分子生物學(xué)：6-DNA的重組和克隆

1、 化學(xué)工業(yè)出版社化學(xué)工業(yè)出版社 發(fā)生在DNA分子內(nèi)或分子間的遺傳信息重新組合，稱為遺遺傳重組傳重組(recombination)或基因重排，重組產(chǎn)物稱為重組體DNA(recombinant DNA)。DNA的重組廣泛存在于各類生物，真核生物基因重組的主要途徑，是減數(shù)分裂時(shí)同源染色體之間的交換。細(xì)菌的基因組為單倍體，雖然不進(jìn)行減數(shù)分裂，也可通過多種形式進(jìn)行遺傳重組，如細(xì)菌通過結(jié)合作用進(jìn)行的DNA轉(zhuǎn)移，病毒、噬菌體或質(zhì)粒DNA插入宿主的染色體均是典型的同源重組。 DNA重組對生物進(jìn)化，物種多樣性，和種群內(nèi)的遺傳多樣性起著關(guān)鍵的作用。誠然，基因突變對生物進(jìn)化也起重要作用，然而突變的概率很低，且多數(shù)是

2、有害的。如果生物只有突變沒有重組，在積累有利突變的同時(shí)，不可避免積累許多難以擺脫的有害突變。有利突變會與有害突變一起被淘汰，新的優(yōu)良基因就很難保留。DNA重組的意義是能迅速增加群體的遺傳多樣性(diversity)，通過優(yōu)化組合(optimization)積累有利突變，推動生物進(jìn)化。此外，DNA重組還參與DNA損傷修復(fù)，某些基因表達(dá)的調(diào)控等重要的生物學(xué)過程。 用人工操作構(gòu)建DNA重組體，將其導(dǎo)入受體細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)，稱DNA克隆或分子克隆分子克隆(molecular cloning)，也可稱作重組DNA技術(shù)，或基因工程。1972年Berg等將噬菌體的基因插入SV40的DNA構(gòu)建了DNA重組體。次

3、年，Cohen等將通過體外重組的細(xì)菌質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌擴(kuò)增，完成了分子克隆的全過程，基因工程技術(shù)由此誕生?；蚬こ碳夹g(shù)打破了物種界限，可以用繁殖很快的細(xì)菌或酵母菌，制造人類的蛋白質(zhì)，形成了制造生物制品的新產(chǎn)業(yè)?？梢远ㄏ蚋淖兩锏倪z傳特性，使生物體獲得人們所希望的某種性狀，如抗蟲、抗病或抗鋤草劑的性狀，為育種工作開辟了新的道路。同時(shí)，也為某些疾病的治療提供了新的途徑。通過對基因的操作來治療疾病，稱作基因治療，是醫(yī)學(xué)發(fā)展的一個重要方面。 6.1 同源重組同源重組 同源重組同源重組(homologous recombination)發(fā)生在同源DNA片段之間，是在兩個DNA分子的同源序列之間直接進(jìn)行交換

4、的一種重組形式。不同來源或不同位點(diǎn)的DNA，只要二者之間存在同源區(qū)段，都可以進(jìn)行同源重組。由于其廣泛存在，亦稱一般性重組(general recombination)。在同源重組中進(jìn)行交換的同源序列可能是完全相同的，也可能是非常相近的。細(xì)菌的接合(conjugation)、轉(zhuǎn)化(transformation)和轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction)，以及真核細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)同源染色體之間發(fā)生的交換等都屬于同源重組。 6.1.1 同源重組的分子模型同源重組的分子模型6.1.1.1 Holliday模型模型 Holliday模型模型由美國科學(xué)家Holliday于1964年提出，后幾經(jīng)修改，依然保持了其基本

5、內(nèi)容，Holliday模型的大致步驟如圖6-1所示。 (1) 切割 2個相互靠近的同源DNA各有1條鏈在相同的位置被特異性的內(nèi)切酶切開。 (2) 交叉和連接 被切開的鏈交叉，并與另一個分子的同源鏈連接，分子彎曲形成Holliday連接。由于其形狀很象字母(chi)，也可以被稱作結(jié)構(gòu)( structure)，或Holliday結(jié)構(gòu)(Holliday structure)，或Holliday中間體(Holliday immediate)。 (3) 拆分 關(guān)于Holliday連接的拆分，早期提出兩種方式，其一是將原來連接起來的鏈再切開，兩個分子分離后重新連接，結(jié)果產(chǎn)生與原來完全相同的兩個非重組DNA

6、。其二是將另一條鏈切開，兩個分子分離后再重新連接，由此產(chǎn)生重組的DNA。對這一模型的一個重要改進(jìn)是在Holliday連接形成之后，其交叉點(diǎn)移動一定的距離，然后分子彎曲形成結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)的拆分有兩種可能，其一是水平方向的切割(WE裂解)，圖中的鏈在交叉點(diǎn)被切割，兩個分子分離后再連接，由此產(chǎn)生的重組體制交換了DNA的一個小片段，稱補(bǔ)丁重組體(patch recombinant heteroduplex)。其二是垂直方向的切割(NS裂解)，圖中的+鏈在交叉點(diǎn)被切割，兩個分子分離后再連接，由此產(chǎn)生的重組體有一條鏈由兩個DNA分子的鏈拼接而成，稱拼接重組體(splice recombinant hetero

7、duplex)。 Holliday模型能夠較好的解釋同源重組，得到學(xué)術(shù)界廣泛的支持，特別是Potter和Dressler在電鏡下看到了Holliday中間體的結(jié)構(gòu)(圖6-2)，是對Holliday模型強(qiáng)有力的支持。當(dāng)然，后來提出的同源重組分子模型，能更好地解釋同源重組，但這些分子模型都是以Holliday模型為基礎(chǔ)提出來的。 6.1.1.2 單鏈斷裂模型單鏈斷裂模型 盡管Holliday模型能解釋重組的許多特征，但也有某些不足。其一，DNA重組時(shí)，通常有一個分子是供體，另一個是受體，而Holliday模型無法區(qū)分供體和受體。其二，Holliday模型需要兩個DNA分子各有一條鏈在同一位置被切割

8、，目前尚未發(fā)現(xiàn)完成這一過程的確切機(jī)制。 1975年Aviemore提出了單鏈斷裂模型單鏈斷裂模型(the single-stranded break model)，隨后，Meselson和Radding對此進(jìn)行了修改，修改后的模型被稱為Aviemore模型或Meselson-Radding模型。 單鏈斷裂模型認(rèn)為，在同源區(qū)時(shí)，只有供體分子產(chǎn)生一個單鏈切口，隨后，有多種機(jī)制形成DNA單鏈，并入侵受體DNA分子，形成Holliday結(jié)構(gòu)。其后進(jìn)行的交叉點(diǎn)移動，和Holliday結(jié)構(gòu)的拆分，與Holliday模型相同。單鏈斷裂模型能很好的解釋細(xì)菌的接合作用和轉(zhuǎn)化等原核生物的同源重組。以及DNA損傷的

9、重組修復(fù)。從上一章的圖5-17b可以明確地看到單鏈入侵、交叉點(diǎn)移動，和Holliday結(jié)構(gòu)的拆分等單鏈斷裂模型的主要步驟。 6.1.1.3 雙鏈斷裂模型雙鏈斷裂模型 雙鏈斷裂模型雙鏈斷裂模型(the double-stranded break model, DSB)由Szostak等于1983年提出，該模型認(rèn)為，受體雙鏈(recipient duplex)兩條鏈的斷裂啟動了鏈的交換，不產(chǎn)生斷裂的被稱為供體雙鏈(donor duplex)。隨后發(fā)生的DNA修復(fù)合成以及切口連接導(dǎo)致形成兩個Holliday連接，主要步驟如圖6-3所示。 DNA受到的雙鏈斷裂損傷，可以通過同源重組來修復(fù)，在修復(fù)損傷的

10、同時(shí)，進(jìn)行基因重組。真核生物的細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)的同源重組，符合雙鏈斷裂模型。 (1) 內(nèi)切酶切開受體雙鏈DNA分子同源區(qū)的兩條鏈，啟動重組過程。雙鏈斷裂的DNA分子既是重組的“人侵者”，又是DNA片段的受體，因此被稱為受體雙鏈(圖6-3a)。 (2) 在外切酶的作用下，雙鏈切口擴(kuò)大，產(chǎn)生兩個具有3-末端的單鏈區(qū)，并形成一個缺口(圖6-3b)。 (3) 一個自由的3-端入侵供體雙鏈DNA分子的同源區(qū)，形成異源雙鏈，供體雙鏈的一條鏈被取代，產(chǎn)生取代環(huán)(a displacement loop, D環(huán), 圖6-3c)。 (4) 人侵的3-端引發(fā)以被人侵DNA鏈為模板的DNA合成，導(dǎo)致D環(huán)擴(kuò)大。擴(kuò)大的D環(huán)

11、到達(dá)受體雙鏈空隙的另外一側(cè)，與空隙末端的另一個3-單鏈末端形成互補(bǔ)雙鏈。隨后，以D環(huán)的單鏈為模板，填補(bǔ)受體鏈上的缺口(圖6-3d)。 (5) DNA連接酶連接切口，形成兩個Holliday連接，即聯(lián)結(jié)體x和聯(lián)結(jié)體y(圖6-3e)。 (6) Holliday連接的拆分有4種可能，若聯(lián)結(jié)體x和聯(lián)結(jié)體y均在的位置進(jìn)行切割和連接，產(chǎn)生補(bǔ)丁重組體，基因A和B不發(fā)生重組。若聯(lián)結(jié)體x和聯(lián)結(jié)體y均在的位置進(jìn)行切割和連接，依然產(chǎn)生補(bǔ)丁重組體，基因A和基因B照樣不發(fā)生重組。只有聯(lián)結(jié)體x在的位置進(jìn)行切割和連接，聯(lián)結(jié)體y在的位置進(jìn)行切割和連接，或聯(lián)結(jié)體x在的位置進(jìn)行切割和連接，聯(lián)結(jié)體y在的位置進(jìn)行切割和連接，才能形成

12、拼接重組體，發(fā)生基因A和B的重組。 6.1.2 細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組6.1.2.1 細(xì)菌的接合作用細(xì)菌的接合作用 細(xì)菌的細(xì)胞相互接觸時(shí)，遺傳信息可在接合質(zhì)粒的參與下，由一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一細(xì)胞，稱為接合作用接合作用(conjugation)。供體細(xì)胞為雄性，受體為雌性。能夠促使染色體基因轉(zhuǎn)移的接合質(zhì)粒稱為致育因子(fertility factor)，簡稱性因子或F因子。 整合的F因子被切割出來時(shí)，有可能因切點(diǎn)不精確，使F因子帶有若干宿主染色體基因，稱為F因子。使F細(xì)胞與F細(xì)胞雜交，給體部分染色體基因隨F進(jìn)入受體細(xì)胞，無需整合就可以表達(dá)，實(shí)際上形成部分二倍體，此時(shí)受體細(xì)胞也變成

13、F細(xì)胞，這種轉(zhuǎn)移過程稱為性導(dǎo)(sexduction)。大腸桿菌通過結(jié)合作用將染色體完全轉(zhuǎn)移的時(shí)間約100min，若其間配對的細(xì)胞受外力作用而分開，轉(zhuǎn)移的DNA即被打斷，根據(jù)轉(zhuǎn)移基因所需時(shí)間可以確定該基因在環(huán)狀染色體上的位置，繪制出染色體的基因圖(圖6-4)。 致育因子（F因子）通過結(jié)合作用由F+細(xì)胞向F細(xì)胞轉(zhuǎn)移，F(xiàn)質(zhì)粒約1/3的基因與轉(zhuǎn)移有關(guān)，traS和traT基因編碼表面排斥蛋白，阻止F+細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)移，F(xiàn)+細(xì)胞的性菌毛與F-細(xì)胞結(jié)合后收縮，使二者靠近，TraD蛋白構(gòu)成轉(zhuǎn)移的通道，在TraI在TraY的幫助下結(jié)合到轉(zhuǎn)移起點(diǎn)oriT上，切開一條鏈，使其5端進(jìn)入受體細(xì)胞，并合成其互補(bǔ)鏈，使F細(xì)胞

14、轉(zhuǎn)化為F+細(xì)胞，給體細(xì)胞中的單鏈也可以合成互補(bǔ)鏈。6.1.2.2 細(xì)菌的遺傳轉(zhuǎn)化細(xì)菌的遺傳轉(zhuǎn)化 遺傳轉(zhuǎn)化遺傳轉(zhuǎn)化(genetic transformation)指細(xì)菌吸收外源DNA(轉(zhuǎn)化因子)而發(fā)生遺傳性狀改變的現(xiàn)象。能攝取DNA分子的細(xì)菌稱為感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞(competent cell)，很多細(xì)菌在自然條件下就有吸收外源DNA的能力，如固氮菌、鏈球菌、芽孢桿菌、奈氏球菌及嗜血桿菌等。 有些細(xì)菌能吸收雙鏈DNA，但多數(shù)情況下，被轉(zhuǎn)移的只是雙鏈DNA的一條鏈。轉(zhuǎn)化涉及細(xì)菌染色體上10多個基因編碼的蛋白質(zhì)。感受態(tài)因子(competent factor)可誘導(dǎo)與感受態(tài)有關(guān)蛋白的表達(dá)，生成的自溶

15、素(autolysin)使細(xì)胞表面的DNA結(jié)合蛋白和核酸分離，游離DNA與細(xì)胞表面的DNA結(jié)合蛋白結(jié)合后，核酸酶(nuclease)使其中一條鏈降解，另一條鏈則與感受態(tài)特異蛋白相結(jié)合，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)，與染色體DNA重組。 自然轉(zhuǎn)化是細(xì)菌遺傳信息轉(zhuǎn)移和重組的一種重要方式，但多數(shù)細(xì)菌在自然條件下不發(fā)生轉(zhuǎn)化，或轉(zhuǎn)化效率很低。在科研工作中，通常用高濃度Ca2+誘導(dǎo)細(xì)胞成為感受態(tài)，提高轉(zhuǎn)化率。6.1.2.3 細(xì)菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)菌的轉(zhuǎn)導(dǎo) 轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)是通過噬菌體將細(xì)菌基因從供體轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞的過程，普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)(generalized transduction)指宿主基因組任意

16、位置的DNA均可成為成熟噬菌體DNA的一部分而被轉(zhuǎn)入受體菌。限制性轉(zhuǎn)導(dǎo)限制性轉(zhuǎn)導(dǎo)(specialized transduction)指某些溫和噬菌體在裝配病毒顆粒時(shí)，用宿主染色體整合部位的DNA取代了病毒DNA。在上述兩種類型中，都有噬菌體基因被宿主基因所取代，使噬菌體成為缺陷型。缺陷型噬菌體仍可將顆粒內(nèi)DNA導(dǎo)人受體菌，前宿主的基因進(jìn)入受體菌后即可與染色體DNA發(fā)生重組。6.1.2.4 細(xì)菌的細(xì)胞融合細(xì)菌的細(xì)胞融合 為了使細(xì)菌進(jìn)行廣泛的基因重組，在科研工作中，可以用溶菌酶除去兩個菌株的細(xì)胞壁，使之成為原生質(zhì)體。然后，人工促進(jìn)原生質(zhì)體的融合，這便是細(xì)菌的細(xì)胞融合(cell fusion)。細(xì)胞

17、融合后，兩個菌株的DNA發(fā)生廣泛的基因轉(zhuǎn)移和重組。經(jīng)過細(xì)胞壁的誘導(dǎo)生成，可篩選所需要的菌株。 6.1.3 細(xì)菌同源重組的酶學(xué)機(jī)制細(xì)菌同源重組的酶學(xué)機(jī)制（1） 位點(diǎn)和位點(diǎn)和RecBCD的作用的作用位點(diǎn)是RecBCD作用的調(diào)控位點(diǎn)，有一個保守的8bp序列(5-GCTGGTGG-3)，在E.coli的DNA中，這一序列在每5l0kb長的序列中即出現(xiàn)一次。研究發(fā)現(xiàn)，在噬菌體的一些突變體中，位點(diǎn)單一堿基對的改變即可明顯影響重組的效率。RecBCD是一種多功能酶，具有3種酶活性： 依賴于ATP的外切核酸酶活性； 可被ATP增強(qiáng)的內(nèi)切核酸酶活性； ATP依賴的解旋酶活性。當(dāng)DNA分子斷裂時(shí)，它即結(jié)合在其游離

18、端，使DNA雙鏈解旋并降解，解旋所需能量由ATP水解供給。RecA蛋白的帶狀圖解RecA蛋白單體的Mr為38 000，它與單鏈DNA結(jié)合形成每圈含6個單體的螺旋纖絲(helical filament) ，其中一個單體由紅色標(biāo)出。 E.coli的RecA蛋白能誘發(fā)SOS反應(yīng)，還可促進(jìn)同源重組過程中DNA單鏈的入侵。在重組過程中DNA配對，Holliday中間體的形成，分支移動等步驟中RecA蛋白起十分重要作用。RecA可以與雙鏈DNA作用，并迅速掃描尋找與單鏈互補(bǔ)的序列?；パa(bǔ)序列一旦被找到，雙鏈進(jìn)一步被解旋，單鏈與雙鏈中的互補(bǔ)鏈配對，同源鏈則被置換出來。鏈的交換沿單鏈53方向進(jìn)行，直至交換終止。

19、在此過程中，由RecA水解ATP提供反應(yīng)所需能量。SSB的存在可以確保底物減少二級結(jié)構(gòu)，因而可促進(jìn)RecA的作用。Rec F, RecO和Rec R蛋白調(diào)節(jié)Rec A纖絲的裝配和拆卸。 如圖6-5所示，首先，RecBCD結(jié)合到DNA的末端，并使DNA解旋。接著SSB和少量的RecA結(jié)合到單鏈區(qū)，RecBCD從末端起切割單鏈，對3-端的水解速度比5-端快。當(dāng)酶切位點(diǎn)移動到位點(diǎn)3-側(cè)46個核苷酸處時(shí)，3-端的水解停止，5-端的水解速度加快，產(chǎn)生具有3-端的游離單鏈。在此過程中，RecA取代SSB與游離單鏈結(jié)合，為下一階段結(jié)合RecA的游離單鏈入侵另一雙鏈DNA的同源區(qū)創(chuàng)造了條件。 RecA的作用分

20、為3個階段： 在前聯(lián)會 (presynapsis)階段，RecA分子通過其第一DNA結(jié)合位點(diǎn)與單鏈DNA結(jié)合，形成蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物。 在聯(lián)會前(synapsis)階段，RecA分子通過其第二DNA結(jié)合位點(diǎn)與另一個DNA雙螺旋結(jié)合，形成三鏈DNA中間體，隨后，單鏈DNA入侵雙鏈DNA，并快速掃描搜索同源區(qū)。 在鏈交換階段，入侵的單鏈DNA置換雙螺旋的一條鏈，產(chǎn)生雜合DNA雙螺旋(圖6-6)。至此，Holliday中間體已經(jīng)形成，隨后要進(jìn)行的是交叉點(diǎn)的移動，和Holliday中間體的拆分。 （2） RecA蛋白引起蛋白引起DNA同源重組同源重組RecA蛋白引起DNA同源重組的模型（3） Ruv

21、蛋白和蛋白和Holliday聯(lián)結(jié)體的拆分聯(lián)結(jié)體的拆分由于DNA分子具有螺旋結(jié)構(gòu)，在Holliday中間體移動時(shí)，需要兩個DNA分子進(jìn)行旋轉(zhuǎn)。RuvA和RuvB蛋白在推動DNA分子旋轉(zhuǎn)中起關(guān)鍵作用。Ruv A蛋白為四聚體，能夠識別Holliday聯(lián)結(jié)體的交叉點(diǎn)，每一個亞基結(jié)合Holliday聯(lián)結(jié)體的一段雙鏈DNA，促進(jìn)交叉點(diǎn)移動過程中雙鏈的分離，還可幫助RuvB六聚體環(huán)結(jié)合在雙鏈DNA上。RuvB是一種解螺旋酶。通過水解ATP而推動交叉點(diǎn)的移動。Holliday聯(lián)結(jié)體最后由RuvC拆分，并由DNA聚合酶和DNA連接酶進(jìn)行修復(fù)合成。RuvC二聚體是一種內(nèi)切核酸酶，特異性識別Holliday聯(lián)結(jié)體并

22、將其切開。它識別四核苷酸序列ATTG，此序列位于Holliday聯(lián)結(jié)體的哪一條鏈，決定重組結(jié)果是形成補(bǔ)丁重組體，還是拼接重組體(圖6-7)。 RuvA四聚體的電荷分布，藍(lán)色表示正電荷，紅色表示負(fù)電荷，注意正電荷位于四聚體的表面，有四個負(fù)電荷區(qū)域位于其中心。假設(shè)的RuvA四聚體與Holliday位點(diǎn)結(jié)合的結(jié)構(gòu)模型。6.1.4 真核生物的同源重組真核生物的同源重組6.1.4.1 減數(shù)分裂中的同源重組減數(shù)分裂中的同源重組真核生物的同源重組主要發(fā)生在細(xì)胞減數(shù)分裂前期I兩個配對的同源染色體之間(非姊妹染色單體)，先在細(xì)線期(leptotene)和合線期(zygotene)形成聯(lián)會復(fù)合體(synapton

23、emal complex, SC)，再在粗線期(pachytene)進(jìn)行交換。有時(shí)，同源重組也會發(fā)生在DNA損傷修復(fù)之中，主要用以修復(fù)DNA雙鏈斷裂、單鏈斷裂和鏈間交聯(lián)等損傷。研究表明，不同真核生物的同源重組機(jī)制是高度保守的。 (1) Spol1蛋白切割DNA雙鏈，Spol1蛋白沒有序列選擇性，但對染色體的結(jié)構(gòu)有一定的選擇性。在已復(fù)制的同源染色體開始配對的時(shí)候，優(yōu)先作用于核小體包裝疏松的染色體區(qū)域。(2) MRX酶復(fù)合物催化的5 3切除， MRX酶復(fù)合物由Mre11, Rad50和Xrs2三個亞基組成，并以這三個亞基名稱的第一個字母命名。MRX酶復(fù)合物與細(xì)菌的RecBCD沒有同源性，但在同源重

24、組中所起的作用與RecBCD相似。 (3) Rad51和Dmc1與單鏈DNA結(jié)合，Rad51和Dmc1的作用與細(xì)菌的RecA蛋白相似，二者均可形成絲狀聚集體，并與單鏈DNA結(jié)合，促進(jìn)非姐妹染色體之間的鏈交換。 (4) 多種蛋白質(zhì)促進(jìn)減數(shù)分裂時(shí)的同源重組，形成了由多種蛋白質(zhì)和DNA形成的復(fù)合體，被稱作重組工廠(recombination factory)，其中可能有一些蛋白質(zhì)參與Holliday聯(lián)結(jié)體的交叉點(diǎn)移動，和Holliday聯(lián)結(jié)體的拆分。例如，在真核生物中高度保守的Mus81蛋白是減數(shù)分裂所必需的，或許具有Holliday聯(lián)結(jié)體拆分酶的作用。 6.1.4.2 基因轉(zhuǎn)換基因轉(zhuǎn)換在同源重組過

25、程中，Holliday中間體拆分時(shí)，發(fā)生DNA片段的交互重組。在真核生物中，還有另一種機(jī)制，基因只發(fā)生單向的轉(zhuǎn)移，稱基因轉(zhuǎn)換(gene conversion)。研究基因轉(zhuǎn)換的良好材料是子囊菌，許多子囊菌的一個雜合體通過減數(shù)分裂可產(chǎn)生位于同一個大的細(xì)胞即子囊中的4個呈線性排列單倍體核，緊接著進(jìn)行一次有絲分裂，因而產(chǎn)生了8個線性排列的子囊孢子。在不發(fā)生基因重組的情況下，具有兩種不同顏色的孢子應(yīng)當(dāng)按4:4的比例出現(xiàn)。然而，有時(shí)可以呈現(xiàn)5:3或6:2的分離比例。這種現(xiàn)象說明從一個染色單體到另一個單體上發(fā)生了遺傳信息的單向轉(zhuǎn)移，即基因轉(zhuǎn)換，而不是雙向的交換。基因轉(zhuǎn)換不僅僅在減數(shù)分裂時(shí)非姐妹染色單體的等位

26、基因之間發(fā)生，還在以下情況下發(fā)生： 有絲分裂時(shí)姐妹染色單體等位基因之間； 有絲分裂和減數(shù)分裂時(shí)姐妹染色單體的非等位重復(fù)基因之間； 有絲分裂和減數(shù)分裂時(shí)同一條染色單體上非等位重復(fù)基因之間。在后兩種情況中，基因轉(zhuǎn)換的頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于相應(yīng)的交互重組頻率。 釀酒酵母有兩種交配型a和，兩種細(xì)胞融合(交配)即形成a/二倍體細(xì)胞，經(jīng)過減數(shù)分裂，則可以形成兩個單倍體a細(xì)胞，或兩個單倍體細(xì)胞。說明期間發(fā)生了基因轉(zhuǎn)換，這種特殊的基因轉(zhuǎn)換稱交配型轉(zhuǎn)換。交配型轉(zhuǎn)換的機(jī)制如圖6-9所示，可以看出，這一過程的第一階段與同源重組相似，只是進(jìn)行雙鏈切割的酶是特異性的核酸內(nèi)切酶，稱HO內(nèi)切核酸酶。鏈入侵之后，只有其中一個基因(a基

27、因)的序列被復(fù)制，另一個基因(基因)的單鏈序列則被切除。經(jīng)過修復(fù)合成和連接，兩個子代分子均含有a基因?？偟慕Y(jié)果是基因轉(zhuǎn)換，而不是進(jìn)行相互交換的基因重組。 6.2 位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)特異性重組6.2.1 位點(diǎn)特異性重組的機(jī)制位點(diǎn)特異性重組的機(jī)制位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)特異性重組(site-specific recombination)指發(fā)生在DNA特應(yīng)性位點(diǎn)上的重組，廣泛存在于各類細(xì)胞中。其主要作用包括某些基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，發(fā)育過程中DNA的程序性重排，以及有些病毒和質(zhì)粒DNA復(fù)制循環(huán)過程中發(fā)生的整合與切除等。此過程往往發(fā)生在一個特定的短(20200bp)DNA序列內(nèi)(重組位點(diǎn))，并且有特異的重組酶和輔

28、助因子參與。位點(diǎn)特異性重組的結(jié)果決定于重組位點(diǎn)的位置和方向。如果兩個重組位點(diǎn)為存在于同一DNA分子上的反向重復(fù)序列，即以相反方向存在于同一DNA分子上，重組的結(jié)果是兩個重組位點(diǎn)之間的DNA片段發(fā)生倒位。若重組位點(diǎn)為存在于同一DNA分子上的正向重復(fù)序列，即以相同方向存在于同一DNA分子上，重組結(jié)果是兩個重組位點(diǎn)之間的DNA片段被切除。若重組位點(diǎn)以相同方向存在于不同的DNA分子上，重組的結(jié)果是發(fā)生整合(圖6-10)。 位點(diǎn)特異性重組的主要步驟位點(diǎn)特異性重組的主要步驟(1) 兩個酶分子各自通過活性中心的Tyr-OH親核進(jìn)攻識別序列上的1個特定的磷酸二酯鍵，導(dǎo)致2個DNA分子各有1條鏈在識別序列內(nèi)特定

29、的位點(diǎn)被切開，形成5-磷酸基和3-OH，其中5-磷酸基與Tyr-OH以磷酸酯鍵相連。 (2) 兩個切點(diǎn)之間發(fā)生轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，即一個切點(diǎn)上的3-OH親核進(jìn)攻另一個切點(diǎn)上的5-磷酸基與Tyr 形成的酯鍵，重新形成3, 5-磷酸二酯鍵，從而形成Hollida連接，使兩個雙鏈分子中各自的一條鏈發(fā)生了交換。 (3) 在短距離(一般68bp)的交叉點(diǎn)遷移后，另外兩個酶分子在2個DNA分子上的另一條鏈上產(chǎn)生切口，反應(yīng)機(jī)理同(1)；(4) 反應(yīng)機(jī)理同(2)，通過連接反應(yīng)，使兩個雙鏈分子中各自的另一條鏈發(fā)生了交換。 6.2.2 噬菌體噬菌體DNA的整合與切除的整合與切除 噬菌體與宿主的特異重組位點(diǎn)稱附著位點(diǎn)(att

30、achment site, att)。通過刪除實(shí)驗(yàn)的研究，確定噬菌體的附著位點(diǎn)attP長度為240bp，細(xì)菌的附著位點(diǎn)attB只有23bp，二者共同的核心序列(O區(qū))為15bp。attP的序列以POP表示，attB位點(diǎn)以BOB表示。整合需要的重組酶(recombinase)由噬菌體編碼，稱整合酶( integrase, INT)，此外還需要由宿主編碼的整合宿主因子(integration host factor, IHF) 參與。整合酶作用于POP 和BOB序列，分別交錯7bp將兩DNA分子切開，然后再交互連接，噬菌體DNA被整合，其兩側(cè)形成新的重組附著位點(diǎn)attL和attR。此過程不需要水解

31、ATP提供能量，因?yàn)檎厦傅淖饔脵C(jī)制類似于拓?fù)洚悩?gòu)酶I，它催化磷酸基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，而不是水解反應(yīng)，故無能最丟失。在切除反應(yīng)中，需要將原噬菌休兩側(cè)附著位點(diǎn)聯(lián)結(jié)到一起，除INT 和IHF外，還需要噬菌體編碼的切除酶（excision enzyme，XIS）參與(圖6-12)。 6.2.3 細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組鼠傷寒沙門氏桿菌(Sahnunella typhinnurium)的鞭毛蛋白有兩種，分別為FljC鞭毛蛋白和FljB鞭毛蛋白。同一個細(xì)菌不會同時(shí)具有兩種鞭毛蛋白，但從單菌落的沙門氏菌中經(jīng)常能出現(xiàn)少數(shù)呈另一鞭毛蛋白的細(xì)菌細(xì)胞，這種現(xiàn)象稱為鞭毛相轉(zhuǎn)變。遺傳分析表明，這一轉(zhuǎn)變是由一段99

32、5bp的DNA，稱為H片段(H segment)發(fā)生倒位引起的，其詳細(xì)機(jī)制將在第11章介紹。噬菌體Mu的G片段和噬菌體P1的C片段，分別由倒位酶Gin和Cin控制發(fā)生倒位，并決定噬菌體的宿主范圍，其作用機(jī)制與沙門氏菌鞭毛相轉(zhuǎn)變類似。Hin, Gin和Cin與轉(zhuǎn)座子Tn3解離酶結(jié)構(gòu)同源，屬于同一家族。 IgG的分子結(jié)構(gòu)6.2.4 免疫球蛋白基因的免疫球蛋白基因的V(D)J重組重組 免疫球蛋白(Ig)是B 淋巴細(xì)胞合成和分泌的，由兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)組成。IgH和IgL 的氨基端氨基酸序列因Ig的抗原結(jié)合特異性不同而變化，稱可變區(qū)(V)，可結(jié)合抗原，決定Ig 抗原結(jié)合特異性。羧基端是恒定

33、區(qū)(C)，具有結(jié)合補(bǔ)體、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等特性，介導(dǎo)Ig 的生物學(xué)功能。 FamilyV GenesC GenesManMouseManMouseLambda64Kappa100098編碼Ig 的基因有多個區(qū)域組成，IgH 基因由可變區(qū)(V)，多樣性片段(D)，連接片段(J)，和恒定區(qū)(C)片段組成。其中V, D, J編碼V區(qū)， IgL由V, J, C片段組成。在胚系細(xì)胞中，染色體上的V, D, J基因片段互相分離，各自的多個基因片段可在重組時(shí)形成不同的組合，在完成重組之前，無轉(zhuǎn)錄活性。在B細(xì)胞發(fā)育過程中，V, D和J通過重組連在一起，形成Ig的轉(zhuǎn)錄單位。 V(D)J重組是B細(xì)胞特有的，

34、決定了Ig表達(dá)的B細(xì)胞特異性。不同V, D, J 基因片段的組合形成了免疫球蛋白V區(qū)的多樣性。例如，人類IgH基因、Ig基因和Ig基因各自有大約300個V片段，但多數(shù)是失活的假基因。按照有活性的基因片段估算，人類IgH基因大約有51個V，27個D和6個J，可產(chǎn)生51 27 6 = 8262種組合。Ig基因有40個V和5個J，可形成40 5 = 200種組合，Ig基因有30個V和4個J，可形成304 = 120種組合。IgH與IgL的組合可達(dá)8262 (200 + 120) = 2.64 106 種組合。因此，免疫球蛋白的V(D)J重組是產(chǎn)生抗體多樣性的主要機(jī)制。 RSS 包括兩個含回文結(jié)構(gòu)的七

35、聚體(Heptamer)堿基序列，兩個九聚體(Nonamer)堿基序列和中間的12或23 bp的間隔(圖6-14)。具有12 bp間隔的RSS只能與23 bp間隔的RSS重組，稱12/23規(guī)則。這一規(guī)則的限制，保證了在IgH重組中，D基因片段只與J 基因片段重組，V 基因片段與D 基因片段重組。 免疫球蛋白的V(D)J重組有高度的序列特異性，在每個V, D 和J 基因片段的兩側(cè)都有高度保守的重組信號序列(recombination signal sequences, RSS)。免疫球蛋白進(jìn)行V(D)J重組時(shí)，首先，由重組激活基因1/2(recombination activating gene

36、-1/2)表達(dá)的重組激活酶1/重組激活酶2復(fù)合體(RAG1/RAG2)與RSS結(jié)合。接著，復(fù)合體使編碼序列與重組信號序列之間的雙連斷裂，編碼序列的末端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。隨后，RSS形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)并脫離復(fù)合體。連接位點(diǎn)經(jīng)過切割加工，形成兩個黏性末端。最后，由DNA依賴性蛋白激酶(DNA-PK)和DNA連接酶填補(bǔ)缺口，連接切口，完成重組。由于在連接前連接位點(diǎn)可以進(jìn)行多樣化的切割加工，進(jìn)一步增加了免疫球蛋白的多樣性。 在不同的核苷酸位點(diǎn)重組可以生成不同的蛋白質(zhì)6.3 轉(zhuǎn)座重組轉(zhuǎn)座重組6.3.1 轉(zhuǎn)座子的概念轉(zhuǎn)座子的概念 轉(zhuǎn)座重組轉(zhuǎn)座重組(transposition recombination)指DNA上的

37、核苷酸序列從一個位置轉(zhuǎn)移到另外一個位置的現(xiàn)象。發(fā)生轉(zhuǎn)座的DNA片段被稱為轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子(transposons)或可移位的遺傳元件(mobile genetic elements, MGE)，有時(shí)還被稱為跳躍基因跳躍基因(jump gene)。 轉(zhuǎn)座子的主要特征有： 能從染色體的一個位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一個位點(diǎn)，或轉(zhuǎn)移到另一個染色體。 不能像噬菌體或質(zhì)粒那樣獨(dú)立存在。 轉(zhuǎn)座子編碼其自身的轉(zhuǎn)座酶，移動時(shí)攜帶轉(zhuǎn)座必需的基因一起躍遷。 轉(zhuǎn)座的頻率很低，且插入是隨機(jī)的，不依賴于轉(zhuǎn)座子(供體)和靶位點(diǎn)(受體)之間的序列同源性。轉(zhuǎn)座子最初是Barbara McClintock于1940年代在玉米的遺傳學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)的

38、，當(dāng)時(shí)稱為控制元件(controlling element)。該發(fā)現(xiàn)當(dāng)時(shí)并沒有引起重視，直到1960年代后期，在不同實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)一系列可轉(zhuǎn)移的抗藥性轉(zhuǎn)座子，才重新引起人們重視。1983年McClintock被授予諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎，距離她公布玉米控制因子的時(shí)間已有32年之久。 轉(zhuǎn)座重組可引起基因組內(nèi)核苷酸序列發(fā)生轉(zhuǎn)移、缺失、倒位或重復(fù)，從而導(dǎo)致突變，也可能改變基因組DNA的量。如果轉(zhuǎn)座子插入一個基因的內(nèi)部，很可能導(dǎo)致基因的失活，如果是重要的基因則可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。如果插入一個基因的上游，可以影響基因的轉(zhuǎn)錄活性。此外，轉(zhuǎn)座子本身還可能充當(dāng)同源重組系統(tǒng)的底物，原因是在1個基因組內(nèi)，雙拷貝的同一種轉(zhuǎn)

39、座子提供了同源重組所必需的同源序列?，F(xiàn)在已知，轉(zhuǎn)座子在生物體內(nèi)是普遍存在的，基因組序列分析結(jié)果表明，人、小鼠和水稻的基因組有40左右的序列由轉(zhuǎn)座子衍生而來，但在低等的真核生物和細(xì)菌內(nèi)的比例較小，約占1%5。這說明轉(zhuǎn)座子在生物從低等到高等的基因組進(jìn)化過程中曾發(fā)揮過十分重要的作用。人類基因組中的不少轉(zhuǎn)座子序列與疾病有關(guān)，研究轉(zhuǎn)座子可以使我們從分子水平上認(rèn)知許多尚未弄清楚的生物學(xué)問題。6.3.2 原核生物的轉(zhuǎn)座子原核生物的轉(zhuǎn)座子 原核生物的轉(zhuǎn)座子最早是在E.coli的半乳糖操縱子內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，迄今為止，在細(xì)菌內(nèi)已發(fā)現(xiàn)四類轉(zhuǎn)座子。6.3.2.1 第一類轉(zhuǎn)座子第一類轉(zhuǎn)座子第一類轉(zhuǎn)座子是最簡單的轉(zhuǎn)座元件，能夠

40、從DNA的一個位點(diǎn)插入到另一個位點(diǎn)，因此，被稱作插入序列插入序列(insertion sequences, IS)，其特征如圖6-16所示。(1) 長度較小，通常在700 bp800 bp之間，兩端有10 bp40 bp長的反向重復(fù)序列IR，左邊的是IRL，右邊的是IRR。IRL和IRR的序列非常相似，但不一定完全相同。有少數(shù)IS (如IS91)沒有IR序列，通過滾環(huán)復(fù)制和插入方式進(jìn)行轉(zhuǎn)座。(2) 內(nèi)部一般只有一個基因，其表達(dá)產(chǎn)物是專門催化轉(zhuǎn)座反應(yīng)的轉(zhuǎn)座酶(transposase, tnpA)。轉(zhuǎn)座酶的量受到嚴(yán)格的調(diào)控，它是決定轉(zhuǎn)座頻率的主要因素。(3) 通過剪切和插入的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)座，經(jīng)過填補(bǔ)

41、缺口和連結(jié)切口，會增加一個拷貝的靶位點(diǎn)序列，完成轉(zhuǎn)座后，插入序列兩側(cè)各有一個靶位點(diǎn)序列，呈正向重復(fù)。 IS類別長度(bp)IR長度(bp)靶位點(diǎn)長度(bp)染色體上的拷貝數(shù)F質(zhì)粒上的拷貝數(shù)IS176820/23958IS2132732/41551IS3125839/39352IS4142616/1811, 12或141或2IS5119515/164豐富IS10R132917/229表表6-1 E.coli中常見的插入序列中常見的插入序列6.3.2.2 第二類轉(zhuǎn)座子第二類轉(zhuǎn)座子 第二類轉(zhuǎn)座子又稱為復(fù)雜型轉(zhuǎn)座子復(fù)雜型轉(zhuǎn)座子(complex transposon)，其長度較大，通常2.5kb20kb

42、，兩側(cè)含有35 bp40 bp的IR序列。內(nèi)部一般有多個基因，常見的結(jié)構(gòu)基因tnpA編碼轉(zhuǎn)座酶，tnpR編碼的解離酶可使轉(zhuǎn)座子與受體DNA形成的共整合體重組和解離，還可以作為阻遏蛋白調(diào)節(jié)tnpA和tnpR兩個基因的表達(dá)。此外，有一個或幾個特定的抗生素抗性基因(resistance gene)。轉(zhuǎn)座可導(dǎo)致靶位點(diǎn)重復(fù)。res為解離的控制位點(diǎn)，TnpR蛋白結(jié)合于其上發(fā)揮調(diào)控作用。復(fù)雜型轉(zhuǎn)座子的靶序列為5bp，轉(zhuǎn)座導(dǎo)致靶位點(diǎn)序列發(fā)生重復(fù)，結(jié)果在轉(zhuǎn)座子兩側(cè)形成正向重復(fù)序列。圖6-17為Tn3(TnA家族)的結(jié)構(gòu)，表6-2列出了幾種常見第二類轉(zhuǎn)座子的特征。轉(zhuǎn)座子抗性標(biāo)記長度(bp)IR長度(bp)Tnl青

43、霉素4 957Tn3青霉素4 95738Tn501Hg抗性8 20038Tn7甲氧芐氨嘧啶、壯觀霉素、鏈霉素14 00035表表6-2 幾種第二類轉(zhuǎn)座子的特征幾種第二類轉(zhuǎn)座子的特征6.3.2.3 第三類轉(zhuǎn)座子第三類轉(zhuǎn)座子第三類轉(zhuǎn)座子又名復(fù)合型轉(zhuǎn)座子復(fù)合型轉(zhuǎn)座子(composite transposon)，由2個IS和一段帶有抗生素抗性的間插序列組合而成，其中的2個IS位于轉(zhuǎn)座子的兩側(cè)，具有相同或相反的方向。每一個IS具有典型的第一類轉(zhuǎn)座子的特征，可能獨(dú)立轉(zhuǎn)座，也可能與間插序列一道作為一個整體進(jìn)行轉(zhuǎn)座。圖6-18為Tn10的結(jié)構(gòu)，表6-3列出了幾種常見第二類轉(zhuǎn)座子的特征。 表表6-3 幾種第三類

44、轉(zhuǎn)座子的特征幾種第三類轉(zhuǎn)座子的特征轉(zhuǎn)座子抗性基因長度(bp)插入序列Tn5抗卡那霉素(KanR)5 700IS50Tn9抗氯霉素(CmR)2 638IS1Tn10抗四環(huán)素(TetR)9 300IS106.3.2.4 第四類轉(zhuǎn)座子第四類轉(zhuǎn)座子第四類轉(zhuǎn)座子的典型例子是Mu噬菌體(Bacteriophage Mu)，它是E.coli的一種溫和噬菌體，具有裂解和溶源生長周期。Mu噬菌體的DNA可以通過轉(zhuǎn)座的方式隨機(jī)整合到宿主DNA中，還可以通過復(fù)制型轉(zhuǎn)座，隨機(jī)插入到宿主DNA的其他區(qū)域，它容易誘發(fā)宿主細(xì)胞的各種突變，因此被稱為突變子(mutator)，其名稱Mu是mutator的縮寫。Mu噬菌體DNA

45、為38 kb的線性雙鏈，兩側(cè)缺乏IR序列，在其基因組的20多個基因中，只有A基因和B基因與轉(zhuǎn)座有關(guān)。其中A基因編碼的MuA為轉(zhuǎn)座酶，B基因編碼的MuB為ATP酶，可以促進(jìn)MuA的活性。MuB還可通過與MuA的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，阻止MuB結(jié)合到已經(jīng)與MuA結(jié)合的DNA區(qū)域的附近，使Mu噬菌體周圍的DNA不易成為Mu轉(zhuǎn)座子的靶點(diǎn)，這種現(xiàn)象稱轉(zhuǎn)座目標(biāo)免疫(transposition target immunity)。一些其它轉(zhuǎn)座子也存在轉(zhuǎn)座目標(biāo)免疫，如Tn3和Tn7的轉(zhuǎn)座目標(biāo)免疫范圍超過100kb。也許，轉(zhuǎn)座目標(biāo)免疫有利于轉(zhuǎn)座子的生存和繁衍。Mu噬菌體的靶位點(diǎn)序列為5bp，轉(zhuǎn)座可引起靶位點(diǎn)序列

46、產(chǎn)生正向重復(fù)。 6.3.3 真核生物的轉(zhuǎn)座子真核生物的轉(zhuǎn)座子現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在真核生物有多種形式的轉(zhuǎn)座子，說明轉(zhuǎn)座是真核生物極為普遍的現(xiàn)象。根據(jù)轉(zhuǎn)座方式可將真核生物的轉(zhuǎn)座子分為兩大類，其一是以DNA-DNA方式轉(zhuǎn)座的轉(zhuǎn)座子，稱DNA轉(zhuǎn)座子(DNA transposons)。其二是以DNA-RNA方式轉(zhuǎn)座的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，稱逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(retrotransposable elements)，逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子將在下一節(jié)介紹。DNA轉(zhuǎn)座子可分為自主型、非自主型和微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件3種類型，其共同特點(diǎn)是都具有兩個末端反向重復(fù)序列。自主(autonomous)元件編碼具有功能的轉(zhuǎn)座酶等產(chǎn)物, 所以自身能夠轉(zhuǎn)座。

47、 而非自主(non-autonomous)元件是自主元件中間部分序列缺失后形成的, 只有在自主元件存在時(shí)才能轉(zhuǎn)座。自主元件與非自主元件通常以一個轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的形式存在于基因組中, 拷貝數(shù)一般較少, 少則幾個, 多則數(shù)百個, 這與反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子明顯不同，目前發(fā)現(xiàn)的自主元件/非自主元件主要隸屬兩個超家族。 hAT 超家族是Warren等于1994 年發(fā)現(xiàn)的3個該類轉(zhuǎn)座子(hobo、Ac 和 Tam3) 的第1個字母命名的，包括玉米的Ac/Ds轉(zhuǎn)座系統(tǒng)和金魚草的Tam3轉(zhuǎn)座子等。其特征是： 在轉(zhuǎn)座過程中產(chǎn)生8 bp的靶位點(diǎn)重復(fù)。 有527 bp的短反向末端重復(fù)。 大多數(shù)hAT類轉(zhuǎn)座子小于4 kb。 CAC

48、TA超家族最典型的特征是具有長1028 bp的末端反向重復(fù), 其末端是保守的CACTA，是轉(zhuǎn)座酶的識別位點(diǎn)。該類轉(zhuǎn)座子包括玉米的En/Spm轉(zhuǎn)座系統(tǒng)和高粱的Candystripe轉(zhuǎn)座子等，最早發(fā)現(xiàn)CACTA轉(zhuǎn)座子是水稻的Tnr3 ，是作為插入片段被鑒定出來的，大小為1539bp，并有13 bp的反向末端重復(fù)。微小反向重復(fù)轉(zhuǎn)座子(miniature inverted repeat transposableelement, MITEs)是Bureau等于1994首先發(fā)現(xiàn)的，MITEs具有IR，不編碼轉(zhuǎn)座酶，為非自主DNA類轉(zhuǎn)座子，其序列小(一般為100500 bp)且拷貝高, 具有插入位點(diǎn)偏愛性。

49、MITEs具有反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子所具有的高拷貝特點(diǎn), 如玉米mPIF 元件的拷貝數(shù)超過6000，水稻基因組中的MITEs大約有90 000個。 6.3.3.1 玉米的控制因子玉米的控制因子玉米的激活-解離系統(tǒng)(activator-dissociation system, Ac-Ds)是McClintock最先發(fā)現(xiàn)的，Ac表示激活子元件(activator element)，屬于自主型轉(zhuǎn)座子，約有4563 bp，兩端是11 bp的IR序列，帶有全功能的轉(zhuǎn)座酶基因。Ds表示解離元件(dissociation element)，屬于非自主型轉(zhuǎn)座子，兩端也是11 bp的IR序列，但中間只有缺失的，無功能的轉(zhuǎn)

50、座酶基因，它實(shí)際上是Ac經(jīng)由不同的缺失突變而來的, 由于缺失的程度不同, 就形成了不同的Ds 轉(zhuǎn)座子。由于Ds不能合成轉(zhuǎn)座酶，所以單獨(dú)不能移座，只有Ac存在時(shí)Ds才會移座。 玉米種子的顏色由紫色色素基因C決定。如果Ac或Ds插入到C基因(color gene)內(nèi)部，則紫色色素基因失活，于是玉米籽粒不能產(chǎn)生紫色色素，而成為黃色。如果Ds從C離開，C基因能夠正常表達(dá)，玉米籽粒又變成紫色。如果Ac本身跳開，使Ds遠(yuǎn)離Ac，則處于C基因的Ds不再受Ac的控制，玉米籽粒依然為黃色。Ac和Ds在染色體上的跳動十分活躍，若在一粒玉米的發(fā)育過程中，由于體細(xì)胞中Ds的轉(zhuǎn)座，使部分細(xì)胞的C基因中含有Ds，另一部分

51、細(xì)胞的C基因中沒有Ds，玉米籽粒便出現(xiàn)了黃色和藍(lán)色的斑斑點(diǎn)點(diǎn)。 抑制-促進(jìn)-增變系統(tǒng) (suppressor-promoter-mutator, Spm)，即Spm-dSpm也是玉米轉(zhuǎn)座因子的系統(tǒng)之一。其Spm是自主性因子，又稱增強(qiáng)因子，長8287bp，末端IR為13bp，靶位點(diǎn)為8bp的正向重復(fù)，中間有2個可讀框，含3個內(nèi)含子。它能以激活型、鈍化型和程序型3種形式存在，具有轉(zhuǎn)座、整合和解離活性。dSpm是非自主性因子，又稱抑制因子，由Spm缺失而形成，長度不等，末端IR為13bp，靶位點(diǎn)為8bp正向重復(fù)。Spm-dSpm在功能上與Ac-Ds系統(tǒng)相似，可引起基因的插入突變，影響結(jié)構(gòu)基因表達(dá)，解

52、離后形成回復(fù)突變。此外，Spm-dSpm還能導(dǎo)致染色體斷裂。 Genetic recombination events fall into at least three general classes. Homologous genetic recombination (also called general recombination) involves genetic exchanges between any two DNA molecules (or segments of the same molecule) that share an extended region of near

53、ly identical sequence. The actual sequence of bases is irrelevant, as long as it is similar in the two DNAs. In site-specific recombination, the exchanges occur only at a particular DNA sequence. DNA transposition is distinct from both other classes in that it usually involves a short segment of DNA

54、 with the remarkable capacity to move from one location in a chromosome to another. These “jumping genes” were first observed in maize in the 1940s by Barbara McClintock. 6.3.3.2 果蠅的果蠅的p因子和雜種不育因子和雜種不育 p因子是在對果蠅雜種不育(hybrid dysgenesis)的研究中發(fā)現(xiàn)的，是黑腹果蠅的一種自主性轉(zhuǎn)座因子。黑腹果蠅的P品系中含有4050個P因子，而M品系則不含p因子。P因子具有31bp反向末端

55、重復(fù)，中間是轉(zhuǎn)座酶，在轉(zhuǎn)座的靶DNA部位產(chǎn)生8bp的正向重復(fù)。最長的p因子大約2.9kb，有4個可讀框。優(yōu)先的靶位點(diǎn)是GGCCAGAC。約2/3的p因子是缺陷型的，因中間序列有不同程度的缺失，而成為非自主因子。轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)座酶p因子的mRNA前體在體細(xì)胞和生殖細(xì)胞中剪接方式不同，體細(xì)胞的剪接保留了第3個內(nèi)含子。原因是有一種蛋白質(zhì)結(jié)合在第3個內(nèi)含子上，阻止該內(nèi)含子的剪接。翻譯過程在第3個內(nèi)含子處中斷，產(chǎn)物是一個Mr為66000的蛋白質(zhì)，它是轉(zhuǎn)座反應(yīng)的阻遏蛋白。而在生殖細(xì)胞中可以剪接除去包括內(nèi)含子3在內(nèi)的全部內(nèi)含子，翻譯產(chǎn)物是Mr為87000的轉(zhuǎn)座酶。Hybrid dysgenesis is asym

56、metrical; it is induced by P male M female crosses, but not by M male P female crosses.若M雄性與M雌性果蠅交配，二者均不攜帶P因子，當(dāng)然無P因子轉(zhuǎn)座，不會造成后代不育。若P雄性或M雄性與P雌性果蠅交配，因P雌性果蠅卵細(xì)胞中存在轉(zhuǎn)座反應(yīng)阻遏蛋白，陰遏P因子的轉(zhuǎn)座，也不會造成后代不育。當(dāng)p雄性與M雌性果蠅交配時(shí)，子代體細(xì)胞中存在轉(zhuǎn)座反應(yīng)阻遏蛋白，細(xì)胞正常，因而果蠅可以生存。但生殖細(xì)胞則存在p因子，和Mr為87000的轉(zhuǎn)座酶，轉(zhuǎn)座十分活躍。由于轉(zhuǎn)座因子插入新的位點(diǎn)可引起突變，而原來位置失去轉(zhuǎn)座因子也要造成染色體斷

57、裂，造成生殖細(xì)胞發(fā)育不全，因而無生育能力。 6.3.3.3 脊椎動物的脊椎動物的DNA轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子脊椎動物的DNA轉(zhuǎn)座子可分為4種類型。(1) DDE轉(zhuǎn)座子 其轉(zhuǎn)座酶含有保守的天冬氨酸(D)-天冬氨酸(D)-谷氨酸(E)三聯(lián)體，因而得名。DDE轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)較簡單，只由轉(zhuǎn)座酶基因和兩側(cè)的反向重復(fù)序列組成，其中的DDE三聯(lián)體可以與轉(zhuǎn)座酶催化作用所必需的金屬離子形成配位鍵(圖6-21a)。DDE轉(zhuǎn)座子與逆轉(zhuǎn)錄病毒或逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子編碼的整合酶有關(guān)，整合酶的作用是將DDE轉(zhuǎn)座子從原來的位置切割下來，通過剪切-黏接轉(zhuǎn)座(cun and paste transposition)整合到新的靶位點(diǎn)。 (2) Hel

58、itrons Helitron是新近被鑒定出的一類DNA類轉(zhuǎn)座子，兩端無IR序列，在轉(zhuǎn)座以后，也不會使靶位點(diǎn)序列發(fā)生重復(fù)。Helitron總是以5-TC開始，3-CTRR結(jié)束(R表示嘌呤堿基)。在CTRR序列的上游有一段16nt20nt長的無保守性的回文序列，可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。Helitron內(nèi)部的基因可能只有1個(如來源于線蟲的)，也可能含有2個3個(如來源于擬南芥和亞洲栽培稻的)。其基因編碼的蛋白質(zhì)一般含有53 解鏈酶和核酸酶或連接酶的結(jié)構(gòu)域， Helitron名稱的前四個字母來自于解鏈酶。如圖6-21b所示，脊椎動物Helitron的開放閱讀框包括ssDNA-結(jié)合復(fù)制蛋白A樣結(jié)構(gòu)域(ssD

59、NA-binding replication protein A-like domain, RPA)、鋅指結(jié)構(gòu)域(zinc finger, Zf)、滾環(huán)復(fù)制起始子- DNA解旋酶(rolling-circle replication initiator and DNA helicase, REP-HEL)，和無嘌呤/無嘧啶樣內(nèi)切核酸酶(apurinic/apyrimidinic-like endonuclease, APE)。Helitron的轉(zhuǎn)座方式是以滾環(huán)復(fù)制的方式進(jìn)行復(fù)制，然后再插入到靶位點(diǎn)。 (3) Mavericks/Polintons 這類轉(zhuǎn)座子兩端有IR序列，可以編碼整合酶(in

60、tegrase, IN)，旁邊的閱讀框可以編碼幾種類似于噬菌體和真核生物的雙鏈DNA病毒的蛋白質(zhì)，包括ATP酶(?)、卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(coiled-coil domain, CC)、蛋白酶(protease, PR)、B類DNA聚合酶(type B DNA polymerase, B-POL)和衣殼蛋白類似物(圖6-21c)。這類轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機(jī)制可能是在染色體外用其編碼的聚合酶復(fù)制，隨后再用整合酶插入受體位點(diǎn)。(4) 微小反向重復(fù)轉(zhuǎn)座子 脊椎動物也含有MITEs，長度較小，兩端有反向重復(fù)序列，中間的序列沒有編碼區(qū)。MITEs為非自主轉(zhuǎn)座子，可以利用自主元件的轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行轉(zhuǎn)座(圖6-21d)。 6