細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的問(wèn)題

1、細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的問(wèn)題2006-11-23 15:53細(xì)胞中的顆粒到底是怎么回事？我的細(xì)胞總有顆粒，開(kāi)始是細(xì)胞中有，后來(lái)細(xì)胞之間也好像有許多顆粒。好像是細(xì)胞碎片一樣。是什么東西啊？是支原體污染嗎？這可是我剛買(mǎi)回來(lái)的細(xì)胞啊!我們實(shí)驗(yàn)室也有這種情況，是不是黑的小碎片，有人說(shuō)是細(xì)胞代謝產(chǎn)物，后來(lái)拿到高倍鏡下看還會(huì)動(dòng)，就懷疑是污染了，也想問(wèn)問(wèn)大家到底是什么是黑色的小碎片。我沒(méi)注意到它會(huì)動(dòng)，只是覺(jué)得不像是活的微生物。我覺(jué)得是由于某種污染或外界因素導(dǎo)致的細(xì)胞狀態(tài)變差，裂解出的東西。但是，是什么東西不清楚。 的確很常見(jiàn)在以前帖子見(jiàn)到說(shuō)是“黑焦蟲(chóng)”。長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)的很容易出現(xiàn)，我根據(jù)自己的經(jīng)驗(yàn)估計(jì)是一種污

2、染，因?yàn)殡S著黑點(diǎn)增多，本來(lái)生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞逐漸停滯甚至死亡。而且我后來(lái)原代培養(yǎng)的幾批細(xì)胞并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，我懷疑有好多細(xì)胞系本身就是污染的。不過(guò)增加換液次數(shù)的情況下，好象一般不太嬌氣的細(xì)胞生長(zhǎng)不是很受影響。以前聽(tīng)很有經(jīng)驗(yàn)的老師說(shuō)黑焦蟲(chóng)是國(guó)產(chǎn)血清的問(wèn)題，可以有條件換進(jìn)口血清試試，或者離心一下也可能能解決問(wèn)題。那么所謂的“黑焦蟲(chóng)”到底是什么東西?。坑姓l(shuí)知道？我培養(yǎng)的細(xì)胞也出現(xiàn)過(guò)此中問(wèn)題，放到高倍鏡下看時(shí)有東西在動(dòng)，但培養(yǎng)液不混濁，估計(jì)不是細(xì)菌污染，可能是血清問(wèn)題，是支原體污染。我培養(yǎng)的細(xì)胞也出現(xiàn)過(guò)這樣的問(wèn)題，我個(gè)人認(rèn)為是一種支原體污染。國(guó)產(chǎn)血清是罪魁禍?zhǔn)?，因?yàn)橹灰獙⒓?xì)胞饑餓一下，不超過(guò)24小時(shí)，這種東西就

3、會(huì)瘋長(zhǎng)我培養(yǎng)的細(xì)胞也有出現(xiàn)這中情況。但是并不影響細(xì)胞生長(zhǎng)。應(yīng)該不是支原體污染最近，我復(fù)蘇細(xì)胞細(xì)胞的時(shí)候也發(fā)現(xiàn)過(guò)這樣的東西，盡管我用的是GIBCO的FBS，后來(lái)，每天換液之前洗幾遍后，就慢慢變少，現(xiàn)在沒(méi)了 細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)菌污染我們新建的細(xì)胞室。每周都會(huì)做清潔，用0。2%新潔爾滅消毒，照紫外。實(shí)驗(yàn)前也會(huì)照至少30分鐘。培養(yǎng)基中加青霉素，鏈霉素。可是培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)還是常有細(xì)菌污染，有時(shí)甚至分析不出原因。用培養(yǎng)瓶還好一點(diǎn)，用多孔板或平皿就更凄慘。我養(yǎng)的是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，不知各位有什么好的方法避免污染！謝謝！很可能是超凈臺(tái)無(wú)效了，或者培養(yǎng)基？  其實(shí)嚴(yán)格操作箱污染都難我們是新的超凈臺(tái)，不可能

4、失效。而且用同一瓶培養(yǎng)基，一瓶傳兩瓶，原始的一瓶污染，新傳的很好。所以我分析不出原因呀那么假如把原始的那瓶換新瓶養(yǎng)可以么？都污染了，我仍還來(lái)不及，那還敢換新瓶染菌有很多原因，因?yàn)檎麄€(gè)細(xì)胞操作過(guò)程均要求無(wú)菌，所以看看操作是否規(guī)范，例如戴手套等。多半是環(huán)境因素，做點(diǎn)平板，操作時(shí)放在幾個(gè)地方，培養(yǎng)后看看長(zhǎng)菌情況。消毒用新潔爾滅好象不是太有用。人是最大的污染源，不知你做好手部的消毒工作以及戴口罩沒(méi)有，其實(shí)，只要你操作的好，嚴(yán)格在靠近火的附近操作，污染的幾率是很小的。從你的描述中可以看出培養(yǎng)基應(yīng)該沒(méi)有問(wèn)題，新的一瓶很好，老的一瓶污染，只有操作不當(dāng)引起的，還需要加強(qiáng)練手。  求助！關(guān)于

5、細(xì)胞培養(yǎng)中的真菌污染！感激！先謝謝大家的幫助！現(xiàn)在細(xì)胞培養(yǎng)基里出現(xiàn)了很多白色和黑色的小點(diǎn)，有好長(zhǎng)的時(shí)間了！細(xì)胞的形態(tài)看起來(lái)不太好，但是有些細(xì)胞也長(zhǎng)的很好，如成纖維細(xì)胞，但是內(nèi)皮細(xì)胞就差很多！加大量的抗生素沒(méi)有效果！不知道是不是真菌污染，怎么鑒別！因?yàn)榕囵B(yǎng)了很長(zhǎng)時(shí)間都沒(méi)有出現(xiàn)真菌的菌絲，所以不能肯定是真菌！那些白色的小圓點(diǎn)有點(diǎn)象白色鏈球菌或鏈珠菌，但是不能確定！怎么樣才能判斷確定，改用什么辦法解決！謝謝大家的幫助！殺滅真菌聽(tīng)說(shuō)用兩性霉素，但從沒(méi)試過(guò)。真菌污染是件很麻煩的事，可能重新復(fù)蘇細(xì)胞是最好的辦法。同時(shí)該注意如何防止污染。我覺(jué)得如果是真菌污染，培養(yǎng)基會(huì)渾濁，是肉眼可見(jiàn)的渾濁。在這種情況下最好

6、趕緊將該瓶細(xì)胞扔掉，免得引起培養(yǎng)箱中的大規(guī)摸污染。在顯微鏡下，真菌是成念珠狀的，這時(shí)細(xì)胞界限不清。這可能是不規(guī)范操作引起的，安全起見(jiàn)還是將細(xì)胞室全面打掃一下，用新潔爾滅擦，紫外照！謝謝大家的幫助，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室以前從來(lái)就沒(méi)有這樣的污染，所以大家也沒(méi)有經(jīng)驗(yàn)！現(xiàn)在就是不能確定是不是污染。我不可能把實(shí)驗(yàn)室所有的細(xì)胞都扔掉，因?yàn)橛泻枚嗳硕荚谝黄痧B(yǎng)不同類(lèi)型的細(xì)胞！現(xiàn)在確實(shí)是問(wèn)題，培養(yǎng)基也沒(méi)有渾濁，操作的時(shí)候已經(jīng)十二分的小心了！我想問(wèn)一下，你看到的那些白色或黑色的圓點(diǎn)是在低倍還是高倍顯微鏡下？若培養(yǎng)基不混濁，可能真的是細(xì)胞狀態(tài)太差，沒(méi)有貼壁還縮成球狀。難道你們實(shí)驗(yàn)室所有細(xì)胞都用一瓶培養(yǎng)基？只要將污染的扔掉就行

7、，沒(méi)必要都扔掉！兩性霉素！sigma在華美有分裝！但是濃度很小，關(guān)鍵還是環(huán)境問(wèn)題！黑白圓點(diǎn)在100倍顯微鏡下有多大，是不是酵母菌小黑點(diǎn)和小白點(diǎn)是在200倍的顯微鏡下觀察所見(jiàn)，大小可能是細(xì)胞核的1/5到1/4左右！細(xì)胞狀態(tài)不好是因?yàn)楦郧芭囵B(yǎng)的細(xì)胞來(lái)比較所得，細(xì)胞能貼壁，能生長(zhǎng)，但是沒(méi)有以前的那么快，而且形態(tài)看的也不好！另外問(wèn)一下sleevexz，酵母菌是什么樣的，怎么鑒別！還有一個(gè)問(wèn)題就是，實(shí)驗(yàn)室用的雙抗是從Gibco公司買(mǎi)過(guò)來(lái)的直接使用的液體，具體規(guī)格是100ml一瓶，Pelicillin-Streptomycin 一起，50倍的，要求儲(chǔ)存在20 C，但是有效期只到2002年9月，現(xiàn)在都已經(jīng)

8、差不多過(guò)期半年了，但是實(shí)驗(yàn)室的老師都說(shuō)沒(méi)有問(wèn)題，可以用，現(xiàn)在大家就都是一直用這樣的抗生素在！你們說(shuō)會(huì)不會(huì)是抗生素的問(wèn)題的！  養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)常無(wú)緣無(wú)辜的染菌？煩煩煩！我是一個(gè)新手，但已養(yǎng)細(xì)胞近半年，最近一段時(shí)間經(jīng)常染菌，有時(shí)是培養(yǎng)基，有時(shí)連原因都找不到，在實(shí)驗(yàn)中我也非常小心，但結(jié)果總讓我傷心?，F(xiàn)在都有點(diǎn)神經(jīng)質(zhì)了，請(qǐng)各位指點(diǎn)你這個(gè)問(wèn)題說(shuō)大不大，說(shuō)小也不小。說(shuō)不大呢，七個(gè)字就可以回答你：嚴(yán)格按照無(wú)菌要求。說(shuō)不小呢，這無(wú)菌要求的話匣子一打開(kāi)太大。還是簡(jiǎn)要吧：1.將試驗(yàn)用品放入超凈工作臺(tái)用紫外線照射30分鐘；2. 照射30分鐘后，進(jìn)入緩沖間，換滅菌的無(wú)菌衣，換專(zhuān)用拖鞋；3.手部用5的潔爾

9、滅浸泡2分鐘，進(jìn)入潔凈區(qū)后，用75的酒精棉球再次擦拭裸露的手部。4.最好戴口罩；5.操作時(shí)盡量靠近火焰；6.裝培養(yǎng)基的瓶子等不要直接口向上，用一個(gè)架子斜放，瓶口朝向火焰；7.標(biāo)準(zhǔn)操作，不要讓無(wú)菌吸管到處碰來(lái)碰去；8.中途出入無(wú)菌室，再次操作時(shí)，一定要再次用75的酒精棉球消毒。一下也想不了那么多，具體的你再問(wèn)吧。最好把你怎么操作的過(guò)程描述一遍，我們就好針對(duì)性的指出錯(cuò)誤了。建議你把細(xì)胞室，好好清理一下，污染是這樣的，出現(xiàn)一次就比較麻煩，千萬(wàn)別急。還有，你們的紫外燈沒(méi)有問(wèn)題吧？非常感謝樓上的回信，在操作中我也嚴(yán)格按照無(wú)菌要求去做，因?yàn)椴僮髋_(tái)是公用的，而其它同學(xué)很少染菌，我想主要問(wèn)題應(yīng)在我身上，但是又

10、找不到主要原因。我一般是這樣操作的：紫外照后，用酒精棉檫拭手部開(kāi)始操作，基本步驟是吸培養(yǎng)液到方瓶，再在方瓶中吹打混合，按比例傳代，有時(shí)吸管頭部碰在培養(yǎng)瓶口，有時(shí)吸管口棉花塞的太緊或太松不好用，有時(shí)原因都找不到，請(qǐng)各位指點(diǎn)。戴手套試試巴最好是涂片看看是什么菌？注意操作，吸管碰別處立即更換。污染是常有的事，也不必太給自己壓力，熟能生巧。你的滴管吸管進(jìn)培養(yǎng)液瓶和細(xì)胞培養(yǎng)瓶前要在酒精燈上仔細(xì)烤一下，滴管不要反復(fù)用。其實(shí)無(wú)菌操作第一重要的就是你的超凈臺(tái)是不是還能用，濾網(wǎng)要及時(shí)清洗的。其次就是瓶口、滴管、移液器操作是過(guò)火的是否正確。還有一點(diǎn)很重要，手一定不能在任何瓶口上方經(jīng)過(guò)！從你操作的步驟來(lái)看，你的細(xì)胞

11、應(yīng)該是很好操作的。沒(méi)看到你要用消化液，這就減少了污染的機(jī)會(huì)。你用的吸管是自己做的嗎？經(jīng)常練練，熟能生巧，時(shí)間長(zhǎng)了，你就知道如何控制所塞的棉花量了。（用牙簽或12號(hào)針頭等工具來(lái)塞比較方便，塞完后用火將露出的部分燒掉再滅菌，這樣就不會(huì)在上吸耳球的過(guò)程中，出現(xiàn)將棉花弄掉的情況），另外，你要勤剪指甲，不要戴首飾，吸管一周滅一次菌，不要沒(méi)用完老用。操作是導(dǎo)致污染的最主要原因根據(jù)本人的經(jīng)驗(yàn)，操作是導(dǎo)致細(xì)菌污染的最主要原因。本人以前曾經(jīng)在一個(gè)相當(dāng)嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室工作過(guò)，那里的細(xì)胞室的要求是按照外科手術(shù)室要求的，更衣，換鞋，洗手，酒精擦手，戴口罩、帽子，所有培養(yǎng)液中加雙抗，所有細(xì)胞操作器械專(zhuān)用；每天紫外燈照射40

12、分鐘后才允許進(jìn)入。但是，就是這樣的條件，操作不好，一樣要污染?，F(xiàn)在本人工作的實(shí)驗(yàn)室要求比那個(gè)實(shí)驗(yàn)室差的天遠(yuǎn)地遠(yuǎn)，但是只要操作仔細(xì)了，一樣可以把最難養(yǎng)的細(xì)胞養(yǎng)好。本人曾經(jīng)參觀過(guò)一些名人進(jìn)行細(xì)胞操作，也就是換上拖鞋，連工作服都不換就進(jìn)細(xì)胞室，細(xì)胞一樣沒(méi)有問(wèn)題。所以，最主要的是：工作服，尤其是袖口，消毒情況如何，袖口是否能夠扎緊。如果不能保證，不如索性把袖口挽起來(lái)，把手臂用酒精擦一遍（其實(shí)我本人連擦都懶得擦，一樣沒(méi)事）。操作時(shí)，滴管兩頭都要燒。還有一點(diǎn)很重要，就是滴管頭在加液體的時(shí)候，不要深入瓶口太多。在倒培養(yǎng)液的時(shí)候，可以拿起培養(yǎng)瓶直接倒，但是注意要倒干凈，瓶口沾的最后一滴液體千萬(wàn)不可回流倒瓶?jī)?nèi)。

13、還有一些基本的問(wèn)題，比如瓶口要多燒一會(huì)，懷疑滴管有污染就一定要換。一旦細(xì)胞出現(xiàn)污染的跡象了，就一定要扔掉。如果實(shí)在想挽救，可以用一些高檔抗生素（醫(yī)院里給病人加藥后的藥瓶，用無(wú)菌鹽水涮涮就能用，濃度足夠），但要小心濃度太高細(xì)胞也會(huì)死亡。對(duì)付霉菌通常用飽和的硫酸銅溶液，放在培養(yǎng)箱的裝水盤(pán)中，細(xì)胞房的空調(diào)要用除濕的功能。如果不幸染上，要用84液擦培養(yǎng)箱，再用75%酒精擦。滅菌操作：在無(wú)菌箱內(nèi)每立方米用甲醛810毫升，高錳酸鉀5克，熏蒸45分鐘后接種在無(wú)菌箱中每立方米用甲醛810毫升、高錳酸鉀0.25千克，熏蒸45分鐘后接種，栽培種接種量按每瓶二級(jí)種接3040袋為宜。（一）常用消毒劑 現(xiàn)將常用的消毒藥

14、品及其配制、使用方法，介紹如下：1 35甲醛水溶液（HCHO）：又名福爾馬林，使蛋白質(zhì)變性。用于培養(yǎng)室、無(wú)菌室的滅菌。 20.1的升汞水（HgCL3）：能使蛋白質(zhì)變性，抑制酶類(lèi)。0.1升汞配制方法是稱(chēng)取升汞0.1克，    用少許酒精溶解，再加水至100毫升即成。用于無(wú)菌箱、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿四周表面以及手指的滅菌。 3石炭酸（C6H5OH），5濃度噴霧后，能使蛋白變性沉淀。石炭酸（苯酚）50毫升，加水950毫升配成。用于 工作服、實(shí)驗(yàn)桌的滅菌。殺菌效果同升汞。 4高錳酸鉀（KMnO4）：氧化劑。0.1濃度能使蛋白質(zhì)與氨基酸氧化，失去酶的活性，用于消毒，能抑制或殺死

15、雜菌。 5乙醇（CH3CH3OH）：又稱(chēng)酒精。消毒以75濃度的效果最好。它能使蛋白質(zhì)脫水變性。高濃度酒精會(huì)使蛋白質(zhì)很快脫水凝固，消毒作用反而減弱。 6新潔爾滅：0.25新潔爾滅用于無(wú)菌箱、無(wú)菌室的滅菌。一般新潔爾滅5原液50毫升；加水950毫升配成。 7漂白粉水：取漂白粉10克，加水140毫升配成。通常在使用前臨時(shí)配制，靜置12小時(shí)，取上清液噴射，進(jìn) 行室內(nèi)消毒，每平方米用1升。 8藥皂：煤酚皂、硼酸皂等各種藥皂的水溶液，均可用于器具、橡皮塞及手指的消毒。 92硫酸銅溶液：用硫酸銅（膽礬）2克，加水至 100毫升加熱溶解配成。用于床架、木架等各種菌種架的消 毒。還可用5硫酸銅溶液。 100.5

16、波爾多液：先用硫酸銅1斤，溶于100斤水， 再用石灰1斤，加水100斤。然后等量混合起來(lái)即成。用于菌種架、段木的消毒。 11.多菌靈：用于殺滅真菌、半知茵。1：800倍拌料或 1：500倍噴灑均可。 （二）無(wú)菌箱及無(wú)菌室的消毒滅菌 無(wú)菌箱的消毒滅菌，可采取以下幾種方法： l用甲醛和高錳酸鉀混合熏蒸：一般每平方米需40甲醛10毫升、高錳酸鉀8毫升，進(jìn)行熏蒸。使用時(shí)，先密閉門(mén)窗，量甲醛溶液盛入容器中、然后倒入量好的高錳酸鉀，人員隨之離開(kāi)接種室，關(guān)緊房門(mén)，熏蒸2030分鐘即可。 20.1升汞水消毒：用0.1升汞水浸過(guò)的紗布或海綿進(jìn)行指擦，或用噴霧器噴霧滅菌，使箱內(nèi)的上下左右都沾上升汞水，手也可用升汞

17、水消毒，并把袖子卷起來(lái)。噴霧后 2030分鐘，箱內(nèi)的雜菌和霧滴一起落到箱底被殺死，內(nèi)部的空氣就變得很清潔。 3紫外線照射滅菌：在無(wú)菌箱中裝一支200伏、3O瓦的紫外線燈管；每次開(kāi)2030分鐘，就能達(dá)到空間殺菌的 目的。照射結(jié)束后，罩黑布半小時(shí)，以增強(qiáng)殺菌效果。 4石炭酸噴霧：在每次接種之前，用5石炭酸溶液噴霧，可促使空氣中的微粒和雜菌沉降，防止桌面微塵飛揚(yáng)，并有殺菌作用。 5石灰揩擦：經(jīng)常用藥物熏蒸，易造成酸性環(huán)境，特別用甲醛和高錳酸鉀熏蒸長(zhǎng)久，污染往往越來(lái)越嚴(yán)重，預(yù)防辦法可把各種藥品交替使用，過(guò)一段時(shí)間（約五周）用石灰擦洗一遍。實(shí)踐證明，這樣做效果很好。 無(wú)菌室消毒同無(wú)菌箱。 （三）無(wú)菌室的

18、使用規(guī)程 無(wú)菌室無(wú)固定程序，但按一般操作應(yīng)遵循如下規(guī)程： 1接種室內(nèi)和緩沖室內(nèi)使用前，用5石炭酸溶液噴霧。把所需要的器材搬入緩沖室清洗，等曬干后搬入接種 室，打開(kāi)紫外線燈，照射殺菌。 2穿上工作服及無(wú)菌工作帽、鞋，然后用煤皂液洗手2 分鐘。進(jìn)人接種室后，查驗(yàn)器械是否放在一定位置。然后用 5石炭酸溶液重點(diǎn)在工作臺(tái)的上方和附近的地面上噴霧。然后退回緩沖室。還可給接種室門(mén)口地面灑一層石灰，進(jìn)門(mén)時(shí)踩石灰可使鞋底保持無(wú)雜菌狀態(tài)。 3接種操作前，用70的酒精棉球擦手。進(jìn)行無(wú)菌操作時(shí)，要嚴(yán)格認(rèn)真，動(dòng)作輕捷，盡量減少空氣流動(dòng)。 4工作結(jié)束后，立即將臺(tái)面收拾干凈，不留殘物。然后用5石炭酸全面噴灑。 5操作時(shí)，注

19、意安全。如棉塞著火，用手緊握即可熄滅。如打破菌瓶，可用抹布沾5石炭酸，收拾到廢物桶 內(nèi)。每次的污染物應(yīng)小心放在盤(pán)內(nèi)，蓋嚴(yán)拿出室外深埋或燒掉。 （四）無(wú)菌室空氣污染情況的檢驗(yàn) 定期檢驗(yàn)無(wú)菌室空氣污染情況，對(duì)改進(jìn)滅菌措施，提高成品率是非常必要的。常用方法步驟如下： 1平板檢驗(yàn)法：用常規(guī)培養(yǎng)基，倒成平板，收入接種室。在事先熏蒸好的接種室，使用前半小時(shí)或1小時(shí)把供試的培養(yǎng)皿或試管打開(kāi)，按預(yù)定時(shí)間蓋好培養(yǎng)皿或試管。留對(duì)照皿不打開(kāi)。然后一起放入30的溫箱中培養(yǎng)48小時(shí)，檢查有無(wú)菌殖生長(zhǎng)，并由菌落形態(tài)，判斷雜菌種類(lèi)。一般要求平板培養(yǎng)基開(kāi)蓋5分鐘，菌落不超過(guò)3個(gè)；敘面培養(yǎng)基開(kāi)塞 30分鐘者，以不出現(xiàn)菌落為合格

20、。 2斜面檢驗(yàn)法：將常用的瓊脂斜面培養(yǎng)基各取二管， 放入接種室，按無(wú)菌操作各將其中的一管的棉塞取出，放在滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)。經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，再將棉塞通過(guò)火焰，塞回試管，連同對(duì)照一起培養(yǎng)。經(jīng)48小時(shí)后，檢驗(yàn)無(wú)雜菌生長(zhǎng)。和上邊方法同。 3空氣污染情況檢驗(yàn)：在接種過(guò)程中，人員的出過(guò)、器材的搬放、接種操作的動(dòng)作等原因造成空氣污染，檢驗(yàn)方法是在準(zhǔn)備工作結(jié)束后，接種操作開(kāi)始時(shí)，按上述方法打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋子或試管塞，經(jīng)5分鐘、30分鐘或直到工作結(jié)束時(shí)再蓋好，以檢驗(yàn)在不同的使用時(shí)間內(nèi)，空氣污染的程度。 如霉菌較多時(shí)；可先用5石炭酸全面噴射后，再用甲醛熏蒸。如細(xì)菌較多時(shí)，可采取用乳酸和甲醛交替熏蒸的辦法加以殺滅。黑膠蟲(chóng)

21、 1、 黑膠蟲(chóng)概況： 在細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)候，有時(shí)會(huì)在400倍顯微鏡下看到小黑點(diǎn)在動(dòng)，小黑點(diǎn)有時(shí)呈點(diǎn)狀，有時(shí)呈小的片狀，運(yùn)動(dòng)形式為在原地振動(dòng)（類(lèi)似布朗運(yùn)動(dòng)），這種小黑點(diǎn)既不是細(xì)菌、霉菌，也不是支原體（我們?cè)?jīng)請(qǐng)周守長(zhǎng)用血平板培養(yǎng)過(guò)，沒(méi)有菌落出現(xiàn)），目前業(yè)內(nèi)人士稱(chēng)其為“黑膠蟲(chóng)”。 黑膠蟲(chóng)到底是否為生物？這個(gè)一直是業(yè)內(nèi)人士的疑惑。黑膠蟲(chóng)一般是存在血清里的，而血清通常是經(jīng)過(guò)0.1m濾膜過(guò)濾的,所以血清里不可能存在細(xì)菌、霉菌及支原體等微生物。如果說(shuō)黑膠蟲(chóng)不是生物，它會(huì)不斷增多，達(dá)到一定數(shù)量時(shí)會(huì)與細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)，與細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)，從而使得細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不足而死亡。 不管對(duì)于黑膠蟲(chóng)的爭(zhēng)論如何,但有幾個(gè)是目前大

22、家公認(rèn)的： 與細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有不利影響。 “黑膠蟲(chóng)”會(huì)增殖，增殖多時(shí)，視野下一大片都為“黑膠蟲(chóng)”。 “黑膠蟲(chóng)”與血清有關(guān)，與血清質(zhì)量有很大關(guān)系。 2、目前對(duì)“黑膠蟲(chóng)”的定論：有2種解釋?zhuān)?第一， 黑膠蟲(chóng)為生物。它是小于細(xì)菌的生物，直徑小于0.1m，大多國(guó)外血清中多見(jiàn)，可能是國(guó)外牛血清中含有的某種原蟲(chóng)。只要它是生物，那么在培養(yǎng)基中一定會(huì)對(duì)細(xì)胞有影響。 第二， 黑膠蟲(chóng)不是生物。國(guó)內(nèi)的血清中，通常滅活之后都會(huì)有絮狀沉淀出現(xiàn)，而黑膠蟲(chóng)出現(xiàn)時(shí)，所使用的血清被反復(fù)凍融過(guò)多次。所以推測(cè)，所謂的“黑膠蟲(chóng)”其實(shí)就是血清中的某些蛋白成分的物質(zhì)，經(jīng)過(guò)滅活之后喪失活性，在培養(yǎng)基中，鏡檢見(jiàn)到的運(yùn)動(dòng)其實(shí)是這些

23、物質(zhì)在溶液中做“布朗運(yùn)動(dòng)”。隨著細(xì)胞消耗培養(yǎng)基，這些物質(zhì)越來(lái)越多，最后細(xì)胞所用的營(yíng)養(yǎng)消耗完，細(xì)胞容易死亡。 3、對(duì)于“黑膠蟲(chóng)”的處理方法： 首先，血清買(mǎi)回來(lái)滅活前凍融應(yīng)逐級(jí)凍融，即按照-204完全融化后，再置入水浴中，與室溫一起升高到56度，這樣的目的是避免溫度驟變，導(dǎo)致血清中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)喪失活性。 第二，血清滅活后分裝保存。按照每次用血清的量分裝，盡量減少血清凍融的次數(shù)。分裝時(shí)注意無(wú)菌。 第三，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)血清濃度稍大一些。通常細(xì)胞培養(yǎng)血清濃度為10%-15%，但如果血清凍融次數(shù)過(guò)多，那營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)喪失活性，按15%的濃度配制事實(shí)上達(dá)不到15%的營(yíng)養(yǎng)成分，故培養(yǎng)基配置時(shí)一般用18%-20%的血清。

24、這種黑膠蟲(chóng)，在國(guó)外稱(chēng)其為- 納米細(xì)菌，現(xiàn)將我看到的一些資料轉(zhuǎn)述如下，希望對(duì)大家有所幫助： 1.納米細(xì)菌的發(fā)現(xiàn) 芬蘭的一個(gè)科學(xué)家Ciftcioglu et al 在其細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中, 發(fā)現(xiàn)在胎牛血清中存在一種直徑50-500 nm的微粒; 這種顆粒物對(duì)伽瑪射線具有很強(qiáng)的耐受性; 針對(duì)包括支原體在內(nèi)的所有已知微生物的特異性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)均為陰性; 這種顆粒物在血瓊脂培養(yǎng)基以及支原體培養(yǎng)基中無(wú)法生長(zhǎng), 通常的細(xì)菌染色方法難以著色. 因此, Kajander判定這是一種新的微生物, 根據(jù)其體型微小并且棲息在血液中的特點(diǎn), 將其命名為Nanobacterium sanguineum, 簡(jiǎn)稱(chēng)Nanobacter

25、ia, 中文譯名納米細(xì)菌, 并將菌種保存于德國(guó)微生物存儲(chǔ)中心 (DSM No: 5819-5821, the GermanCollection of Micro-organisms, Braunschweig, Germany). 2 納米細(xì)菌的生物學(xué)特性 2.1 納米細(xì)菌哺乳動(dòng)物體內(nèi)最小的細(xì)菌 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)所使用的血清通常采用過(guò)濾法達(dá)到無(wú)菌的目的, 通常采用直徑0.1 m的濾膜過(guò)濾除菌. Kajander研究發(fā)現(xiàn), 0.1 m 的濾膜過(guò)濾并不能有效地清除血清中的納米細(xì)菌, 但是血清經(jīng)過(guò)0.05 m的濾膜過(guò)濾則能有效清除納米細(xì)菌污染. 細(xì)胞培養(yǎng)條件下的納米細(xì)菌經(jīng)過(guò)0.2 m的濾膜過(guò)濾后約有3%的

26、納米細(xì)菌可以通過(guò)濾膜, 而在加壓過(guò)濾的情況下, 約有50%的納米細(xì)菌可以通過(guò)0.2 m的濾膜. 剛剛經(jīng)過(guò)過(guò)濾的納米細(xì)菌在相差顯微鏡下無(wú)法發(fā)現(xiàn), 但在不含血清添加劑的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后, 即可以用相差顯微鏡觀測(cè)到. 電子顯微鏡觀察顯示, 納米細(xì)菌的平均直徑為200 nm, 而子代納米細(xì)菌的最小直徑僅50 nm. 傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為, 只有當(dāng)細(xì)胞直徑在不低于140 nm時(shí), 才能維持其最基本的新陳代謝. Kajander認(rèn)為, 納米細(xì)菌可能是地球形成早期、在原始大氣條件下的一種最原始的生命形式, 因此不能用衡量已經(jīng)經(jīng)過(guò)幾十億年進(jìn)化的生命形式的觀點(diǎn)去衡量這種古老的生命形式, 并且推測(cè), 納米細(xì)菌

27、遭受不良因素的侵害后可以形成許多的體形微小的碎片, 并將其釋放到環(huán)境中, 每一個(gè)碎片都可能攜帶部分遺傳信息, 在特定條件下, 這些"基本"顆粒聚集在一起形成群落, 當(dāng)足夠數(shù)量的"基本"顆粒提供完整的遺傳信息時(shí), 則可以形成新的納米細(xì)菌. 2.2 納米細(xì)菌緩慢的增殖周期 微生物學(xué)家通常是通過(guò)對(duì)某種微生物進(jìn)行培養(yǎng), 進(jìn)而了解該種微生物的特性. 然而, 并非每種微生物都是可以在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行培養(yǎng)的,主要原因在于這些微生物的培養(yǎng)條件我們并不清楚, 其生存環(huán)境以及是否與其他微生物存在共生關(guān)系我們并不十分了解. 納米細(xì)菌就是一種對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求非常苛刻的微生物, 其新陳

28、代謝率極為緩慢, 僅為普通細(xì)菌的1/10 000. 研究發(fā)現(xiàn), 納米細(xì)菌主要利用環(huán)境中的氨基酸而不是葡萄糖來(lái)提供能量, 谷氨酰胺、天冬酰胺以及精氨酸均可被其利用. 在37 有50-10 mL/L的二氧化碳及900-950 mL/L的空氣存在的潮濕環(huán)境下, 并且在含有100 mL/L胎牛血清和適量谷氨酰胺的pH值7.4的細(xì)胞培養(yǎng)基中, 納米細(xì)菌能夠緩慢生長(zhǎng), 平均倍增時(shí)間為3 d,而在無(wú)血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中, 其增殖速度變慢, 細(xì)菌倍增時(shí)間可延長(zhǎng)至5-6 d, 在添加適量促納米細(xì)菌生長(zhǎng)因子BGF(一種桿菌培養(yǎng)上清的超濾液)或N3(納米細(xì)菌培養(yǎng)上清的超濾液)的條件下, 其增殖速度加快, 倍增時(shí)間可縮

29、短至0.6-1 d. 在有促納米細(xì)菌生長(zhǎng)因子BGF存在的條件下, 納米細(xì)菌甚至可以在固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng), 并形成直徑l mm大小的細(xì)菌集落. 2.3 納米細(xì)菌獨(dú)特的生物礦化現(xiàn)象 當(dāng)在含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的納米細(xì)菌被轉(zhuǎn)移至不含血清的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)時(shí) (DMEM或RPMI-1640), 在1 a之內(nèi)就可以觀察到納米細(xì)菌出現(xiàn)貼壁現(xiàn)象, 在1 wk之內(nèi), 就可以在納米細(xì)菌的周?chē)纬蓭孜⒚缀竦纳锉荒?(biofilm), 并且緊緊貼附于培養(yǎng)瓶底部, 而納米細(xì)菌棲息其中(這與在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的納米細(xì)菌的形態(tài)明顯不同), 此時(shí)其大小接近于一個(gè)酵母細(xì)胞, 2-3 wk以后, 由于生物被膜的增厚, 其直徑

30、已近似于一個(gè)紅細(xì)胞的大小. 用EDX法對(duì)這種生物被膜的化學(xué)組成進(jìn)行分析, 顯示其鈣磷的峰值與羥基磷灰石極其相似, 電子顯微鏡觀察以及傅立葉轉(zhuǎn)換紅外頻譜(fourier transform IR spectroscopy, FTIR)分析顯示其主要成分為碳酸羥基磷灰石(carbonate hydroxyapatite), 而且,不論在有無(wú)血清作為添加劑的情況下, 都可以見(jiàn)到這種被羥基磷灰石包繞的納米細(xì)菌, 這種情況甚至可以在處于分裂期的納米細(xì)菌中見(jiàn)到. 納米細(xì)菌并不產(chǎn)生尿激酶和堿性磷酸酶, 并且即便經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)數(shù)周的培養(yǎng), 其培養(yǎng)基的pH值也不會(huì)出現(xiàn)明顯的變化, 一直穩(wěn)定在7.4左右, 這表明在納米

31、細(xì)菌細(xì)胞膜表面所生成的羥基磷灰石結(jié)晶是源自于生物大分子的, 即生物礦化現(xiàn)象, 而并非是由于pH值改變所導(dǎo)致的簡(jiǎn)單的物理結(jié)晶現(xiàn)象.納米細(xì)菌利用培養(yǎng)體系中的鈣、磷合成羥基磷灰石作為其生物被膜的主要成分, 這種生物礦化過(guò)程受到生長(zhǎng)環(huán)境中某些因素的調(diào)控, 從而使其呈現(xiàn)不同的外觀, 如羥基磷灰石形、細(xì)菌被膜形、沙粒形、結(jié)石形和類(lèi)似腫瘤的外形. （這也許就是國(guó)內(nèi)的一些研究者們認(rèn)為其是一些磷酸鹽類(lèi)的無(wú)機(jī)物的部分原因吧?。Ｔ诤行迈r血清的培養(yǎng)基中納米細(xì)菌的生物礦化現(xiàn)象程度較輕微, 這是由于血清中含有強(qiáng)效羥基磷灰石合成抑制因子, 骨鈣素 (osteocalcin) 和胎球蛋白(fetuin), 由于這些抑制蛋

32、白的存在, 所以在有血清存在的情況下, 納米細(xì)菌的生物礦化作用受到明顯抑制. 當(dāng)血清濃度降低時(shí), 納米細(xì)菌的生物礦化現(xiàn)象增強(qiáng), 在不含血清的培養(yǎng)體系中, 生物礦化現(xiàn)象劇烈而迅速. 盡管改良的Loeffler固體培養(yǎng)基中含有750 mL/L血清成分, 但血清蛋白成分在滅菌過(guò)程中受到破壞, 所以在此培養(yǎng)基中的納米細(xì)菌的礦化作用并不受抑制, 在此培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的納米細(xì)菌其菌落直徑可達(dá)1-5 mm. 另外, 當(dāng)有乙二胺四乙酸(EDTA)存在時(shí), 納米細(xì)菌的生物現(xiàn)象會(huì)受到明顯的抑制.由于礦化生物被膜的保護(hù)作用以及極其緩慢的新陳代謝率, 使納米細(xì)菌能夠耐受各種不利的物理?xiàng)l件和化學(xué)損傷因素以及多種抗生素的打擊

33、. 2.4納米細(xì)菌的檢測(cè)方法 由于納米細(xì)菌在標(biāo)準(zhǔn)微生物培養(yǎng)基中無(wú)法生長(zhǎng), 并且即便是在最適宜其生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中, 納米細(xì)菌的生長(zhǎng)也極為緩慢, 其新陳代謝率僅為普通細(xì)菌的萬(wàn)分之一, 這使得許多基于檢測(cè)細(xì)菌新陳代謝的微生物學(xué)方法無(wú)法檢測(cè)納米細(xì)菌的存在. 由于納米細(xì)菌難以用傳統(tǒng)的火焰法和乙醇法固定, 并且大多數(shù)染料無(wú)法穿透其細(xì)胞壁, 而且不能用普通顯微鏡對(duì)其進(jìn)行觀察, 因此常規(guī)的細(xì)菌學(xué)染色法并不能檢測(cè)到納米細(xì)菌的存在. 通過(guò)Kajander et al 的研究, 發(fā)現(xiàn)70干烤10 min, 可以將其有效固定; 另外, 用茜素紅S、剛果紅以及硝酸銀染料可以使納米細(xì)菌著色; 而培養(yǎng)狀態(tài)下的納米細(xì)菌可以在放大400倍的相差顯微鏡下清晰地觀察其生長(zhǎng)情況; 用DNA熒光染料 (Dapi或Hoechst) 按普通細(xì)菌DNA染色的條件對(duì)納米細(xì)菌DNA進(jìn)行染色均不成功, 而當(dāng)按照線粒體DNA以及病毒DNA染色條件, 對(duì)納米細(xì)菌DNA進(jìn)行染色時(shí), 熒光顯微鏡下可以觀察到特征性的熒光; 用納米細(xì)菌特異性抗體進(jìn)行熒光染色也可以清晰地顯示納米細(xì)菌的存在; 利用電子顯微鏡對(duì)經(jīng)過(guò)負(fù)染的納米細(xì)菌進(jìn)行觀察, 可以清晰的顯示80-350 nm大小、單獨(dú)或聚集成簇的納米細(xì)菌以及其表面的生物被膜(biofilm)結(jié)構(gòu); 而用透射電鏡對(duì)納米細(xì)菌的超薄切片進(jìn)行觀察, 可以清晰的顯示其內(nèi)部結(jié)構(gòu)。 可以發(fā)