生物質譜技術與方法

1、質譜技術與方法質譜分析法（mass spectrometry，ms）是將化合物形成離子和碎片離子，按質荷比（m/z）的不同進行分離，來進行成分和結構分析的方法。所得結果用質譜圖（亦稱質譜，massspectrum）表示。根據質譜圖提供的信息可以進行有機物及無機物的定性和定量分析、生物大分子的結構分析、樣品中各種同位素比的測定及固體表面的結構和組成分析等。生物質譜（bio - mass spectrometry，bio-ms）是用于生物分子分析的質譜技術。生物質譜要求測定上萬甚至是幾十萬的相對分子質量 。隨著電噴霧電離（esi）和基質輔助激光解吸電離（maldi）技術的完善和成熟，生物大分子的質

2、譜分析才得以實現。the nobel prize in chemistry 2002for the development of methods for identification andstructure analyses of biological macromoleculesfor their development of softdesorption ionisation methods formass spectrometric analyses ofbiological macromoleculesfor hisdevelopment ofnuclear magneticreso

3、nancespectroscopy fordetermining thethree-dimensionalstructure ofbiologicalmacromolecules insolution約翰芬田中耕一庫爾特伍斯里奇質譜法的基本原理質譜分析的基本過程是使樣品在離子源中發(fā)生電離，生成不同質荷比的帶電離子，經加速電場的作用形成離子束，進入質量分析器，在其中再利用電場和磁場使其發(fā)生色散、聚焦，獲得質譜圖。質譜分析中，多種離子化技術均可使物質分子失去外層價電子形成分子離子（molecular ion，m+），分子離子中的化學鍵還可以繼續(xù)發(fā)生某些有規(guī)律的斷裂而形成不同質量的碎片離子（frag

4、ment ion）：m m+ + 碎片離子 + 中性分子被分析樣品離子電離后經加速進入磁場時，其動能與加速電壓及電荷z有關，即：zeu = 1/2mv2其中：z為電荷數，e為元電荷（e = 16010-19c），u為加速電壓，m為離子的質量，v為離子初加速后的運動速度。具有速度v的帶電粒子進入質譜儀的質量分析器中，根據所選擇的分離方式，最終各種離子按質荷比（mz）的不同實現分離。質譜儀質譜儀包括進樣系統(tǒng)、電離系統(tǒng)、質量分析器和檢測系統(tǒng)。為了獲得離子的良好分析，必須避免離子損失，因此凡有樣品分子及離子存在和通過的地方，必須處于真空狀態(tài)。在進行質譜分析時，一般過程是：通過合適的進樣裝置將樣品引入并

5、進行氣化。氣化后的樣品引入到離子源進行電離。電離后的離子經過適當的加速后進入質量分析器，按不同的mz進行分離。然后到達檢測器，產生不同的信號而進行分析。質量分析器檢測器樣品導入系統(tǒng)離子源真空泵m/z計算機控制與數據處理相對豐度質譜儀的構成datasystemmassspectrumoutinletsystemmassanalyzerionsourcedetectorsampleininlet systems:ion sources:mass analyzers:simple vacuum lockhplcgcelectrospray (esi)maldifab/lsimselectron io

6、nization (ei)quadrupoletime-of-flightion trapmagnetic sectorftmsmass spectrometer schematicvacuum envelope離子源(ion source)質譜儀中將分子轉化為離子的裝置稱為離子源(ion source)。由于離子化所需要的能量隨分子不同差異很大，因此，對于不同的分子應選擇不同的離解方法。通常將能給樣品較大能量、生成較多碎片離子的電離方法稱為硬電離方法（如電子轟擊離子化，ei），而給樣品較小能量、碎片離子較少或不生成碎片離子的電離方法稱為軟電離方法。生物質譜中有代表性的離子源1電噴霧電離(el

7、ectrospray ionization，esi)2離子噴霧電離（ion spray ionization，isi ）3大氣壓化學電離(atmospheric pressurechemical ionization，apci)4基質輔助激光解吸電離(matrix assistedlaser desorption ionization，maldi)5快原子轟擊電離(fast atom bonbardmentionization，fab)離子源是質譜儀的心臟，可以將離子源看作是離子化反應器，樣品在其中發(fā)生一系列的特征裂解反應，反應在很短時間（10-11s）內發(fā)生，所以可以快速地獲得質譜圖。質量分

8、析器質量分析器是質譜儀的核心，它將離子源產生的離子按其質量和電荷比（質荷比m/z，m離子的質量數，z離子攜帶的電荷數）的不同在空間的位置時間的先后或軌道的穩(wěn)定與否進行分離,以便得到按質荷比（m/z）大小順序排列而成的質譜圖。質量分析器(mass analyzer)的種類1.磁質量分析器(單聚焦質量分析器,雙聚焦質量分析器)2.四極質量分析器(四極桿濾質器)3.飛行時間質量分析器(tof)4.離子阱(ion trap)質量分析器5.離子回旋共振質量分析器其中,234是目前生物質譜分析中常用的質量分析器檢測器1.直接電檢測器2.電子倍增器3.閃爍檢測器4.微通道板計算機控制與數據處理系統(tǒng)1.監(jiān)控各

9、單元的工作狀態(tài),實現質譜儀的全自動操作.2.數據的采集和簡化.3.質量數的轉換.4.扣除本底或相鄰組分的干擾.5.譜峰強度歸一化.6.標出高分辨質譜的元素組成.7.用總離子流對質譜峰強度進行修正.8.譜圖的累加平均.9.輸出質量色譜圖.10.單離子檢測和多離子檢測.11.譜圖檢索.質譜圖質譜分析中，按各離子m/z的順序及相對強度大小記錄分析結果的圖譜即為質譜圖。由于圖譜中離子的質量及相對強度是各物質所特有的，即反映了物質的性質和結構特點，因此通過質譜解析可以進行物質的成分和結構分析。常見的質譜圖是經過計算機處理后得到的棒圖（bar graph）。常見的質譜圖是經計算機處理的棒圖.圖中,縱坐標表

10、示離子的相對豐度(以質譜中最強峰的高度為100%,并將此峰稱位基峰,其余峰按與基峰的比例加以表示,又稱為相對強度);橫坐標表示離子的質荷比.根據峰位(棒位)可進行定性鑒別;根據相對豐度可進行定量測定.15282931(基峰)32(分子離子峰)33100806040201020304050m/z相對峰強棒圖(bar graph)ch3oh%intensity1239.41679.82120.22560.6mass (m/z)03001.00799.01020301001480.601567.46908070605040804.682044.211738.351570.451439.651894.

11、26 2047.21927.77843.872470.782210.101923.271724.381000.701209.841391.671574.122661.87 2807.672066.13牛血清蛋白（bsp）酶解產物的質譜圖voyager spec #1bp = 1480.6, 812710030%int.10090807060504034943495349634973498349935003501350235033497.64223496.65413498.62563495.65453499.6528203500.65953501.6502resolution 20,000m/z

12、胰島素的高分辨質譜圖質譜儀的主要性能指標衡量質譜儀整體性能的主要指標有：質量范圍分辨率質量準確度靈敏度掃描速度等質量分析器質量上限(m/z)質量準確度（u）分辨率（r）掃描速度（u/s）適用范圍四極桿質譜40000.1500300040006000小分子、多電荷離子大分子離子阱質譜100000.110001000040006000小分子、多電荷離子大分子飛行時間質譜5000000.001(高分辨飛行時間質譜)5001000（低），200020000（高）1000000小分子、大分子不同類型質量分析器的性能指標質量范圍(mass range)是指質譜儀能夠測量的離子質量范圍，通常用最小和最大離子

13、的離子質量表示。質譜分析中，是以核素12c質量（12c=12.000u）的1/12為一個質量單位（u）。1u = （12.00000 gmol-1 / 6.022141023 mol-1）/12= 1.6605410-24 g在生物大分子的質譜分析中，還常用道爾頓（dalton，da）作為度量單位。 1da = 1.660310-24 g。 da與u兩者相差萬分之三左右，在生物質譜分析中，可以視為1da = 1u。質量準確度（mass accuracy）質量準確度又稱質量精度，即離子質量實測值m 與理論值m0 的相對誤差：質量精度 = mm0/ m106 (ppm)（m為離子質量數的整數）儀器

14、的質量精度一般應小于10 ppm。分辨率(resolution，r)分辨率是指儀器能分離相鄰兩質譜峰的能力。若將強度近似相等、質量分別為m和m+m 的兩個相鄰峰恰好分開，則質譜儀的分辨率定義為：rm1 / (m2 - m1) m1 / m其中m1、m2：為質量數，且m1m2：，故在兩峰質量相差越小時，要求儀器分辨率越大。重點介紹兩種生物質譜分析方法基質輔助激光解吸電離/飛行時間質譜（matrix assisted laser desorptionionization / time of flight mass spectra，maldi-tof ms）電噴霧電離(electrospray io

15、nization，esi)質譜電噴霧離子化（esi）原理內襯彈性石英管的不銹鋼毛細管（內徑0.10.15mm）被加以25kv的正電壓，與相距約12cm接地的反電極形成強靜電場。被分析的樣品溶液從毛細管流出時，在電場作用下形成高度荷電的霧狀小液滴；在向質量分析器移動的過程中，液滴因溶劑的揮發(fā)逐漸縮小，其表面上的電荷不斷增大。當電荷之間的排斥異力足以克服表面張力時（瑞利極限），液滴發(fā)生裂分；經過這樣反復的溶劑揮發(fā)-液滴裂分過程，最后產生單個的氣態(tài)離子。由于沒有外界能量直接作用于分子，因此對分子結構破壞較少，是一種典型的“軟電離”方式。esimaldi1、離子化形式：產生多電荷離子，常與與hplc聯

16、用，才適用于混合物中蛋白質成分的鑒定1、離子化形式：通常產生單電荷離子，因此，適用于混合物中蛋白質成分的-182、靈敏度：10 m-15 -182、靈敏度：10 m3、分辨率：5,0003、分辨率：5,0004、聯用形式：可與hplc、ce在線聯用4、聯用形式：只能與hplc、ce離線聯用5、與質量分析器的兼容性：可與各種質量分析器（qqq, qtof，ion trap，ftms）兼容5、與質量分析器的兼容性：主要與tof配合使用6、源內裂解能力：具有低能量（1kev）的誘導碰撞解離能力7、適用性：精確分子質量測定、ms /ms 分析（使用trap質量分析器可做nms 分析）7、適用性：精確分

17、子質量測定、pmf分析8、操作的難易程度：需經培訓8、操作的難易程度：容易esi與maldi的比較質量分析器(mass analyzer)在生物質譜中，與esi離子化源配合使用的質量分析器主要有：、四極濾質器、離子阱分析器和離子回旋共振分析器等。隨著技術的發(fā)展，也可以采用這些分析器的變型。四極濾質器（quadrupole mass filter）四極濾質器也稱四極質量分析器，它由四根截面呈雙曲面的平行金屬桿電極組成，離子束穿過對準四根桿之間空間的準直小孔。相對的一對電極是等電位的，兩對電極之間的電位是相反的。離子源的電位比四極濾質器的電位略高幾個伏特，以提供離子沿傳播中心軸飛行所需的動能。離子

18、阱 (ion trap)質量分析器離子阱質量分析器亦稱四極離子阱（quadropoleion trp）或paul阱，簡稱離子阱，是一種通過電場或磁場將氣相離子控制并貯存一段時間的裝置。這種分析器是由雙曲線表面的中心環(huán)形電極（ ring electrode） 和 上 下 各 一 個 端 蓋 電 極（endcap electrode）組成，中間形成一個空腔（阱），因此而成為離子阱。端蓋電極接地，環(huán)形電極施以射頻電壓。離子阱內充有一定量的氦氣（約10-3（torr），這有利于離子朝中心聚集，而離子聚集得越緊湊，離子能量和位置分散越小，有利于提高分辨率和靈敏度。液相色譜-質譜聯用技術（liquid c

19、hromatography / massspectrometry，lc-ms）lc-ms把液相色譜技術強有力的分離能力與質譜技術有效的定性分析能力相結合，特別適合于復雜體系的分離分析，目前已成為蛋白質組學研究中最重要的技術平臺之一。lc-ms的開發(fā)在技術上十分困難，直到電噴霧電離（esi）接口和大氣壓化學電離（apci）接口出現，在20世紀90年代才有了成熟的商品化的液相色譜-質譜聯用儀。hplc*含有緩沖劑的水相/有機溶劑*非揮發(fā)性分析樣品interface*脫溶劑*使分析樣品發(fā)生離子化ms*高真空度*按m/z分析產生的離子lc-ms的基本構成接口的作用就是將hplc與ms兩者實現在線的對接

20、。它的主要作用是脫去來自hplc的大量溶劑，使分析樣品由液相轉變?yōu)闅庀嗖l(fā)生離子化。接口性能的好壞在很大程度上決定著色譜-質譜聯用儀器性能的優(yōu)劣。好的hplc條件可能是“壞的”ms條件，二者難以匹配要實現hplc與ms的有效的聯用，必須解決以下困難問題：色譜儀與質譜儀的壓力匹配問題色譜儀與質譜儀的流量匹配問題氣化問題譜圖類型色譜-質譜提供的信息ms的譜圖有:1.質譜圖2.色譜圖3.全掃描色譜-質譜三維譜譜 圖 類 型色譜-質譜提供的信息ms的譜圖有:1.質譜圖質譜圖是一次掃描時間內得到的峰強質荷比圖。掃描方式又有連續(xù)掃描和跳變掃描之分。2.色譜圖3.全掃描色譜-質譜三維譜色 譜 圖通常有三種類

21、型:1.總離子流色譜圖(tic)2.質量色譜圖(mc)3.選擇離子監(jiān)測圖(sim)一個例子:反相高效液相色譜-電噴霧電離質譜法測定人血漿、尿樣中d,l-異亮氨酸和d,l-別異亮氨酸異構體h 2ncoohchc h 2chh 3cc h 3h 2ncoohchchh 2cc h 3c h 3leucineisoleucine圖. 17對氨基酸和甘氨酸標準溶液衍生物的rp-hplc熒光檢測色譜圖fig. chromatograms of opta-accys-derivatives of 17 pairs of standard amino acidsand gly . a:l-ile, b:l-allo-ile, c:d-ile, d:d-allo-ileconditions: mobile phase a, 50 mmol/l nh4ac; mobile phase b: methanol; 0-10 min,mobile phase b 10%; 10-30 min, mobile phase b 10-40% (linear gradient);30-70 min,mobile phase b 40%;