微噴孢子懸浮可在花期于穗部微噴孢子懸浮液方法接種液方法接種, ,接種后要套代保濕。接種后要套代保濕。2.3 2.3 蟲媒病害侵染途經(jīng)蟲媒病害侵染途經(jīng) 常用間接標記法常用間接標記法, ,即先標記病原植物即先標記病原植物, , 再再接種昆蟲使其吸取

9、標記毒原而標記接種昆蟲使其吸取標記毒原而標記, ,然后將其然后將其接種于寄主接種于寄主, ,研究蟲媒侵染過程。研究蟲媒侵染過程。 2.4 4 其它病害侵染途經(jīng)其它病害侵染途經(jīng) 主要通過雜草主要通過雜草, , 空氣與雨水等途經(jīng)的傳空氣與雨水等途經(jīng)的傳播。因為可能招致環(huán)境放射污染播。因為可能招致環(huán)境放射污染, ,使用受到使用受到限制限制, ,但在嚴格控制的條件下但在嚴格控制的條件下, , 一些研究可一些研究可能提供有價值的信息。禹王樹（能提供有價值的信息。禹王樹（19861986）在）在稻株接種稻株接種1414c c白葉枯細菌，不但當年發(fā)病期白葉枯細菌，不但當年發(fā)病期在田邊雜草能檢測出放射性，而且

10、次年在田邊雜草能檢測出放射性，而且次年1515種雜草也能檢出，表明水稻白葉枯病可以種雜草也能檢出，表明水稻白葉枯病可以通過田邊雜草傳播病害。通過田邊雜草傳播病害。 3 3 植物病害檢測與診斷植物病害檢測與診斷 植物病害診斷與植物檢疫工作中，放射植物病害診斷與植物檢疫工作中，放射免疫分析以及后來發(fā)展起來的酶聯(lián)吸附免免疫分析以及后來發(fā)展起來的酶聯(lián)吸附免疫分析（疫分析（elisaelisa）法）法, ,因較傳統(tǒng)的血清檢驗因較傳統(tǒng)的血清檢驗（瓊脂糖平板）等方法要靈敏得多，可以（瓊脂糖平板）等方法要靈敏得多，可以檢測已感染帶毒而尚無癥狀的植物、定量檢測已感染帶毒而尚無癥狀的植物、定量檢測病原菌侵染的數(shù)量

11、或產(chǎn)生的代謝毒素，檢測病原菌侵染的數(shù)量或產(chǎn)生的代謝毒素，因此被作為病害初期診斷與預(yù)報及檢疫的因此被作為病害初期診斷與預(yù)報及檢疫的重要手段，用于作為進一步進行其它研究重要手段，用于作為進一步進行其它研究的基礎(chǔ)。的基礎(chǔ)。 3.1 1檢測的一般程序檢測的一般程序 1 1）試劑制備）試劑制備 培養(yǎng)病原菌培養(yǎng)病原菌 免疫免疫 標記標記 普通普通 雜交瘤雜交瘤 標記抗原標記抗原 多克隆抗體多克隆抗體 單克隆抗體單克隆抗體 （pcabpcab） (mcab)(mcab) 標記標記 標記抗體標記抗體 2)樣品制備樣品制備 植物試樣經(jīng)勻漿或液氮冷凍研磨用緩沖液提植物試樣經(jīng)勻漿或液氮冷凍研磨用緩沖液提取，上清液用

12、于測試。取，上清液用于測試。 3)測試程序測試程序 測定可采用基于飽和競爭結(jié)合的放射免疫測定可采用基于飽和競爭結(jié)合的放射免疫（ria)ria)或免疫放射分析。或免疫放射分析。 固相載體（聚乙烯）固相載體（聚乙烯） 包被抗體（包被液）包被抗體（包被液）(v.t.t(v.t.t） 拍干洗滌（洗滌液）拍干洗滌（洗滌液） 封板（封閉液）封板（封閉液） 加入樣品或標準加入樣品或標準+ +抗原抗原* *（反應(yīng)液）（反應(yīng)液） 溫浴溫浴 （t.tt.t） 洗滌洗滌 （洗滌液）（洗滌液） 測量測量b b ，b/bb/b。=f(ag):ag=f=f(ag):ag=f-1-1 ( b/b( b/b。) )。 3.2

13、3.2應(yīng)用舉例應(yīng)用舉例序序號號檢測對象檢測對象 方法方法作者作者年代年代1水稻白葉枯病菌水稻白葉枯病菌 ria ria 董以德董以德198119812水稻矮縮病毒水稻矮縮病毒 irmairma金子漁金子漁198619863水稻細菌性條斑病水稻細菌性條斑病 125125i-ai-a蛋白蛋白 王公金王公金199019904小麥花葉病毒小麥花葉病毒 elisaelisa劉常宏劉常宏199519955棉鈴蟲核多角體病毒棉鈴蟲核多角體病毒 elisaelisa陸字融陸字融199519956香蕉束頂病毒香蕉束頂病毒 elisaelisa范國成范國成199919997玉米種子攜帶的玉米種子攜帶的mdmv m

14、dmv elisa elisa 馬占鴻馬占鴻199719978葡萄扇葉病毒葡萄扇葉病毒 elisaelisa 谷洪包谷洪包19941994 4 4病理學研究的相關(guān)技術(shù)病理學研究的相關(guān)技術(shù) 闡明病源微生物與寄主之間致病與抗病這一闡明病源微生物與寄主之間致病與抗病這一對矛盾的相互作用機理，對于充分利用抗病資源，對矛盾的相互作用機理，對于充分利用抗病資源，克服植物病害具有重要意義。在分子水平上，病克服植物病害具有重要意義。在分子水平上，病原微生物在侵染寄主時，首先會釋放某種稱為激原微生物在侵染寄主時，首先會釋放某種稱為激發(fā)子的信號物質(zhì)，通過與寄主細胞表面受體作用，發(fā)子的信號物質(zhì)，通過與寄主細胞表面受

15、體作用，啟動相應(yīng)的基因開關(guān)，使其表達并產(chǎn)生一系列次啟動相應(yīng)的基因開關(guān)，使其表達并產(chǎn)生一系列次級代謝物，以決定寄主對侵染的反應(yīng)，致病微生級代謝物，以決定寄主對侵染的反應(yīng)，致病微生物可以避開寄主的防衛(wèi)系統(tǒng)，而使其染病，產(chǎn)生物可以避開寄主的防衛(wèi)系統(tǒng)，而使其染病，產(chǎn)生諸如如下破壞：真菌產(chǎn)生破壞寄主細胞的酶類諸如如下破壞：真菌產(chǎn)生破壞寄主細胞的酶類（如角質(zhì)酶，果膠酶，纖維素酶，磷酸酶，蛋白（如角質(zhì)酶，果膠酶，纖維素酶，磷酸酶，蛋白酶等），酶等），使寄主組織軟腐壞死，利用寄主的蛋白和核使寄主組織軟腐壞死，利用寄主的蛋白和核酸合成系統(tǒng)進行自身繁殖，多數(shù)病毒屬于酸合成系統(tǒng)進行自身繁殖，多數(shù)病毒屬于此類；分泌毒

16、素破壞寄主正常代謝；分泌此類；分泌毒素破壞寄主正常代謝；分泌阻塞寄主導(dǎo)管的物質(zhì)，致使其枯萎；產(chǎn)生阻塞寄主導(dǎo)管的物質(zhì)，致使其枯萎；產(chǎn)生植物激素，破壞寄主的激素平衡。而植物植物激素，破壞寄主的激素平衡。而植物的誘導(dǎo)抗病性則是由植物抗病基因與病原的誘導(dǎo)抗病性則是由植物抗病基因與病原無毒基因相互識別后，誘導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)決無毒基因相互識別后，誘導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)決定的。寄主可以通過多種方式抵御病原侵定的。寄主可以通過多種方式抵御病原侵染，如加固細胞進行屏蔽，合成植保素，染，如加固細胞進行屏蔽，合成植保素，誘導(dǎo)各種病程相關(guān)蛋白等誘導(dǎo)各種病程相關(guān)蛋白等 。 在植物各個病理反應(yīng)階段的研究，可以在植物各個病理反應(yīng)階段的

17、研究，可以使用的示蹤相關(guān)技術(shù)如下：使用的示蹤相關(guān)技術(shù)如下：4.14.1顯微免疫定位顯微免疫定位 利用放射性顯影或熒光顯像技術(shù)，對病利用放射性顯影或熒光顯像技術(shù)，對病源微生物或其激發(fā)子等配體的特異受體進源微生物或其激發(fā)子等配體的特異受體進行組織、細胞或分子水平的定位。方法是行組織、細胞或分子水平的定位。方法是對配體進行放射性或熒光標記，經(jīng)體內(nèi)引對配體進行放射性或熒光標記，經(jīng)體內(nèi)引入或體外組織或細胞孵育，利用顯影技術(shù)，入或體外組織或細胞孵育，利用顯影技術(shù)，顯示受體類型及分布情況，也可以利用免顯示受體類型及分布情況，也可以利用免疫化學方法顯示，即非標記配體疫化學方法顯示，即非標記配體- -受體作用受

18、體作用后，利用標記抗配體抗體進行顯示。后，利用標記抗配體抗體進行顯示。 標記配體（放射性，熒光）標記配體（放射性，熒光） 體內(nèi)（引入）體內(nèi)（引入） 器官、組織顯像器官、組織顯像 體外體外 組織孵育組織孵育 顯微顯微 單細胞孵育單細胞孵育 顯微、電鏡顯微、電鏡參考文獻參考文獻1) 常青，用配體結(jié)合放射性自顯影定位分析過敏性哮喘常青，用配體結(jié)合放射性自顯影定位分析過敏性哮喘豚鼠肺豚鼠肺m膽堿能受體的變化膽堿能受體的變化, 中國病理生理雜志中國病理生理雜志 ，1995，11（1）：）：11142)曾伸奎曾伸奎, 棉花凝集素對枯萎病的抑制作用與受體的研究，棉花凝集素對枯萎病的抑制作用與受體的研究，四川

19、大學學報四川大學學報,1995，32（3）：）：3283413)樓定安，用非放射性標記法研究低密度脂蛋白受體，樓定安，用非放射性標記法研究低密度脂蛋白受體， 科技通報，科技通報，1994.10（3）：）：1311414）李前偉）李前偉 ， 腫瘤腫瘤vipvip受體顯影的實驗研究受體顯影的實驗研究 , ,核技術(shù)核技術(shù) 19981998，2121（1111）：）：6416446416444.24.2配體配體受體結(jié)合分析受體結(jié)合分析原理：原理： 相互識別在植物與病原物相互作用中具有重相互識別在植物與病原物相互作用中具有重要意義。識別中的信號交流及次級反應(yīng)的啟動與要意義。識別中的信號交流及次級反應(yīng)的啟

20、動與受體的親合力密切相關(guān)，現(xiàn)已鑒定了許多病原物受體的親合力密切相關(guān)，現(xiàn)已鑒定了許多病原物的激發(fā)子，大體分為寡糖，糖肽，糖蛋白，多肽的激發(fā)子，大體分為寡糖，糖肽，糖蛋白，多肽 和蛋白五大類。研究病原激發(fā)子的受體和蛋白五大類。研究病原激發(fā)子的受體, ,對于了解對于了解致病過程或植物的抗性機制致病過程或植物的抗性機制 ，以及搞清寄主抗病，以及搞清寄主抗病基因編碼的產(chǎn)物是否是病原菌無毒基因編碼產(chǎn)物基因編碼的產(chǎn)物是否是病原菌無毒基因編碼產(chǎn)物的?；荏w等重要研究領(lǐng)域具有重要意義。受體的?；荏w等重要研究領(lǐng)域具有重要意義。受體的親合力和數(shù)目，由定量受體的親合力和數(shù)目，由定量受體rere0 0與一系列不同與一

21、系列不同稀釋濃度的標記配體反應(yīng)，相關(guān)數(shù)據(jù)稀釋濃度的標記配體反應(yīng)，相關(guān)數(shù)據(jù)stcatchardstcatchard作圖解析確定。即：作圖解析確定。即： 則則因此，因此， 作圖，斜率為作圖，斜率為k(l/mol),xk(l/mol),x截距截距(b/f (b/f 0),b=0),b= rere 0 0 。 當受體有不同親和力的位點時，當受體有不同親和力的位點時，stcachard stcachard 作圖不作圖不是直線，可通過最小二乘法或剝譜法求得各相應(yīng)位點的親是直線，可通過最小二乘法或剝譜法求得各相應(yīng)位點的親和力常數(shù)。和力常數(shù)。 ineinebrbrbre0fb)(0brfbbrbrkeinei

22、ne )(/0brkfbebfb/ 操作程序操作程序 制備受體材料（組織、單細胞液）制備受體材料（組織、單細胞液）配基配基 孵育孵育 分離分離b b 與與f f 測定測定 作作stcatchardstcatchard圖圖(b/f(b/fb)b)標記tfbbinin0*游離的摩爾濃度tbbbinin0*被結(jié)合的摩爾濃度參考文獻參考文獻1)張張 良良,放射性配基結(jié)合分析對不同細胞放射性配基結(jié)合分析對不同細胞upar表達的比較表達的比較研究研究,上海第二醫(yī)科大學學報上海第二醫(yī)科大學學報,2000，20（2)：1021042)崔毓桂崔毓桂 , 紅細胞胰島素受體分析法的改良及其初步應(yīng)紅細胞胰島素受體分析

23、法的改良及其初步應(yīng)用用,， 標記免役分析與臨床標記免役分析與臨床, 1996，3（4）：）：1851883)王雨田王雨田, 消化系腫瘤細胞消化系腫瘤細胞egf受體放射分析受體放射分析 與與 egf的生的生長調(diào)節(jié)研究長調(diào)節(jié)研究,第四軍醫(yī)大學學報第四軍醫(yī)大學學報,1996,17（5）：）： 3363394) 匡安仁匡安仁 , 125i-g018 動物體內(nèi)受體結(jié)合研究動物體內(nèi)受體結(jié)合研究, 華西醫(yī)大學華西醫(yī)大學報，報，1994，25（2） ：131133 4.3mrna4.3mrna差示顯示技術(shù)差示顯示技術(shù) 病原微生物侵染寄主病原微生物侵染寄主, ,將啟動寄主基因選擇性將啟動寄主基因選擇性表達表達,

24、 ,利用利用mrnamrna差示顯示技術(shù)，可以鑒別出與對照差示顯示技術(shù)，可以鑒別出與對照表達有差異的基因，進而在分子水平上研究植物表達有差異的基因，進而在分子水平上研究植物致病的病理或生理變化過程。致病的病理或生理變化過程。mrnamrna差示顯示原理差示顯示原理如下：所有如下：所有mrnamrna的的3 3端都有一個端都有一個polypoly（a a）尾，因）尾，因此，利用此，利用 3 3端端 引物引物 t t1212mnmn，即在，即在oligodtoligodt后接后接2 2個個選擇堿基，選擇堿基，m m可能為（可能為（g g 、c c 或或t t）三種，）三種，n n可以為可以為（g

25、g、或）四種，共十二種組合，每種覆、或）四種，共十二種組合，每種覆蓋蓋1/12mrna,1/12mrna,通過反轉(zhuǎn)錄將把通過反轉(zhuǎn)錄將把mranmran群體反轉(zhuǎn)錄為群體反轉(zhuǎn)錄為個個別的個個別的c c亞群。然后用一個亞群。然后用一個 5 5端任意引端任意引物對每個物對每個c c亞群進行擴增亞群進行擴增。 在擴增時，可以摻入在擴增時，可以摻入s s標標d d或或d d或其它標記，經(jīng)測序膠電泳或其它標記，經(jīng)測序膠電泳( (分辨分辨500bp)500bp)，對對 光片暴光，可以鑒別出對比材料中有差光片暴光，可以鑒別出對比材料中有差異的異的dnadna片段，將其從膠上切下，再擴增進片段，將其從膠上切下，再

26、擴增進行克隆分析，就能從行克隆分析，就能從c c文庫或基組文庫或基組dnadna文庫篩選到全長文庫篩選到全長c c或基因克隆或基因克隆. .。該方法較傳統(tǒng)差異法有巨大的優(yōu)勢該方法較傳統(tǒng)差異法有巨大的優(yōu)勢, ,但要使但要使1500015000種種m m均可擴增，考慮測序膠能均可擴增，考慮測序膠能顯示顯示5050多個帶，則需至少多個帶，則需至少2020個引物，進行個引物，進行12122020次組合次組合pcrpcr，工作量很大，通過對，工作量很大，通過對. .簡并和提高測序膠的容量簡并和提高測序膠的容量 , ,該法該法已有實用的試劑盒。已有實用的試劑盒。 對照組織/細胞 處理組織/細胞 總rna(

27、少量） 總rna(少量） oligo dt12mn cdna cdna pcr擴增 5端隨機引物，35s pcr產(chǎn)物 pcr產(chǎn)物 變性測序膠 電泳 對照 處理 取下差異帶 再次pcr 制備探針 sorthern,檢索 cdna文庫，基因 4.4 4.4 病理代謝研究病理代謝研究 試驗證實，植株感病部位代謝活動較正常部試驗證實，植株感病部位代謝活動較正常部位更為活躍位更為活躍, ,通過離體培養(yǎng)并飼喂放射性核素或通過離體培養(yǎng)并飼喂放射性核素或標記前體標記前體, ,檢查其慘入代謝物的過程檢查其慘入代謝物的過程, ,可進行病理可進行病理代謝研究。代謝研究。darokher(1983) darokher

28、(1983) 將患病將患病tmvtmv煙草葉片煙草葉片下表皮下表皮, , 在含在含3.7mbq/ml 3.7mbq/ml 3 3h-h-尿苷中溫育尿苷中溫育3h 3h ，下表皮經(jīng)磨碎、抽提、下表皮經(jīng)磨碎、抽提、 過濾、離心等純化過濾、離心等純化, ,發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)患患tmvtmv葉片有葉片有3 3h h標記核蛋白標記核蛋白, ,其浮力密度為其浮力密度為1.231.231.45g/cm1.45g/cm3 3, , 放射性出現(xiàn)一至數(shù)個峰值放射性出現(xiàn)一至數(shù)個峰值, ,這說明這說明tmvtmv專專 化性核蛋白很高，推斷化性核蛋白很高，推斷tmvtmv作用在寄主的作用在寄主的核蛋白上核蛋白上。 5.5.分子標

29、記在植病研究的應(yīng)用分子標記在植病研究的應(yīng)用5.15.1分子標記類型分子標記類型 分子標記是以分子標記是以dnadna多態(tài)性為基礎(chǔ)，以相應(yīng)的多態(tài)性為基礎(chǔ)，以相應(yīng)的dnadna順序片段為測度的遺傳標記順序片段為測度的遺傳標記, ,是繼形態(tài)標記、是繼形態(tài)標記、胞標記和生化標記后的一種新的標記胞標記和生化標記后的一種新的標記, ,是聯(lián)系遺是聯(lián)系遺傳圖譜和和物理圖譜的橋梁，也是繼分子雜交，傳圖譜和和物理圖譜的橋梁，也是繼分子雜交，pcrpcr之后迅速興起并廣泛應(yīng)用的重要生物學實驗之后迅速興起并廣泛應(yīng)用的重要生物學實驗技術(shù)。技術(shù)。生物多樣性生物多樣性 dnadna多態(tài)性多態(tài)性 順序片段順序片段 分子特征圖

30、譜。分子特征圖譜。測度 根據(jù)測度的不同根據(jù)測度的不同 ，分子標記主要有：，分子標記主要有：1 1）rflp (restriction fragment length rflp (restriction fragment length polymorphism dnd marker, polymorphism dnd marker, 限制性片段長度多限制性片段長度多態(tài)性態(tài)性) )， 該法先用限制性內(nèi)切酶消化基因組該法先用限制性內(nèi)切酶消化基因組dna , dna , 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到支持膜上，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到支持膜上，再用探針（放射性或非放射性）進行雜交，通過顯用探針

31、（放射性或非放射性）進行雜交，通過顯示相應(yīng)的酶切片段，來表征不同遺傳位點變異示相應(yīng)的酶切片段，來表征不同遺傳位點變異（多態(tài)性）的方法。其具有高度多態(tài)，（多態(tài)性）的方法。其具有高度多態(tài)， 高密度高密度標記，標記共顯性，無表型效應(yīng)等特點，適應(yīng)構(gòu)標記，標記共顯性，無表型效應(yīng)等特點，適應(yīng)構(gòu)建 遺 傳 標 記 圖 譜 和建 遺 傳 標 記 圖 譜 和 q t l q t l （ 數(shù) 量 基 用 座（ 數(shù) 量 基 用 座 quantitative trait loci quantitative trait loci ）定位。該法需一套）定位。該法需一套一定數(shù)目的組合探針（可由相應(yīng)基因文庫一定數(shù)目的組合探針

32、（可由相應(yīng)基因文庫cdnacdna獲獲得）才能覆蓋整個基因組得）才能覆蓋整個基因組dnadna，并達到一定標記，并達到一定標記密度。方法操作程序相對復(fù)雜，且耗時耗錢，但密度。方法操作程序相對復(fù)雜，且耗時耗錢，但結(jié)果可靠結(jié)果可靠，準確。準確。rflp過程： a1 a2 a1 a2 a1 a2 a1 a2酶切電泳轉(zhuǎn)印雜交洗膜，自顯影 2 2）rapd (random amplified polymorphism dna rapd (random amplified polymorphism dna 隨機擴增多態(tài)性隨機擴增多態(tài)性dna)dna) rapd rapd是在是在pcrpcr技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起

33、來的技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的dnadna分子分子多態(tài)性檢測方法。基本方法是以基因組多態(tài)性檢測方法。基本方法是以基因組dnadna為模為模板，使用一套隨機核苷序列（通常板，使用一套隨機核苷序列（通常1010個堿基個堿基) )單單引物引物, , 通過通過pcrpcr擴增產(chǎn)生出的不連續(xù)擴增產(chǎn)生出的不連續(xù)dnadna片段片段, , 用用以檢測以檢測dnadna的多態(tài)性。的多態(tài)性。rapdrapd分析步驟簡單分析步驟簡單,dna,dna用用量少量少, ,不需要事先知道基因組的任何序列信息不需要事先知道基因組的任何序列信息, ,一一套引物可用于不同生物的基因組套引物可用于不同生物的基因組, ,快速進行多態(tài)快速

34、進行多態(tài)性的檢測性的檢測, ,?？捎糜跇藴食？捎糜跇藴蔰nadna指紋圖譜構(gòu)建指紋圖譜構(gòu)建, ,用以用以分類研究或種質(zhì)鑒定研究。分類研究或種質(zhì)鑒定研究。 3）aflpaflp（amplification fragment length amplification fragment length polymorphism polymorphism 擴增片段長度多態(tài)性）擴增片段長度多態(tài)性） 該方法的基本原理是對基因組該方法的基本原理是對基因組dnadna的限制性的限制性內(nèi)切酶的酶切片段進行選擇性擴增。限制性內(nèi)切內(nèi)切酶的酶切片段進行選擇性擴增。限制性內(nèi)切片段與互補粘性末端雙鏈通用人工接頭連接，連片段

35、與互補粘性末端雙鏈通用人工接頭連接，連接后的粘性末端順序作為以后接后的粘性末端順序作為以后pcrpcr引物的結(jié)合位引物的結(jié)合位點點, ,實踐中根據(jù)需要在引物實踐中根據(jù)需要在引物33端可分別加入端可分別加入1 13 3個選擇性核苷，以達到選擇性擴增的目的。通過個選擇性核苷，以達到選擇性擴增的目的。通過標記引入物，標記引入物， 自顯影僅顯視選擇擴增的片段。自顯影僅顯視選擇擴增的片段。aflp aflp 結(jié)合了結(jié)合了rapdrapd和和rflp rflp 的優(yōu)點，具有的優(yōu)點，具有rflprflp技術(shù)技術(shù)的可靠和的可靠和pcrpcr技術(shù)的高效性，可在一個反應(yīng)內(nèi)檢技術(shù)的高效性，可在一個反應(yīng)內(nèi)檢測大量的限

36、制片段，一次可獲得測大量的限制片段，一次可獲得5050100100條譜帶。條譜帶。 aflpaflp對對dnadna的純度和內(nèi)切酶質(zhì)要求較高。的純度和內(nèi)切酶質(zhì)要求較高。 4 4）ssr ssr （micro satellite micro satellite 微衛(wèi)星）微衛(wèi)星） 指分散在指分散在真核生物基因組序列中的真核生物基因組序列中的2-42-4個堿基組成的簡單個堿基組成的簡單重復(fù)序列，如（重復(fù)序列，如（gaga）n n（gaagaa）n n等。個體間簡單等。個體間簡單重復(fù)序列數(shù)目的變化產(chǎn)生的多態(tài)性，比重復(fù)序列數(shù)目的變化產(chǎn)生的多態(tài)性，比rflprflp多態(tài)多態(tài)性高得多，被認為是繼性高得多，被

37、認為是繼rflprflp的第二代分子標記，的第二代分子標記，其不足是必須針對每個染色體上的微衛(wèi)星，發(fā)現(xiàn)其不足是必須針對每個染色體上的微衛(wèi)星，發(fā)現(xiàn)其兩端的單拷貝序列，據(jù)此設(shè)計引物，這給其兩端的單拷貝序列，據(jù)此設(shè)計引物，這給ssrssr標記帶來方便，尚需進行進一步研究。標記帶來方便，尚需進行進一步研究。 5.2 2 分子標記的分子標記的 應(yīng)用應(yīng)用 1 1）分子標記遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建）分子標記遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建 分子標記圖譜是基因定位的基礎(chǔ)，標記密度分子標記圖譜是基因定位的基礎(chǔ)，標記密度達到達到0.1cm 0.1cm 時，可直接對基因定位。圖譜構(gòu)建以時，可直接對基因定位。圖譜構(gòu)建以同源染色體基因交換重組為測度，交換重組率與同源染色體基因交換重組為測度，交換重組率與基因間距離成正比，圖譜單位距離厘摩（基因間距離成正比，圖譜單位距離厘摩（cmcm）大）大致相當于致相當于1%1%重組率。重組率。作圖步驟：作圖步驟： 建立作圖群體建立作圖群體 要繪制分子的遺傳連續(xù)圖譜要繪制分子的遺傳