課題2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)3

1、微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用一、課題目標(biāo)一、課題目標(biāo) 研究培養(yǎng)基對微生物的選擇作用，研究培養(yǎng)基對微生物的選擇作用，進(jìn)行微生物數(shù)量的測定。進(jìn)行微生物數(shù)量的測定。 二、課題重點(diǎn)與難點(diǎn)二、課題重點(diǎn)與難點(diǎn) 重點(diǎn)重點(diǎn)： 對土樣的選取和選擇培養(yǎng)基的配制。對土樣的選取和選擇培養(yǎng)基的配制。難點(diǎn)：難點(diǎn)： 對分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)。對分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)。三、研究思路三、研究思路 微生物的微生物的選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)，是指利用培，是指利用培養(yǎng)基的組成使適宜生長的特定微生物養(yǎng)基的組成使適宜生長的特定微生物得到較快繁殖的技術(shù)，也稱為微生物得到較快繁殖的技術(shù)，也稱為微生物的的“選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)”。 （一）篩選菌株（一

2、）篩選菌株 在本課題提供的選擇培養(yǎng)基的配方中，在本課題提供的選擇培養(yǎng)基的配方中，尿素是培養(yǎng)基中的尿素是培養(yǎng)基中的惟一氮源惟一氮源，因此，原則，因此，原則上只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長。上只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長。但實(shí)際上，微生物的培養(yǎng)是一個(gè)非常復(fù)雜但實(shí)際上，微生物的培養(yǎng)是一個(gè)非常復(fù)雜的問題，有些微生物可以利用其他微生物的問題，有些微生物可以利用其他微生物的代謝產(chǎn)物生長繁殖，因此能夠在選擇培的代謝產(chǎn)物生長繁殖，因此能夠在選擇培養(yǎng)基上生長的微生物不一定是所需要的微養(yǎng)基上生長的微生物不一定是所需要的微生物，還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。生物，還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。（二）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目（二）統(tǒng)計(jì)菌落

3、數(shù)目 統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的理論依據(jù)是：統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的理論依據(jù)是：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長的一個(gè)菌落，來源于樣品稀釋液中面生長的一個(gè)菌落，來源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。因此，恰當(dāng)?shù)南♂尪仁浅晒Φ囊粋€(gè)活菌。因此，恰當(dāng)?shù)南♂尪仁浅晒Φ亟y(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的關(guān)鍵。為了保證結(jié)果準(zhǔn)地統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的關(guān)鍵。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，通常將幾個(gè)稀釋度下的菌液都涂布在確，通常將幾個(gè)稀釋度下的菌液都涂布在平板上，培養(yǎng)后再選擇菌落數(shù)在平板上，培養(yǎng)后再選擇菌落數(shù)在3030300300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。 1. 1.想一想，如何從平板上的菌落數(shù)推測出想一想，如何從平板上的菌落數(shù)推測出每

4、克樣品中的菌落數(shù)？每克樣品中的菌落數(shù)？答：統(tǒng)計(jì)某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，答：統(tǒng)計(jì)某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，最好能統(tǒng)計(jì)最好能統(tǒng)計(jì)3 3個(gè)平板，計(jì)算出平板菌落數(shù)的平個(gè)平板，計(jì)算出平板菌落數(shù)的平均值，然后按課本旁欄的公式進(jìn)行計(jì)算。均值，然后按課本旁欄的公式進(jìn)行計(jì)算。a a同學(xué)的結(jié)果與其他同學(xué)不同，可能同學(xué)的結(jié)果與其他同學(xué)不同，可能的解釋有兩種。的解釋有兩種。一是由于土樣不同一是由于土樣不同；二是由于培養(yǎng)基污染或操作失誤二是由于培養(yǎng)基污染或操作失誤。 （三）設(shè)置對照（三）設(shè)置對照究竟是哪個(gè)原因，可以通過實(shí)驗(yàn)來證明。究竟是哪個(gè)原因，可以通過實(shí)驗(yàn)來證明。另一種方案另一種方案：將將a a同學(xué)配制的培養(yǎng)基

5、在不加土樣的情況同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。通過這個(gè)事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)否受到污染。通過這個(gè)事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。實(shí)驗(yàn)方案有兩種實(shí)驗(yàn)方案有兩種一種方案一種方案：可以由其他同學(xué)用與可以由其他同學(xué)用與a a同學(xué)一樣的土樣進(jìn)同學(xué)一樣的土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如果結(jié)果與行實(shí)驗(yàn)，如果結(jié)果與a a同學(xué)一致，則證明同學(xué)一致，則證明a a無無誤；如果結(jié)果不同，則證明誤；如果結(jié)果不同，則證明a a同學(xué)存在操作失同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。誤或培

6、養(yǎng)基的配制有問題。四、實(shí)驗(yàn)案例四、實(shí)驗(yàn)案例 實(shí)驗(yàn)的具體操作步驟如下實(shí)驗(yàn)的具體操作步驟如下: : 1.1.土壤取樣土壤取樣 從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土表層土3 cm3 cm左右，再取樣，將樣品裝入事左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。先準(zhǔn)備好的信封中。土壤中某樣品細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)土壤中某樣品細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù) 準(zhǔn)備準(zhǔn)備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和和選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基將菌將菌液稀釋相同的倍數(shù)，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生液稀釋相同的倍數(shù)，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)目應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，長的菌落數(shù)目應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)

7、目，因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為對照對照，用來，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。由于初次判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。由于初次實(shí)驗(yàn)，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一實(shí)驗(yàn)，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個(gè)較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為個(gè)較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為10103 310107 7。每個(gè)。每個(gè)稀釋度下需要稀釋度下需要3 3個(gè)個(gè)選擇培養(yǎng)基，選擇培養(yǎng)基，1 1個(gè)牛肉膏蛋白胨個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，因此共需要培養(yǎng)基，因此共需要1515個(gè)選擇培養(yǎng)基，個(gè)選擇培養(yǎng)基，5 5個(gè)牛肉個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。此外，還需要準(zhǔn)備膏蛋白胨培養(yǎng)基。此外，還需要準(zhǔn)備8

8、 8個(gè)個(gè)滅菌的試滅菌的試管和管和1 1個(gè)個(gè)滅菌的移液管。滅菌的移液管。 2.2.制備培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基 將將10 g10 g土樣加入盛有土樣加入盛有90 ml90 ml無菌生理無菌生理鹽水的錐形瓶中（錐形瓶體積為鹽水的錐形瓶中（錐形瓶體積為250 ml250 ml），），充分搖勻，吸取上清液充分搖勻，吸取上清液1 ml1 ml，轉(zhuǎn)移至盛有，轉(zhuǎn)移至盛有9 9 mlml的生理鹽水的無菌大試管中，依次等比的生理鹽水的無菌大試管中，依次等比稀釋至稀釋至10107 7稀釋度，并按照由稀釋度，并按照由10107 710103 3稀釋稀釋度的順序分別吸取度的順序分別吸取0.1 ml0.1 ml進(jìn)行平板涂布操進(jìn)

9、行平板涂布操作。按照濃度從低到高的順序涂布平板，不作。按照濃度從低到高的順序涂布平板，不必更換移液管。必更換移液管。 3.3.微生物的培養(yǎng)與觀察微生物的培養(yǎng)與觀察 將涂布好的培養(yǎng)皿放在將涂布好的培養(yǎng)皿放在30 30 溫度下培養(yǎng)。溫度下培養(yǎng)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，會有不同的菌落產(chǎn)生。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，會有不同的菌落產(chǎn)生。 比較牛肉膏培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基中菌落的比較牛肉膏培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基中菌落的數(shù)量、形態(tài)等，并做好記錄。數(shù)量、形態(tài)等，并做好記錄。 挑選選擇培養(yǎng)基中不同形態(tài)的菌落接入含挑選選擇培養(yǎng)基中不同形態(tài)的菌落接入含酚紅酚紅培養(yǎng)基的斜面中，觀察能否產(chǎn)生如課本中培養(yǎng)基的斜面中，觀察能否產(chǎn)生如課本中

10、圖圖2-102-10的顏色反應(yīng)。的顏色反應(yīng)。為什么分離不同的微生物要采用不同的為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細(xì)菌的總量和測定土壤中稀釋度？測定土壤中細(xì)菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？同嗎？ 答：這是因?yàn)橥寥乐懈黝愇⑸锏臄?shù)量（單答：這是因?yàn)橥寥乐懈黝愇⑸锏臄?shù)量（單位：株位：株/kg/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上）是不同的，例如在干旱土壤中的上層樣本中：層樣本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為數(shù)約為2 1852 185萬，萬，放線菌數(shù)放線菌數(shù)約為約為477477萬，萬，霉菌數(shù)霉菌

11、數(shù)約為約為23.123.1萬。因此，萬。因此，為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有針對性地提供選擇培度進(jìn)行分離，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。養(yǎng)的條件。 4. 4.細(xì)菌的計(jì)數(shù)細(xì)菌的計(jì)數(shù) 當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)，選取菌落數(shù)當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)，選取菌落數(shù)在在3030300300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。在同一的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。在同一稀釋度下，至少對稀釋度下，至少對3 3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求出平均值，并根據(jù)平板所數(shù)，然后求出平均值，并根據(jù)平板所對應(yīng)的稀釋度計(jì)算出樣品中細(xì)菌的數(shù)對應(yīng)的稀釋度計(jì)算出樣品中細(xì)菌的數(shù)目。目。

12、關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。 關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。 關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。 關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。

13、關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。 五、操作提示五、操作提示 無菌操作無菌操作 做好標(biāo)記做好標(biāo)記 規(guī)劃時(shí)間規(guī)劃時(shí)間 六、課題成果與評價(jià)六、課題成果與評價(jià) （一）培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以（一）培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落 對照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中沒有菌對照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于選擇牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于選擇培養(yǎng)基的數(shù)目培養(yǎng)基的數(shù)

14、目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。出一些菌落。伊紅伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基美藍(lán)培養(yǎng)基是鑒別培養(yǎng)基，可以是鑒別培養(yǎng)基，可以用來檢測自來水中的大腸桿菌是否超標(biāo)，因用來檢測自來水中的大腸桿菌是否超標(biāo)，因?yàn)榈臑榈拇x產(chǎn)物與伊紅代謝產(chǎn)物與伊紅美藍(lán)結(jié)合美藍(lán)結(jié)合，使菌落呈，使菌落呈深紫色并帶有金屬光澤深紫色并帶有金屬光澤，使大腸桿菌的菌落，使大腸桿菌的菌落顯示出來，并沒有促進(jìn)大腸桿菌的生長和抑顯示出來，并沒有促進(jìn)大腸桿菌的生長和抑制其他微生物的生長。制其他微生物的生長。例如：鑒別大腸桿菌培養(yǎng)基例如：鑒別大腸桿菌培養(yǎng)基大腸桿菌呈大腸桿菌呈 黑色中心黑色中心 , ,有或無金屬光澤有或無金屬光澤大腸

15、桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂(emb)(emb)上典型特征上典型特征 如果學(xué)生選取的是同一種土樣，統(tǒng)計(jì)的結(jié)如果學(xué)生選取的是同一種土樣，統(tǒng)計(jì)的結(jié)果應(yīng)該接近。如果結(jié)果相差太遠(yuǎn)，需要進(jìn)一步果應(yīng)該接近。如果結(jié)果相差太遠(yuǎn)，需要進(jìn)一步分析產(chǎn)生差異的原因。分析產(chǎn)生差異的原因。（二）樣品的稀釋操作是否成功（二）樣品的稀釋操作是否成功 如果得到了如果得到了2 2個(gè)或個(gè)或2 2個(gè)以上菌落數(shù)目在個(gè)以上菌落數(shù)目在3030300300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)。進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)。 （三）重復(fù)組的結(jié)果是否一致（三）重復(fù)組的結(jié)果是否一致本課題知識小結(jié)

16、本課題知識小結(jié): :七、例題解析七、例題解析 例例1 1對細(xì)菌群體生長規(guī)律測定的正確的表述是對細(xì)菌群體生長規(guī)律測定的正確的表述是a a在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行 b b至少接種一種細(xì)菌至少接種一種細(xì)菌 c c接種一個(gè)細(xì)菌接種一個(gè)細(xì)菌 dd及時(shí)補(bǔ)充消耗的營養(yǎng)物及時(shí)補(bǔ)充消耗的營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì) 解析：細(xì)菌群體生長規(guī)律的測定是人們在一定條件下進(jìn)行的。解析：細(xì)菌群體生長規(guī)律的測定是人們在一定條件下進(jìn)行的。這些條件是：一這些條件是：一種細(xì)菌、恒定容積的培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基、定種細(xì)菌、恒定容積的培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基、定時(shí)測定細(xì)菌總數(shù)時(shí)測定細(xì)菌總數(shù)。在這些條件下，才能測定出細(xì)菌的生長規(guī)律。在這些條件下，才能測

17、定出細(xì)菌的生長規(guī)律。測定時(shí)只能用一種細(xì)菌的子細(xì)胞群體的變化規(guī)律表達(dá)微生物的測定時(shí)只能用一種細(xì)菌的子細(xì)胞群體的變化規(guī)律表達(dá)微生物的生長；恒定容積是給微生物提供一定的生存環(huán)境；液體培養(yǎng)基生長；恒定容積是給微生物提供一定的生存環(huán)境；液體培養(yǎng)基才能通過樣品推測細(xì)菌總數(shù)。若接種多種細(xì)菌，則會發(fā)生種間才能通過樣品推測細(xì)菌總數(shù)。若接種多種細(xì)菌，則會發(fā)生種間斗爭而不能測定一種微生物的生長規(guī)律。在接種時(shí)，要保證一斗爭而不能測定一種微生物的生長規(guī)律。在接種時(shí)，要保證一定的接種量。定的接種量。答案：答案：a a例例2 2在微生物群體生長規(guī)律的測定中，在微生物群體生長規(guī)律的測定中，種內(nèi)斗爭最顯著最激烈的時(shí)期是種內(nèi)斗爭

18、最顯著最激烈的時(shí)期是a a調(diào)整期調(diào)整期 b b對數(shù)期對數(shù)期 c c穩(wěn)定期穩(wěn)定期 dd衰亡期衰亡期解析：種內(nèi)斗爭是一種生態(tài)因素。種內(nèi)斗爭反應(yīng)了種內(nèi)生解析：種內(nèi)斗爭是一種生態(tài)因素。種內(nèi)斗爭反應(yīng)了種內(nèi)生物對生存空間和生活資源的爭奪。在生活空間充裕，營養(yǎng)充足物對生存空間和生活資源的爭奪。在生活空間充裕，營養(yǎng)充足的時(shí)候，種內(nèi)斗爭的程度是比較低的。隨著微生物個(gè)體數(shù)目的的時(shí)候，種內(nèi)斗爭的程度是比較低的。隨著微生物個(gè)體數(shù)目的增加，每個(gè)個(gè)體的生存空間越來越少，營養(yǎng)物質(zhì)也越來越少，增加，每個(gè)個(gè)體的生存空間越來越少，營養(yǎng)物質(zhì)也越來越少，每個(gè)個(gè)體對生存空間和資源的爭奪也越來越激烈，種內(nèi)斗爭就每個(gè)個(gè)體對生存空間和資源的

19、爭奪也越來越激烈，種內(nèi)斗爭就越來越激烈。由此可知，在越來越激烈。由此可知，在穩(wěn)定期穩(wěn)定期的種內(nèi)斗爭最激烈。在衰亡的種內(nèi)斗爭最激烈。在衰亡期，微生物的數(shù)目已經(jīng)開始減少，期，微生物的數(shù)目已經(jīng)開始減少，phph已經(jīng)極度不適于微生物的已經(jīng)極度不適于微生物的生存，次級代謝產(chǎn)物積累到很高的程度，這時(shí)的微生物的生存生存，次級代謝產(chǎn)物積累到很高的程度，這時(shí)的微生物的生存斗爭主要是與無機(jī)環(huán)境的斗爭。斗爭主要是與無機(jī)環(huán)境的斗爭。答案：答案：c c例例3 3（20052005年江蘇）抗生素作為治療細(xì)菌感染年江蘇）抗生素作為治療細(xì)菌感染的藥物，其高效性和巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值使抗生素工業(yè)經(jīng)久的藥物，其高效性和巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值使抗生素工業(yè)經(jīng)久不衰。其中青霉素的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用具有劃時(shí)代的意義。不衰。其中青霉素的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用具有劃時(shí)代的意義。青霉素發(fā)酵產(chǎn)生青霉素。青霉菌的新陳代謝類型青霉素發(fā)酵產(chǎn)生青霉素。青霉菌的新陳代謝類型是是 ，青霉素是青霉菌的，青霉素是青霉菌的 代謝產(chǎn)物。代謝產(chǎn)物。在生產(chǎn)和科研中，常選用處于在生產(chǎn)和科研中，常選用處于 期的青霉菌作為期的青霉菌作為菌種或研究材料，此時(shí)的青霉菌代謝旺盛