自噬在心肌缺血再灌注損傷中的不同作用研究

1、自噬在心肌缺血再灌注損傷中的不同作用研究 南方醫(yī)科大學(xué)級(jí)博士學(xué)位論文自噬在心肌缺血.再灌注損傷中的不同作用/課題來(lái)源:國(guó)家自然科學(xué)基金廣東省自然科學(xué)基金團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目專(zhuān) 業(yè) 名 稱(chēng)科一一學(xué)位申請(qǐng)人指 導(dǎo) 教 師羲一爵一答辯委員會(huì)主席圳一徘一一誹答辯委員會(huì)成員 李自成一一一一一黃巧冰程繼東劉世明論文評(píng)閱人 蘇磊張文清黃巧冰邱健余細(xì)勇程繼東日廣州年月/四博士學(xué)位論丈自噬在心肌缺血.再灌注損傷中的不同作用博士研究生:徐秋林指導(dǎo)教師:廖禹林賓建平摘要研究背景冠心病是心血管疾病中引起死亡的首要原因。冠脈狹窄引起心肌缺血甚至心肌梗死心梗與病死率密切相關(guān),缺血時(shí)間越長(zhǎng),心梗面積越大,患者預(yù)后越差。盡快恢復(fù)心肌灌注

2、,挽救瀕死心肌,防止梗死擴(kuò)大是急性心梗的基本治療原則。然而,再灌注會(huì)引起再灌注損傷/ ,/損傷。/損傷的機(jī)制包括氧自由基生成增加、鈣超載、炎癥反應(yīng)、線(xiàn)粒體損傷、細(xì)胞凋亡、內(nèi)皮細(xì)胞活化和損傷以及自噬等。其中自噬是目前研究的熱點(diǎn),被認(rèn)為在心肌缺血.再灌注損傷中發(fā)揮著非常重要的作用。自噬是溶酶體介導(dǎo)的對(duì)長(zhǎng)命蛋白質(zhì)和損傷細(xì)胞器進(jìn)行回收的過(guò)程,對(duì)線(xiàn)粒體等細(xì)胞器的降解和周轉(zhuǎn)起關(guān)鍵作用。在/時(shí),細(xì)胞內(nèi)減少以及激活的蛋白激酶? ,活性增高均可激活自噬信號(hào)通路。另外,唯域蛋白的表達(dá)上調(diào)、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加、活性氧分子,、過(guò)量的一氧化氮、線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔的開(kāi)放、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和非折疊蛋白反應(yīng) ,等均可促進(jìn)心肌細(xì)胞

3、的自噬。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白 ,信號(hào)通路、/依賴(lài)的蛋白激酶通路、胰島素/生長(zhǎng)因子信號(hào)通路以及.通路調(diào)節(jié)著自噬活性。在真核細(xì)胞中,雷帕摘要霉素可抑制而激活自噬,而一甲基腺嘌呤、渥曼青霉素等可通過(guò)抑制磷脂酰肌醇激酶 ,而抑制自噬。線(xiàn)粒體是心肌細(xì)胞總含量最豐富的細(xì)胞器,其對(duì)于維持細(xì)胞功能非常重要。心肌細(xì)胞/會(huì)導(dǎo)致線(xiàn)粒體功能障礙,主要表現(xiàn)為線(xiàn)粒體膜電位除極化以及線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔,開(kāi)放。線(xiàn)粒體功能障礙可以使心肌減少,氧自由基生成以及促凋亡蛋白釋放,造成細(xì)胞死亡。氧自由基又可以進(jìn)一步加重線(xiàn)粒體損傷,形成惡性循環(huán)。線(xiàn)粒體膜電位除極化、線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放以及氧自由基均可激活自噬,后者清除損傷的線(xiàn)粒體,

4、從而挽救瀕死的心肌細(xì)胞。然而,當(dāng)自噬過(guò)度激活時(shí),自噬可過(guò)度清除細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器,從而引起細(xì)胞自噬性死亡。大量文獻(xiàn)報(bào)道在心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧/,/以及心肌/時(shí),自噬活性上調(diào)。但在/或/的時(shí)程與自噬活性的關(guān)系上存在爭(zhēng)議。有研究認(rèn)為缺血或缺氧時(shí)間過(guò)短不改變自噬活性,也有報(bào)告顯示缺血抑制而再灌注上調(diào)自噬活性,甚至有研究提出缺血期的自噬增強(qiáng)保護(hù)心肌,而再灌注期的自噬增強(qiáng)則損害心肌。多數(shù)研究報(bào)告嚙齒類(lèi)動(dòng)物缺血超過(guò)和/或再灌注時(shí)間超過(guò)均可促進(jìn)心肌細(xì)胞的自噬。不少研究認(rèn)為自噬的增強(qiáng)對(duì)缺血心肌有保護(hù)作用,但同樣也有不少研究認(rèn)為自噬加重心肌損傷。關(guān)于自噬在/的作用之所以會(huì)產(chǎn)生如此大的分歧,可能與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和研究于段的局

5、限性有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道的相關(guān)研究,多是對(duì)單一/狀態(tài)下的集中研究,而沒(méi)有對(duì)不同/狀態(tài)下自噬功能作用進(jìn)行比較性研究。比如,輕度和重度/損傷時(shí),自噬增強(qiáng)所產(chǎn)生的作用未必是一樣的。我們?cè)O(shè)想,過(guò)低或過(guò)高的自噬可能都是有害的,那么用基因敲除和過(guò)表達(dá)的研究于段得出的結(jié)果應(yīng)該謹(jǐn)慎解釋。如果能確定心肌/損傷時(shí)自噬的“安全范圍”,則有望操控自噬活性來(lái)達(dá)到治療目的。研究目的博士學(xué)位論文在新生大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)的/模型和小鼠心肌/模型中,觀察不同的缺氧時(shí)間和缺血時(shí)間對(duì)自噬活性的影響,并用自噬增強(qiáng)劑雷帕霉素和自噬抑制劑渥曼青霉素調(diào)節(jié)自噬,來(lái)研究自噬在心肌細(xì)胞/及心肌/中的作用及其機(jī)制,借此闡明自噬在/損傷中的作用機(jī)制,為心肌

6、的/損傷提供有效的治療靶點(diǎn)。方法.離體研究分離.日齡乳鼠中心肌細(xì)胞,按常規(guī)進(jìn)行原代培養(yǎng),做下列檢測(cè):,法檢測(cè)細(xì)胞生存,.二甲基.噻唑基,.率,設(shè)對(duì)照組、雷帕霉素組和渥曼青霉素組,置于缺氧孵箱中分別缺氧、比色,于分光光度儀下測(cè)吸光度值,比較各組細(xì)和,然后復(fù)氧,胞生存率變化。凋亡檢測(cè)將心肌細(xì)胞接種于激光共聚焦小皿,設(shè)對(duì)照組、雷帕霉素和渥曼青霉素組,藥物預(yù)處理后,置于缺氧孵箱中分別缺氧、和,復(fù)氧。用 染核,檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率。檢測(cè)自噬將細(xì)胞接種于孔板或激光共聚焦小皿,單丹磺酰尸胺,染色后用激光共聚焦檢測(cè)其熒光信號(hào),定量分析自噬活性;或?qū)⒓?xì)胞用胰酶消化、離心后用戊二醛固定,電鏡檢測(cè)其中自噬體形成;或提

7、取細(xì)胞總蛋白,用免疫印跡 分別檢測(cè).和的表達(dá)水平。檢測(cè)開(kāi)放,將鈣黃綠素和氯化鈷與心肌細(xì),漂洗次,胞共孵育后,磷酸鹽緩沖液胰酶消化后,用等體積含%胎牛血清/終止消化,流式細(xì)胞儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。激光共聚焦檢測(cè):將鈣黃綠素和氯化鉆與心肌細(xì)胞共孵育后,漂沈次,激光共聚焦檢測(cè)。線(xiàn)粒體膜電位除極化檢測(cè):將.探針與心肌細(xì)胞共孵育后,漂沈次,激光共聚焦檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位除極化水甲。摘要.在體研究在動(dòng)物水平上,將.周齡/小鼠分為對(duì)照組、雷帕霉素組和渥曼青霉素組,腹腔注射藥物后,麻醉,人工呼吸,左側(cè)第肋間開(kāi)胸,暴露心臟,結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈,分別缺血后松開(kāi)結(jié)扎,恢復(fù)冠脈灌注。假手術(shù)組只開(kāi)胸不結(jié)扎。觀察指標(biāo):酶聯(lián)免疫吸附實(shí)

8、驗(yàn)?法檢測(cè)血清乳酸脫氫酶 ,、,一氯化三苯基四氮唑,法測(cè)定心梗面積、超聲檢查左室內(nèi)徑和收縮功能、免疫印跡及電鏡檢查自噬水平。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤±表示,統(tǒng)計(jì)分析采用 .軟,兩兩比較采用法。計(jì)量資料用件完成,多重比較采用.卡方檢驗(yàn)。.被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果.心肌細(xì)胞自噬活性隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)和自噬體上的酸性物質(zhì)結(jié)合顯示為藍(lán)色,在自噬形成的時(shí)候會(huì)聚集成團(tuán)塊狀。我們發(fā)現(xiàn)隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng),心肌細(xì)胞中藍(lán)色顆粒數(shù)量及面積均顯著增多.。在電鏡觀察下,自噬體為特有的雙層膜結(jié)構(gòu),內(nèi)含有損傷的細(xì)胞器。結(jié)果顯示,細(xì)胞內(nèi)的自噬體數(shù)量隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)而明顯增加尸. 用檢測(cè).和時(shí)發(fā)現(xiàn),缺氧使.和

9、蛋白表達(dá)量顯著增加。.干預(yù)自噬對(duì)/心肌細(xì)胞生存的影響將藥物預(yù)處理心肌細(xì)胞后,分別進(jìn)行缺氧.后復(fù)氧。在缺氧時(shí),心肌細(xì)胞存活率顯著下降,自噬增強(qiáng)劑雷帕霉素增加缺氧心肌細(xì)胞的存活率,而自噬抑制劑渥曼青霉素則降低細(xì)胞存活率。而在缺氧時(shí),雷帕霉素降低心肌細(xì)胞存活率,渥曼青霉素則改善細(xì)胞生存率。博士學(xué)位論文.干預(yù)自噬對(duì)/心肌細(xì)胞凋亡和自噬性死亡的影響用 來(lái)染核,凋亡細(xì)胞核固縮,被染成亮藍(lán)色。在非用藥的/組,隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng),凋亡細(xì)胞核逐漸增加。在常氧組,雷帕霉素和渥曼青霉素對(duì)細(xì)胞凋亡率無(wú)影響。但是將心肌細(xì)胞缺氧、,復(fù)氧組,雷帕霉素處理組均可使一肌細(xì)胞凋亡率下降,而渥曼青霉素增加凋亡。然而用電鏡觀察細(xì)胞自噬

10、性死亡,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在缺氧的/組,雷帕霉素和渥曼青霉素對(duì)自噬性死亡無(wú)明顯影響,而在缺氧的/組,雷帕霉素增加自噬性死亡,渥曼青霉素則抑制之。.干預(yù)自噬對(duì)線(xiàn)粒體功能的影響用鈣黃綠素和氯化鈷共孵育的方法來(lái)檢測(cè)心肌細(xì)胞開(kāi)放情況,隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng),流式細(xì)胞儀檢測(cè)到的線(xiàn)粒體平均熒光強(qiáng)度下降,表明心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放增加。用激光共聚焦檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度,增加則表明開(kāi)放降低,線(xiàn)粒體功能穩(wěn)定。結(jié)果與流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果一致。熒光探針.可以作為線(xiàn)粒體膜電位的指示劑,其紅/綠熒光的比值可以反應(yīng)線(xiàn)粒體膜電位的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng),線(xiàn)粒體紅/綠熒光比值逐漸下降,表明線(xiàn)粒體膜電位除極化增加。雷帕霉素和渥曼

11、青霉素不明顯改變常氧心肌細(xì)胞的開(kāi)放程度。在輕度缺氧時(shí),雷帕霉素可降低的開(kāi)放,而渥曼青霉素作用相反。但在缺氧的/組,雷帕霉素由于增強(qiáng)自噬而導(dǎo)致線(xiàn)粒體數(shù)量減少,從而降低線(xiàn)粒體內(nèi)的熒光強(qiáng)度,而渥曼青霉素仍會(huì)繼續(xù)增加的開(kāi)放。.干預(yù)自噬對(duì)/心肌細(xì)胞釋放及心梗面積的影響小鼠心肌缺血及,再灌注時(shí),加上缺血共三組,心/組,雷帕霉素可顯著縮小心梗梗面積和血清依次增加。在缺血面積、減少的釋放,渥曼青霉素的作用效果相反。在缺血組,雷帕摘要霉素反而增加心梗面積,而渥曼青霉素則縮小之。電鏡檢測(cè)顯示各組的自噬水平也是依次增加,雷帕霉素增加心肌細(xì)胞自噬,而渥曼青霉素則抑制之。結(jié)論.缺氧或缺血時(shí)間延長(zhǎng)可導(dǎo)致心肌細(xì)胞自噬活性增

12、強(qiáng),提示自噬活性與損傷程度關(guān)聯(lián)。.在自噬水甲較低時(shí),適當(dāng)增加自噬對(duì)心肌細(xì)胞起保護(hù)作用,其機(jī)制可能與促進(jìn)細(xì)胞垃圾清除,降低線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)換孔的開(kāi)放,從而抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。.在細(xì)胞損傷嚴(yán)重,自噬活性較強(qiáng)的情況下,進(jìn)一步增加自噬可促進(jìn)自噬性細(xì)胞死亡,而抑制自噬反而能增加心肌存活、限制梗塞面積。關(guān)鍵詞:自噬;凋亡;缺血.再灌注損傷;缺氧.復(fù)氧;線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔;線(xiàn)粒體膜電位博士學(xué)位論文 :;:. /. . . , ./, , . /., ? ? , / ,. ., ,.,/? / 一,. ,. / . ,.,., ., ./ /,/ /.,博士學(xué)位論文. . . /., / ./. ./ / /.: .:

13、 .:,. ., , ,【一,一一一一,一 】.:. . : 一 , .:, .: , ,一. / /., .:.博士學(xué)位論文. ,一.?,. .,. , . ./, . /, ./ . . /. , , ./ . , , . 一. / , . 博士學(xué)位論文./,./ , , . /? / / ./ , .,. .,. , ./ / . ., .¨:; ;?;博士學(xué)位論文目 錄摘要目錄?.前言?. 日吾材料與方法?.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料?主要試劑的配制?.主要實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)方法.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析?.結(jié)果?.一. :木?.討論?.結(jié)論.參考文獻(xiàn)縮寫(xiě)詞簡(jiǎn)表?.致射?.博士研究生期間發(fā)表論文情況學(xué)位論文

14、原創(chuàng)性聲明統(tǒng)計(jì)學(xué)審稿證明?博士學(xué)位論文前言.缺血.再灌注損傷是急性心梗治療后常見(jiàn)的損傷機(jī)制冠心病是心血管疾病中引起死亡的首要原因。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì),年全球有萬(wàn)人死于心血管疾病,占全部死亡人數(shù)的%,其中冠心病引起的死亡人數(shù)達(dá)萬(wàn)。另外,據(jù)估計(jì),到年,心血管疾病的死亡人數(shù)可以達(dá)到萬(wàn)人。因而,在今后相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi),冠心病是引起死亡的首要原因。在美國(guó),每年有約萬(wàn)人患急性心肌梗塞,另有約萬(wàn)人因?yàn)楦鞣N心臟手術(shù)而出現(xiàn)心臟停博。冠心病的發(fā)病機(jī)制是由于脂質(zhì)代謝異常,血液中的脂質(zhì)沉著在原本光滑的冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜上,在動(dòng)脈內(nèi)膜一些類(lèi)似粥樣的脂類(lèi)物質(zhì)堆積而成白色斑塊,這些斑塊漸漸增多造成動(dòng)脈腔狹窄,使血流受阻,導(dǎo)致心

15、臟缺血,產(chǎn)生心絞痛。如果動(dòng)脈壁上的斑塊形成潰瘍或破裂,就會(huì)形成血栓,使整個(gè)血管血流完全中斷,發(fā)生急性心肌梗死,甚至猝死。冠心病的少見(jiàn)發(fā)病機(jī)制是冠狀動(dòng)脈痙攣血管可以沒(méi)有粥樣硬化,產(chǎn)生變異性心絞痛,如果痙攣超過(guò)分鐘,也會(huì)導(dǎo)致急性心肌梗死甚至猝死。研究表明,心肌缺血的時(shí)間與心肌梗死的面積和患者的病死率密切相關(guān),缺血時(shí)間越長(zhǎng),心肌梗塞面積越大,患者預(yù)后越差。因而,治療原則是盡快搶救恢復(fù)心肌的血液灌注,以挽救瀕死心肌,防止梗死擴(kuò)大或縮小心肌缺血范圍,保護(hù)和維持心臟功能,及時(shí)處理并發(fā)癥。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展及經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)血管成形術(shù)、溶栓等各種治療缺血性心臟病方法的廣泛開(kāi)展,的病死率已經(jīng)得到很大下降。然而

16、由于絕大部分事件發(fā)生在院外,患者往往因?yàn)闊o(wú)法及時(shí)到達(dá)醫(yī)院而錯(cuò)過(guò)開(kāi)通梗塞血管的最佳時(shí)機(jī);另外,在醫(yī)療資源缺乏的偏遠(yuǎn)地區(qū)或者一些醫(yī)療條件較差的發(fā)展中國(guó)家,梗塞心肌的再灌注也成為一個(gè)困難的問(wèn)題。因而,如何在心肌缺血的情況下減少心肌梗死面積、延緩心肌梗死速度,盡可能的保護(hù)心臟的功能具有非常重要的意義。另外,對(duì)前言于那些即使能夠及時(shí)接受介入或者藥物溶栓治療使得梗塞冠脈再通的患者,哪怕其心肌缺血時(shí)間非常短,心臟再灌注后的心功能恢復(fù)仍然不如預(yù)期的那么好。很多患者再灌注后缺血的心肌出現(xiàn)舒縮功能降低、心律失常、心肌能量代謝障礙、超微結(jié)構(gòu)的變化及血管無(wú)復(fù)流等現(xiàn)象。這主要是由于心肌缺血后的再灌注損傷所引起的。心肌缺

17、血再灌注損傷,/損傷是指心肌缺血基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后組織損傷加重、甚至發(fā)生不可逆損傷的現(xiàn)象。后來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),心臟的/損傷涉及多種分子和細(xì)胞機(jī)制,包括氧自由基、鈣超載、炎癥反應(yīng)、線(xiàn)粒體損傷、細(xì)胞凋亡、內(nèi)皮細(xì)胞活化和損傷以及自噬等。其中自噬是目前研究的熱點(diǎn),被認(rèn)為在心肌缺血.再灌注損傷中發(fā)揮著非常重要的作用。.自噬在心肌缺血.再灌注損傷中的作用及其機(jī)制自噬是生物進(jìn)化過(guò)程中形成的在溶酶體內(nèi)降解細(xì)胞質(zhì)成分的一種保守生理過(guò)程。正常情況下,它通過(guò)不問(wèn)斷的回收細(xì)胞的成分,如長(zhǎng)壽命蛋損傷細(xì)胞器來(lái)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行修復(fù),維持生命的延續(xù)。許多生物過(guò)程都涉及到自噬,例如,細(xì)胞分化、組織重塑、生長(zhǎng)控制、細(xì)胞防御,以及適應(yīng)不合適的

18、外部環(huán)境。根據(jù)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的成分進(jìn)入溶酶體的方式可將自噬分為三種類(lèi)型:巨自噬,是指小的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器螫合在雙層膜空泡上,即自噬體,被運(yùn)輸?shù)饺苊阁w內(nèi)降解;微自噬,是細(xì)胞質(zhì)直接被溶酶體包裹消化;分子伴侶介導(dǎo)的自噬,指溶酶體表面的受體選擇性地與胞漿內(nèi)蛋白結(jié)合并介導(dǎo)其進(jìn)入溶酶體腔內(nèi)。通常所說(shuō)的自噬為巨自噬。在真核細(xì)胞生物中,自噬受著嚴(yán)格信號(hào)調(diào)控。目前發(fā)現(xiàn)的參與真核細(xì)胞自噬調(diào)控的信號(hào)通路如下:哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白,信號(hào)通路有兩個(gè)功能不同的蛋白復(fù)合體,和。其中是雷帕霉素的靶蛋白,在自噬的調(diào)節(jié)中起著非常重要的作用。在博士學(xué)位論文營(yíng)養(yǎng)豐富的情況下,被激活而抑制自噬;當(dāng)營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí),被抑制而激活自噬。對(duì)自噬的調(diào)節(jié)主

19、要通過(guò)下列兩個(gè)途徑來(lái)調(diào)節(jié)自噬:首先是調(diào)節(jié)?激酶復(fù)合體的形成,后者可以增加自噬活性;其次,通過(guò)作用于其下游靶蛋白來(lái)調(diào)控自噬。例如通過(guò)對(duì)的磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)自噬活性。在哺乳動(dòng)物中,蛋白對(duì)自噬的調(diào)控更加復(fù)雜,它不僅受細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)狀況調(diào)控,還受激素的調(diào)控,如胰島素受體、胰島素受體底物和、以及/,。/依賴(lài)的蛋白激酶通路/在營(yíng)養(yǎng)豐富的情況下,種酶和激活腺苷環(huán)化酶生成,后者與調(diào)節(jié)亞單位結(jié)合,使其與的個(gè)催化亞單位、和解離,導(dǎo)致激活,從而抑制自噬。對(duì)自噬的調(diào)節(jié)可能與其對(duì)自噬相關(guān)蛋白、和磷酸化相關(guān)。胰島素/生長(zhǎng)因子信號(hào)通路即使在營(yíng)養(yǎng)豐富的情況下,當(dāng)細(xì)胞外的生長(zhǎng)因子減少時(shí),自噬被激活。在高等真核生物中,激素對(duì)自噬的調(diào)節(jié)與營(yíng)

20、養(yǎng)不同,但是它們最終在處匯合。胰島素和胰島素樣生長(zhǎng)因子可以通過(guò) 來(lái)調(diào)節(jié)。當(dāng)激素缺乏時(shí),失活,從而激活自噬。通路當(dāng)細(xì)胞內(nèi)能量缺乏時(shí),/比值下降,通過(guò)使激活。活化的引起/復(fù)合體的激活,后者通過(guò)抑制,從而激活自噬。另外在激素缺乏或營(yíng)養(yǎng)缺乏的情況下,.通路還可以磷酸化激活。,從而激活自噬,抑制細(xì)胞凋亡。前言其它途徑另外,各種應(yīng)激反應(yīng)也均可激活自噬,如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、缺氧、氧化應(yīng)激以及病原體感染。正常情況下,機(jī)體的絕大部分細(xì)胞都維持著基礎(chǔ)的自噬活性。另外,自噬可以被細(xì)胞外如營(yíng)養(yǎng)缺乏、缺氧以及高溫等和細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激如損傷或者多余細(xì)胞器的聚集所激活。在一些疾病狀態(tài)下,如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、病原體入侵以及肌肉和肝

21、臟功能失調(diào)等均可激活自噬。自噬可發(fā)揮著有害和有益的作用,即細(xì)胞保護(hù)和細(xì)胞損傷的雙重作用。在凋亡的過(guò)程中,自噬的激活具有保護(hù)作用;但同時(shí),自噬又可以引起另一種類(lèi)型的程序性細(xì)胞死亡,白噬性細(xì)胞死亡,也稱(chēng)為型細(xì)胞死亡。事實(shí)上,過(guò)度自噬會(huì)破壞細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器的主要成分,如線(xiàn)粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng),從而導(dǎo)致整個(gè)細(xì)胞功能的崩潰, 自噬性細(xì)胞死亡同細(xì)胞凋亡和壞死的不同之處在于,不具備核濃縮、半胱天冬酶活化、片段化及細(xì)胞腫脹。自噬在心臟中也發(fā)揮著重要的作用。心衰和心肌肥厚均可誘導(dǎo)激活心肌細(xì)胞自噬。大量文獻(xiàn)報(bào)道在心肌/中自噬活性增強(qiáng)。最初,在對(duì)胚胎小鼠心臟進(jìn)行缺氧和無(wú)糖培養(yǎng)及再灌注時(shí)發(fā)現(xiàn)心肌自噬增強(qiáng)。隨后研究發(fā)現(xiàn)在灌注的兔

22、心臟中,缺血不足以誘導(dǎo)自噬,而在再灌注時(shí)自噬才升高。但是缺血時(shí)間延長(zhǎng)為時(shí)白噬增高,再灌注后自噬進(jìn)一步升高。這表明依均可增高自噬等發(fā)現(xiàn),在模型中,缺血,再灌注可以導(dǎo)致自噬的顯著升高。在對(duì)培養(yǎng)的心肌細(xì)胞進(jìn)行缺氧/復(fù)氧/,處理時(shí)也同樣發(fā)現(xiàn)自噬活性的增強(qiáng)。盡管關(guān)于心肌/中自噬的研究較多,自噬的作用仍不明確。很多研究認(rèn)為自噬增強(qiáng)在心肌/可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。等發(fā)現(xiàn),無(wú)糖培養(yǎng)的心肌細(xì)胞自噬增強(qiáng)的同時(shí)細(xì)胞死亡增加,而使用.甲基腺嘌呤.,和抑制自噬后可以減少細(xì)胞死亡,提示自噬可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡螺。博士學(xué)位論文另有研究發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞進(jìn)行/刺激時(shí),通過(guò)下調(diào) 表達(dá)或者使用抑制自噬可以減少細(xì)胞死亡,。然而等的研究發(fā)

23、現(xiàn),自噬在缺血過(guò)程中起保護(hù)作用,而在再灌注時(shí)起損傷作用。另外,等在壓力負(fù)荷的心衰模型中發(fā)現(xiàn)自噬活性增強(qiáng)可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。另外,也有很多文獻(xiàn)報(bào)道自噬在/中起著有益的作用, 。等在豬慢性心肌缺血實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),自噬作用的增強(qiáng)能使細(xì)胞凋亡率下降,而發(fā)生凋亡的細(xì)胞中自噬受到抑制。在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞模擬/模型中,等發(fā)現(xiàn),在葡萄糖剝奪培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中,抑制自噬可以增加細(xì)胞死亡。在.心肌細(xì)胞中,下調(diào)自噬基因或 表達(dá)可以抑制自噬,同時(shí)也導(dǎo)致/誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡增加,而過(guò)表達(dá)則增強(qiáng)自噬,使細(xì)胞凋亡率下降。在/過(guò)程中,線(xiàn)粒體蛋白被激活,誘導(dǎo)自噬作用上調(diào),通過(guò)自噬對(duì)損傷線(xiàn)粒體的降解而對(duì)抗細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。人們公認(rèn)的短暫的輕度缺血

24、預(yù)處理 ,能夠減輕隨后嚴(yán)重的缺血損傷,而且發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)自噬。如果抑制自噬,則的保護(hù)作用就會(huì)消除。另外,雷帕霉素、他汀類(lèi)藥物等能夠有力地誘導(dǎo)自噬,對(duì)抗/損傷,縮小心肌梗死范圍,從而產(chǎn)生保護(hù)作用。因此,盡管目前對(duì)心肌/自噬的研究較多,自噬究竟發(fā)揮著什么樣的作用仍無(wú)定論。.自噬與線(xiàn)粒體損傷之間的關(guān)系心肌能量耗竭是心衰的主要病理生理機(jī)制之一。線(xiàn)粒體是提供能量的最主要場(chǎng)所,線(xiàn)粒體損傷使能量產(chǎn)生不足,促使心功能進(jìn)一步惡化。另外,線(xiàn)粒體損傷在細(xì)胞凋亡中起決定性作用,而心肌細(xì)胞凋亡是心力衰竭的重要機(jī)制。線(xiàn)粒體損傷的主要表現(xiàn)之一是線(xiàn)粒體膜通透轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放,使膜通透性增高,從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡和自噬。,具有折疊蛋白、維持

25、鈣穩(wěn)態(tài)及脂質(zhì)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)前言物合成等功能。氧化應(yīng)激、缺血等刺激可引起未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白的過(guò)度聚集,從而導(dǎo)致功能障礙,這個(gè)過(guò)程被稱(chēng)為應(yīng)激。應(yīng)激可觸發(fā)未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng),激活一組信號(hào)通路來(lái)處理未折疊或錯(cuò)誤折疊的。適度的通過(guò)增加位于的伴侶蛋白來(lái)抑制新的蛋白質(zhì)合成并加速降解未折疊和錯(cuò)誤折疊蛋白,有利于維持細(xì)胞正常功能。但持續(xù)或嚴(yán)重的則觸發(fā)相應(yīng)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路,如果發(fā)生在心臟,則促進(jìn)心哀的發(fā)生和發(fā)展。線(xiàn)粒體損傷、自噬和應(yīng)激三者之間有緊密的聯(lián)系。應(yīng)激與線(xiàn)粒體損傷相互關(guān)聯(lián):信號(hào)可以激活和誘導(dǎo)包括、在內(nèi)的多種促凋亡蛋白質(zhì),并能激活信號(hào)通路。而、表達(dá)量的上調(diào)會(huì)引起線(xiàn)粒體膜通透性增高,膜電位除極,導(dǎo)致線(xiàn)粒體依賴(lài)的細(xì)

26、胞凋亡?？梢粤姿峄?、來(lái)增強(qiáng)其促凋亡活性。另外,還可以上調(diào)促凋亡因子/的表達(dá),是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,可以抑制一和上調(diào)的表達(dá)。而促凋亡蛋白、可以與伐結(jié)合,激活的通路,基因敲除/則的底物及其靶基因表達(dá)下降 應(yīng)激與自噬的關(guān)系:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜是自噬體膜的主要來(lái)源。總的來(lái)說(shuō),應(yīng)激是很強(qiáng)的自噬誘導(dǎo)因子。信號(hào)中的、通路均可激活自噬,而通路則負(fù)向調(diào)節(jié)自噬活性。自噬的激活可以幫助降解聚集的蛋白質(zhì),減輕應(yīng)激。線(xiàn)粒體損傷與自噬的關(guān)系:自噬通過(guò)清除損傷的線(xiàn)粒體來(lái)防止細(xì)胞內(nèi)的聚集。在多種刺激的作用下,線(xiàn)粒體膜的通透性發(fā)生改變,發(fā)生電位除極,除極化的線(xiàn)粒體膜可以通過(guò)線(xiàn)粒體激酶或信號(hào)通路來(lái)引起線(xiàn)粒體自噬。線(xiàn)粒體膜通透轉(zhuǎn)換孑 ,開(kāi)放可誘導(dǎo)

27、自噬,而抑制劑環(huán)雹素可阻止自噬弱,表明線(xiàn)粒體通透性增高與自噬有關(guān)。四有待解決的問(wèn)題及我們的假設(shè)博士學(xué)位論文雖然離體和在體研究都觀察到心肌瓜時(shí)心肌細(xì)胞自噬水平增高,但對(duì)其產(chǎn)生何種功能性作用并不清楚。關(guān)于自噬在心臟中的作用仍然有很多需要回答的問(wèn)題。有可能存在不同的信號(hào)通路來(lái)觸發(fā)促進(jìn)與細(xì)胞存活和死亡相關(guān)的自噬。因此,有必要探明在什么條件下自噬促進(jìn)細(xì)胞生和死及其相關(guān)機(jī)制。雖然有證據(jù)表明線(xiàn)粒體損傷、自噬之間存在相互聯(lián)系,但很少有研究對(duì)將二者聯(lián)系在一起的信號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行探索?；陬?lèi)似的邏輯,我們假設(shè)在/時(shí)適度的自噬水甲對(duì)心肌有保護(hù)作用,而過(guò)低和過(guò)高的自噬均會(huì)加重心肌損傷。其可能機(jī)制是適度自噬可清除受損的蛋白質(zhì)

28、和細(xì)胞器,有利于維持細(xì)胞的正常功能:自噬水甲過(guò)低會(huì)使受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器不能被及時(shí)清除,造成蓄積而加重心肌損傷;過(guò)度自噬則可能會(huì)使功能正常的蛋白質(zhì)分子及細(xì)胞器被清除,也會(huì)加重心肌損傷。我們?cè)O(shè)想在輕度瓜損傷如/時(shí)間較短時(shí),自噬增強(qiáng)會(huì)激活細(xì)胞存活的信號(hào)通路;相反,嚴(yán)重的/損傷如長(zhǎng)時(shí)間缺血后再灌注,則可能會(huì)由于長(zhǎng)期過(guò)度的自噬激活使正常的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)過(guò)度自我消化而促進(jìn)細(xì)胞死亡;而大量的心肌細(xì)胞喪失時(shí)導(dǎo)致心哀的重要原因。材料與方法材料與方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物/雄性小鼠周,體重約?,共只。 新生大鼠天共只。由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。.主要實(shí)驗(yàn)試劑/,美國(guó)胎牛血清,美國(guó),單丹磺酰尸胺,美國(guó),美

29、國(guó),美國(guó)化學(xué)發(fā)光液,提取試劑盒,美國(guó),日本 試劑盒,日本,美國(guó)、抗體、一、抗體公司,美國(guó);凋亡試劑盒 ,中國(guó)鈣黃綠素,美國(guó)一,美國(guó)蛋白定量試劑盒博士德,中國(guó)標(biāo)記的抗兔二抗,主要試劑的配制磷酸鹽緩沖液 ,:在蒸餾水中溶解博士學(xué)位論文、. 和.、. ,用調(diào)節(jié)溶液的值至.,加水定容至,在高壓下蒸氣滅菌,保存于室溫。.乙酸緩沖液:堿,./冰乙酸.,./.加蒸餾水至。,加入雙蒸水,。保存一周。最好現(xiàn)用%過(guò)硫酸銨:.現(xiàn)配。配制:堿,./冰乙酸.,./.加蒸餾水至。.,?配制:取 .溶解于單蒸水,定容至.,充分混勻。,加入膠原消化液:膠原酶, ,溶于?液,用孔徑為.濾器過(guò)濾后即配即用。缺氧液:., .,?

30、., .,.,加雙蒸水定容為.,乳酸鈉.,用雙蒸水溶解,調(diào)整,高壓滅菌于保存。復(fù)氧液:., ., .,? .,., ., .,葡萄糖.,用雙蒸水溶解,調(diào).,加雙蒸水定容為,高壓滅菌于保存。整主要實(shí)驗(yàn)儀器冷光源廣州奧元儀器公司,中國(guó)小動(dòng)物呼吸機(jī)公司,美國(guó)多導(dǎo)生理記錄系統(tǒng)埃德公司,澳大利亞于術(shù)顯微鏡廣州奧元儀器公司,中國(guó)高清攝像系統(tǒng),日本多光譜微孔板閱讀器 ,材料與方法倒置熒光顯微鏡,微量/定量?jī)x、水平瓊脂糖凝膠電泳儀和恒溫水浴箱,瑞典;干轉(zhuǎn)膜儀,美國(guó)熒光定量?jī)x,美國(guó)圖像工作站,美國(guó);凝膠成像分析儀,法國(guó);一,德國(guó);超聲儀 超凈工作臺(tái)蘇州凈化儀器廠(chǎng),中國(guó);二氧化碳孵箱 ,德國(guó);低溫高速離心機(jī),美國(guó)

31、;,瑞典;半干轉(zhuǎn)膜儀一高壓火菌器 .,日本;臺(tái)式計(jì) ,美國(guó);制冰機(jī) .,;超純水制備系統(tǒng),英國(guó);缺氧裝置,;顯微外科于術(shù)器材、。實(shí)驗(yàn)方法.原代心肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng)新生大鼠,%酒精消毒,用眼科剪從劍突下沿胸骨左緣剪開(kāi)胸廓,用眼科鑷取出心臟,于?液中漂洗三次,將血液漂洗干凈,輕輕將心臟撕裂.次,裂而不斷的程度即可。將心臟轉(zhuǎn)移至血清瓶,按每個(gè)心臟.加入 .%胰酶/,于過(guò)夜。往過(guò)夜消化的心臟中加入含%胎牛血清/每個(gè)心臟.,博士學(xué)位論文置于。恒溫?fù)u床,。棄上清,加入配制的膠原酶消化液每個(gè)心臟.,置于恒溫?fù)u床,。棄上清,加入膠原酶消化液每個(gè)心臟.,置于。恒溫振蕩器上攪拌,將上清轉(zhuǎn)移到無(wú)菌試管中。上清即為含

32、心肌細(xì)胞的混懸液。重復(fù)步驟次。將上清離心。將上清分種在直徑的培養(yǎng)皿中平均每.個(gè)心臟消化的細(xì)胞接種個(gè)平皿,。,%常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)箱中。此時(shí)%成纖維細(xì)胞及少量心肌細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。將含心肌細(xì)胞的上清轉(zhuǎn)移至無(wú)菌試管中,并用含%胎牛血清/漂洗.次,以充分回收心肌細(xì)胞。將細(xì)胞計(jì)數(shù)后按實(shí)驗(yàn)需要分別接種激光共聚焦小皿、孔板及孔板。.實(shí)驗(yàn)將分離的乳鼠心肌細(xì)胞按接種子孔板,培養(yǎng)小時(shí)后用含%胎牛血清的/換液,繼續(xù)培養(yǎng)小時(shí)。分離的原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)小時(shí)后,用不含血清的/培養(yǎng)小時(shí),分別加入不同濃度雷帕霉素和渥曼青霉素。培養(yǎng)后吸去培養(yǎng)基,漂洗次,加入缺氧液后置于含%氧氣,%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)、。在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)將孔板取出,吸去

33、上清,加復(fù)氧液繼續(xù)培養(yǎng)后更換為含%胎牛血清/培養(yǎng)?？装逯屑尤?后去培養(yǎng)液,加入,震蕩。用分光光度儀于波長(zhǎng)處讀取值,以加有培養(yǎng)液的空白孔為對(duì)照。材料與方法重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)次,取次測(cè)得的實(shí)驗(yàn)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。.檢測(cè)心肌細(xì)胞自噬將分離的乳鼠心肌細(xì)胞按/皿接種于激光共聚焦小皿,培養(yǎng)小時(shí)后,用含%胎牛血清的/換液,繼續(xù)培養(yǎng)小時(shí)。去培養(yǎng)基,用不含血清的/培養(yǎng)小時(shí),去培養(yǎng)基,加入缺氧液后置于含%氧氣,%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)、。去缺氧液,加復(fù)氧液繼續(xù)培養(yǎng)后,加入.州,。孵育。加入漂洗次。%多聚甲醛固定。漂洗次在倒置熒光顯微鏡下,用.波長(zhǎng)激發(fā)光觀察細(xì)胞內(nèi)的自噬顆粒,軟件分析結(jié)果。并用. 檢測(cè)細(xì)胞凋亡取潔凈蓋玻片在%

34、/醇中浸泡分鐘,無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)吹干或用無(wú)菌的或.%等溶液洗滌三遍,再用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌一遍。將蓋玻片置于六孔板內(nèi),種入細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜,使約為%一%滿(mǎn)。刺激細(xì)胞發(fā)生凋亡后,吸盡培養(yǎng)液,加入.固定液,固定分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間可。過(guò)夜。去固定液,用或.%洗兩遍,每次分鐘,吸盡液體。洗滌時(shí)宜用搖床,或手動(dòng)晃動(dòng)。加入. 染色液,染色分鐘。也宜用搖床,或于動(dòng)晃動(dòng)數(shù)次。博士學(xué)位論文去染色液,用或.%洗兩遍,每次分鐘,吸盡液體。洗滌時(shí)宜用搖床,或于動(dòng)晃動(dòng)。滴一滴抗熒光淬火封片液于載玻片上,蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片,讓細(xì)胞接觸封片液,盡量避免氣泡。熒光顯微鏡可檢測(cè)到呈藍(lán)色的細(xì)胞核。激發(fā)波長(zhǎng)左右,發(fā)射波長(zhǎng)壽右。.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心

35、肌細(xì)胞線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放將分離的乳鼠心肌細(xì)胞按/接種于直徑為 ,培養(yǎng)小時(shí)后,用含%胎牛血清的/換液,繼續(xù)培養(yǎng)小時(shí)。加入雷帕霉素和渥曼青霉素培養(yǎng),去培養(yǎng)基,用洗次。設(shè)常氧對(duì)照組,缺氧組心肌細(xì)胞加入缺氧液,將心肌細(xì)胞缺氧孵箱中培養(yǎng)、。更換復(fù)氧液,%常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)箱中。去復(fù)氧液,漂洗次,先后加入鈣黃綠素、氯化鈷,。漂洗次。加入.%胰酶/ 室溫放置約,顯微鏡下觀察到大多數(shù)貼壁心肌細(xì)胞漂浮起來(lái)。加入.含有%胎牛血清的/,用吸管輕輕將貼壁心肌細(xì)胞管。吹打起來(lái),轉(zhuǎn)移到.離心。用.重懸心肌細(xì)胞,混勻后,取加入到孔板中,用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。.激光共聚焦檢測(cè)線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放材料與方法將分離的乳鼠心肌細(xì)胞

36、按.×/接種于激光共聚焦玻底小皿,培養(yǎng)小時(shí)后,用含%胎牛血清的/換液,繼續(xù)培養(yǎng)小時(shí)。加入雷帕霉素和渥曼青霉素培養(yǎng),去培養(yǎng)基,用洗次。設(shè)常氧對(duì)照組,缺氧組心肌細(xì)胞加入缺氧液,將心肌細(xì)胞缺氧孵箱中培養(yǎng)、。更換復(fù)氧液,%常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)箱中。去復(fù)氧液,漂洗次,先后加入鈣黃綠素、氯化鈷,。漂沈次。激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)鈣黃綠素的熒光,激發(fā)光,發(fā)射光。軟件分析其熒光強(qiáng)度。用.激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位本研究采用.探針來(lái)指示線(xiàn)粒體膜電位。.是一種廣泛用于檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位的理想熒光探針?？梢詸z測(cè)細(xì)胞、組織或純化的線(xiàn)粒體膜電位。在線(xiàn)粒體膜電位較高時(shí),.聚集在線(xiàn)粒體的基質(zhì)中,形成聚合物,可以產(chǎn)生紅色熒

37、光;在線(xiàn)粒體膜電位較低時(shí),.不能聚集在線(xiàn)粒體的基質(zhì)中,此時(shí).為單體,可以產(chǎn)生綠色熒光。這樣就可以非常方便地通過(guò)熒光顏色的轉(zhuǎn)變來(lái)檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對(duì)比例來(lái)衡量線(xiàn)粒體去極化的比例。將分離的乳鼠心肌細(xì)胞按.×/接種于激光共聚焦玻底,培養(yǎng)小時(shí)后,用含%胎牛血清的/換液,繼續(xù)培養(yǎng)小時(shí)。加入雷帕霉素和渥曼青霉素培養(yǎng),去培養(yǎng)基,用洗次。設(shè)常氧對(duì)照組,缺氧組心肌細(xì)胞加入缺氧液,將心肌細(xì)胞缺氧孵箱中培養(yǎng)、。博士學(xué)位論文更換復(fù)氧液,%常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)箱中。去復(fù)氧液,漂洗次,先后加入.熒光探針,。漂洗次。激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)鈣黃綠素的熒光,激發(fā)光波長(zhǎng)為,發(fā)射光波軟件分析其兩種熒光的強(qiáng)度,

38、長(zhǎng)為綠光和紅光。用計(jì)算/比值。.小鼠心梗及心肌缺血一再灌注模型的建立/雄性小鼠,.周齡,.。隨機(jī)分為如下組:假手術(shù)組;假手術(shù)雷帕霉素組;假手術(shù)渥曼青霉素組;/ 缺血時(shí)間雷帕霉素組;/ 渥曼青霉素組;,再灌;/缺血時(shí)間,再灌;/雷帕霉素組;/渥曼青霉素組;心梗組缺血;心梗雷帕霉素組:心梗渥曼青霉素組。對(duì)于藥物治療組,術(shù)前腹腔注射雷帕霉素./或渥曼青霉素./。圖.小鼠心肌/模型的建立和實(shí)驗(yàn)設(shè)施/ . .模型建立見(jiàn)圖:戊巴比妥鈉麻醉/,將小鼠四肢及頭部固定在手術(shù)臺(tái)上,氣管插管,接小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助通氣,次/分鐘,潮氣量材料與方法.。用銀針探頭接小鼠右上及雙下肢,連接生理記錄儀,記錄心電圖。脫去其左側(cè)胸

39、部毛,%酒精消毒手術(shù)區(qū),從第肋間處水平橫行剪開(kāi)皮膚、胸大肌、前鋸肌及肋間肌肉,暴露小鼠心臟,將小鼠改為右側(cè)臥位。鈍性剝開(kāi)心包膜及胸腺,暴露左心耳及左心室,用.無(wú)損傷線(xiàn)于左心耳中部、下緣進(jìn)針,右/處出針。對(duì)于缺血.再灌注模型,可將一直徑約.光滑小珠置于結(jié)扎區(qū),扎活結(jié),心電圖上見(jiàn)段抬高,結(jié)扎心肌變白即為成功。缺血預(yù)定的時(shí)間后將活結(jié)松開(kāi);對(duì)于心梗模型,可直接系死結(jié)結(jié)扎。假手術(shù)組開(kāi)胸及心臟穿線(xiàn),但不打結(jié)。動(dòng)物術(shù)后處死,從心臟取血,離心,取上清后置于.保存以檢測(cè)乳酸脫氫酶;心臟組織于液氮速凍后轉(zhuǎn)移至.保存以提取和蛋白用,對(duì)于用于制作石蠟切片的心臟組織需先用預(yù)冷的約從左心室心尖處注入以洗凈血液,然后將心臟

40、置于%中性甲醛固定.。. 染色檢測(cè)心肌細(xì)胞梗死區(qū)戊巴比妥鈉麻醉小鼠,氣管插管,呼吸機(jī)輔助通氣,方法同前。從劍突下剪開(kāi)小鼠上腹部皮膚,鈍性分離膈肌,從腋中線(xiàn)處剪開(kāi)雙側(cè)肋骨至第肋,鈍性分離皮下及心包以充分暴露左、右心耳及心室。迅速取下心臟,于冰預(yù)冷的中漂洗干凈。.速凍,用刀片從心尖開(kāi)始至左心耳處沿與縱軸垂直的方向切成厚度約. 片。將切片的心臟置于%中,。顯微相機(jī)照相,用 軟件計(jì)算左心室 ,和,灰白色區(qū)面積。心肌梗死區(qū)面積占左室面積百分心肌梗死區(qū)比。.乳酸脫氫酶測(cè)定于孔板中分別加入待測(cè)血清,然后各.抗.抗體、鏈酶親和素.;空白對(duì)照孔不加樣品,生物素標(biāo)記的抗抗體,鏈霉親博士學(xué)位論文和素.,只加顯色劑和

41、終止液,其余各步操作相同;標(biāo)準(zhǔn)品孔中只加,蓋上封板膜,輕輕振蕩混勻,溫育。入標(biāo)準(zhǔn)品,鏈霉素.揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿(mǎn)洗滌液,靜置秒后棄去,如此重復(fù)次,拍干。每孔先加入顯色劑,再加入顯色劑 ,輕輕震蕩混勻,避光顯色。每孔加終止液,終止反應(yīng)此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。以空白空調(diào)零,波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的直線(xiàn)回歸方程,再根據(jù)樣品的值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。.心肌細(xì)胞總蛋白的提取棄細(xì)胞培養(yǎng)液,。預(yù)冷的漂洗次;加入裂解液含,:,其中直徑的力裂解液,冰上放置,用塑料小刮刀將貼壁心肌細(xì)胞剝離下來(lái)。將裂解液轉(zhuǎn)移至. 管,置冰上,每混勻次。將裂解液,離

42、心。管中,保存。取上清分裝于.心肌組織總蛋白的提取將心臟取下后置于 管中,加入 裂解液含,:,盡可能剪碎心臟。用電動(dòng)勻漿器于冰上勻漿心肌組織次,每次,間隔。將裂解液,離心。取上清分裝于. 管中,.保存。材料與方法.法測(cè)蛋白濃度方法參照說(shuō)明書(shū)按:的體積比加入試劑和,充分混勻以配置工作液。將凍干標(biāo)準(zhǔn)品用稀釋成/的儲(chǔ)存液,從高濃度到低濃度分別稀釋為下列濃度:/、./、¨/、肛/、/、¨、嵋/、。取標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入孔板加入工作液,充分混勻,孵育。用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)處測(cè)值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出蛋白濃度。.檢測(cè)自噬及凋亡相關(guān)蛋白參照文獻(xiàn)配制%分離膠和%濃縮膠,在加樣孔中緩慢加入約樣品蛋白,接通電源,先以的電壓電泳,待樣品進(jìn)入分離膠后將電壓調(diào)至/,直至溴酚藍(lán)指示劑接近凝膠底部。取出凝膠,去濃縮膠,參照說(shuō)明書(shū)用 進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,電壓,轉(zhuǎn)膜時(shí)間。用配制%封閉液,將膜浸入封閉