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1、1常用生物化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)常用生物化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)2第一節(jié)第一節(jié) 光譜分析技術(shù)光譜分析技術(shù)第二節(jié)第二節(jié) 電化學(xué)分析電化學(xué)分析第三節(jié)第三節(jié) 電泳技術(shù)電泳技術(shù)第四節(jié)第四節(jié) 層析技術(shù)層析技術(shù)第五節(jié)第五節(jié) 離心技術(shù)離心技術(shù)第六節(jié)第六節(jié) 自動(dòng)生化分析技術(shù)自動(dòng)生化分析技術(shù) 只講第一節(jié),其它內(nèi)容在只講第一節(jié),其它內(nèi)容在臨床檢驗(yàn)臨床檢驗(yàn)儀器學(xué)儀器學(xué)中講授。中講授。n本章內(nèi)容概要本章內(nèi)容概要3n教學(xué)目標(biāo)和要求教學(xué)目標(biāo)和要求1 1、掌握掌握分光光度技術(shù)的基本原理及定性和定量方法。分光光度技術(shù)的基本原理及定性和定量方法。2 2、熟悉熟悉分光光度計(jì)的的基本結(jié)構(gòu)和操作方法光源檢查分光光度計(jì)的的基本結(jié)構(gòu)和操作方法光源檢查和波長(zhǎng)校

2、正、原子分光光度計(jì)的類(lèi)型和影響熒光分析的和波長(zhǎng)校正、原子分光光度計(jì)的類(lèi)型和影響熒光分析的因素因素3 3、了解了解其他光譜分析技術(shù)的基本原理及在生化檢驗(yàn)中其他光譜分析技術(shù)的基本原理及在生化檢驗(yàn)中的應(yīng)用。的應(yīng)用。4第一節(jié)第一節(jié) 光譜分析技術(shù)光譜分析技術(shù)n分光光度技術(shù)的基本原理分光光度技術(shù)的基本原理n分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)n分光光度計(jì)的操作方法分光光度計(jì)的操作方法 n分光光度技術(shù)的定性和定量方法分光光度技術(shù)的定性和定量方法 5n光譜分析技術(shù)原理:光譜分析技術(shù)原理: 利用各種化學(xué)物質(zhì)都具有發(fā)射、吸收或散射光譜譜系的特利用各種化學(xué)物質(zhì)都具有發(fā)射、吸收或散射光譜譜系的特征,以此來(lái)確定物質(zhì)

3、性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或含量。征,以此來(lái)確定物質(zhì)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或含量。n光譜分析技術(shù)分類(lèi):光譜分析技術(shù)分類(lèi):發(fā)射光譜分析技術(shù):發(fā)射光譜分析技術(shù):火焰光度法、原子發(fā)射光譜法和熒光光譜法火焰光度法、原子發(fā)射光譜法和熒光光譜法 吸收光譜分析技術(shù):吸收光譜分析技術(shù):紫外、可見(jiàn)光分光光度法,原子吸收分光光紫外、可見(jiàn)光分光光度法,原子吸收分光光 度法和紅外光譜法度法和紅外光譜法 散射光譜分析技術(shù):散射光譜分析技術(shù):比濁法比濁法 6一、分光光度技術(shù)的基本原理一、分光光度技術(shù)的基本原理(一)吸光度與透光度(一)吸光度與透光度 a = -lgt = -lgi/ia = -lgt = -lgi/i0 0 = lgi= lgi0

4、0/i/i 當(dāng)光線(xiàn)通過(guò)均勻、透明的溶液時(shí)可出現(xiàn)三種情況:一部分當(dāng)光線(xiàn)通過(guò)均勻、透明的溶液時(shí)可出現(xiàn)三種情況:一部分光被散射,一部份光被吸收,另有一部分光透過(guò)溶液。設(shè)入射光被散射,一部份光被吸收,另有一部分光透過(guò)溶液。設(shè)入射光強(qiáng)度為光強(qiáng)度為i0i0,透射光強(qiáng)度為,透射光強(qiáng)度為i i,i i和和i i0 0之比稱(chēng)為透光度之比稱(chēng)為透光度,即:即:t = i/it = i/i0 0 t t100100為為t%t%稱(chēng)為百分透光度。透光度的負(fù)對(duì)數(shù)稱(chēng)為吸光度稱(chēng)為百分透光度。透光度的負(fù)對(duì)數(shù)稱(chēng)為吸光度即:即:7(二)(二)lambert-beerlambert-beer定律定律 lambert-beer lamb

5、ert-beer定律是討論溶液吸光度同溶液濃度和溶液層定律是討論溶液吸光度同溶液濃度和溶液層厚度之間關(guān)系的基本定律,該定律是分光分析的理論基礎(chǔ)。其厚度之間關(guān)系的基本定律,該定律是分光分析的理論基礎(chǔ)。其表達(dá)式為:表達(dá)式為: a = klc 式中式中a a為吸光度;為吸光度;k k為比例常數(shù),稱(chēng)為吸光系數(shù);為比例常數(shù),稱(chēng)為吸光系數(shù);l l為溶液為溶液層厚度,稱(chēng)為光徑;層厚度,稱(chēng)為光徑;c c為溶液濃度為溶液濃度 (lambert-beerlambert-beer定律適用于可見(jiàn)光、紫外光、紅外光和均勻非散射的液體。)定律適用于可見(jiàn)光、紫外光、紅外光和均勻非散射的液體。)8 據(jù)據(jù)lambert-bee

6、rlambert-beer定律,當(dāng)液層厚度為定律,當(dāng)液層厚度為cmcm,濃度單位為,濃度單位為mol/lmol/l時(shí),吸光系數(shù)時(shí),吸光系數(shù)k k稱(chēng)為稱(chēng)為摩爾吸光系數(shù)摩爾吸光系數(shù)()()。的意義是:當(dāng)液層的意義是:當(dāng)液層厚度為厚度為1cm1cm,物質(zhì)濃度為,物質(zhì)濃度為1mol/l1mol/l時(shí)在特定波時(shí)在特定波長(zhǎng)下的吸光度值。長(zhǎng)下的吸光度值。是物質(zhì)的特征性常數(shù)。是物質(zhì)的特征性常數(shù)。 9(三)偏離(三)偏離lambert-beerlambert-beer定律的因素定律的因素 應(yīng)用應(yīng)用lambert-beerlambert-beer定律產(chǎn)生誤差主要來(lái)源于光學(xué)定律產(chǎn)生誤差主要來(lái)源于光學(xué)和化學(xué)兩方面的因

7、素。和化學(xué)兩方面的因素。1 1光學(xué)因素:光學(xué)因素: 要求入射光是單色光。入射光的譜帶越寬,其誤差越大。要求入射光是單色光。入射光的譜帶越寬,其誤差越大。 2 2化學(xué)因素:化學(xué)因素: 濃度、濃度、phph、溶劑和溫度等因素可影響化學(xué)平衡。、溶劑和溫度等因素可影響化學(xué)平衡。 10二、分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)二、分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)最常用的是最常用的是可見(jiàn)分光光度計(jì)可見(jiàn)分光光度計(jì)和和紫外紫外- -可見(jiàn)光分光光度計(jì)可見(jiàn)光分光光度計(jì) 光源光源單色器單色器比色杯比色杯檢測(cè)器檢測(cè)器顯示器顯示器五大部份五大部份n結(jié)構(gòu):結(jié)構(gòu):11(一)光源(一)光源u光源定義:光源定義: 指一種可以發(fā)射出供溶液或吸收物質(zhì)選擇性吸收

8、的光。光指一種可以發(fā)射出供溶液或吸收物質(zhì)選擇性吸收的光。光源應(yīng)在一定光譜區(qū)域內(nèi)發(fā)射出連續(xù)光譜,并有足夠的強(qiáng)度和良源應(yīng)在一定光譜區(qū)域內(nèi)發(fā)射出連續(xù)光譜,并有足夠的強(qiáng)度和良好的穩(wěn)定性,在整個(gè)光譜區(qū)域內(nèi)光的強(qiáng)度不應(yīng)隨波長(zhǎng)有明顯的好的穩(wěn)定性,在整個(gè)光譜區(qū)域內(nèi)光的強(qiáng)度不應(yīng)隨波長(zhǎng)有明顯的變化。變化。 u光源種類(lèi):光源種類(lèi): 可見(jiàn)光分光光度計(jì)常用光源是可見(jiàn)光分光光度計(jì)常用光源是鎢燈或鹵鎢燈。鎢燈或鹵鎢燈。 紫外光光度計(jì)常用紫外光光度計(jì)常用氫燈氫燈作為光源。作為光源。 12(二)單色器(二)單色器u定義:定義: 將來(lái)自光源的復(fù)合光分散為單色光的裝置稱(chēng)為分將來(lái)自光源的復(fù)合光分散為單色光的裝置稱(chēng)為分光系統(tǒng)或單色器。

9、光系統(tǒng)或單色器。 u種類(lèi):種類(lèi): 濾光片濾光片棱鏡棱鏡光柵光柵13(三)比色杯(三)比色杯又稱(chēng)為吸收池或比色皿又稱(chēng)為吸收池或比色皿 u材料:材料:常用無(wú)色透明、耐腐蝕和耐酸堿的玻璃或石英材料做成常用無(wú)色透明、耐腐蝕和耐酸堿的玻璃或石英材料做成 (五)顯示器(五)顯示器(四)檢測(cè)器(四)檢測(cè)器 檢測(cè)器是將透過(guò)溶液的光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào),并將電信號(hào)檢測(cè)器是將透過(guò)溶液的光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào),并將電信號(hào)放大的裝置。常用的檢測(cè)器為光電管和光電倍增管。放大的裝置。常用的檢測(cè)器為光電管和光電倍增管。 是將光電管或光電倍增管放大的電流通過(guò)儀表顯示出來(lái)的是將光電管或光電倍增管放大的電流通過(guò)儀表顯示出來(lái)的裝置。裝置。

10、 14三、分光光度計(jì)的操作方法三、分光光度計(jì)的操作方法(一)分光光度計(jì)的基本操作(一)分光光度計(jì)的基本操作以以721-a721-a型分光光度計(jì)為例,其基本的操作步驟為:型分光光度計(jì)為例,其基本的操作步驟為:1.1.開(kāi)開(kāi)721-a721-a分光光度計(jì)的開(kāi)關(guān),將比色池的蓋子打開(kāi),通電分光光度計(jì)的開(kāi)關(guān),將比色池的蓋子打開(kāi),通電2020分鐘使儀器預(yù)熱。分鐘使儀器預(yù)熱。2.2.將波長(zhǎng)旋至測(cè)定的波長(zhǎng)。將波長(zhǎng)旋至測(cè)定的波長(zhǎng)。3.3.將空白液、校準(zhǔn)液或待測(cè)液放入比色池,將空白液置于光路中。將空白液、校準(zhǔn)液或待測(cè)液放入比色池,將空白液置于光路中。4.4.將開(kāi)關(guān)置于將開(kāi)關(guān)置于t t位,打開(kāi)比色池蓋子,用光量粗調(diào)和

11、光量細(xì)調(diào)調(diào)節(jié)位,打開(kāi)比色池蓋子,用光量粗調(diào)和光量細(xì)調(diào)調(diào)節(jié)t t為為0.0,0.0,關(guān)上關(guān)上比色池蓋子,調(diào)節(jié)比色池蓋子,調(diào)節(jié)t t為為100.0100.0。5.5.將開(kāi)關(guān)置于將開(kāi)關(guān)置于a a,用消光調(diào)零調(diào)節(jié),用消光調(diào)零調(diào)節(jié)a a為為0.00.06.6.重復(fù)步驟重復(fù)步驟4 4和和5 57.7.將校準(zhǔn)液或待測(cè)液推入光路,測(cè)量溶液的吸光度(將校準(zhǔn)液或待測(cè)液推入光路,測(cè)量溶液的吸光度(a a)15(二)吸光度的校正(二)吸光度的校正 鉻酸鉀的標(biāo)準(zhǔn)液可用于校正分光光度計(jì)的吸鉻酸鉀的標(biāo)準(zhǔn)液可用于校正分光光度計(jì)的吸光度。在光度。在25,將,將4mg鉻酸鉀溶于鉻酸鉀溶于100ml的的0.05mol/l koh中

12、,放入比色池中,在不同波長(zhǎng)中,放入比色池中,在不同波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值,與己知的標(biāo)準(zhǔn)吸光度校正表進(jìn)下測(cè)定吸光度值,與己知的標(biāo)準(zhǔn)吸光度校正表進(jìn)行比較,可檢測(cè)儀器吸光度的準(zhǔn)確度行比較,可檢測(cè)儀器吸光度的準(zhǔn)確度。 16四、分光光度技術(shù)的定性和定量方法四、分光光度技術(shù)的定性和定量方法(一)分光光度技術(shù)的定性方法(一)分光光度技術(shù)的定性方法u定性依據(jù):定性依據(jù):最大吸收波長(zhǎng)最大吸收波長(zhǎng)maxmax和摩爾吸光系數(shù)和摩爾吸光系數(shù) 2.2.摩爾消光系數(shù)摩爾消光系數(shù)方法方法1.1.最大吸收波長(zhǎng)最大吸收波長(zhǎng)maxmax方法方法17(二)分光光度技術(shù)的定量方法(二)分光光度技術(shù)的定量方法1.1.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法

13、根據(jù)根據(jù)lambert-beerlambert-beer定律,液體的濃度在一定范定律,液體的濃度在一定范圍內(nèi)與吸光度成正比關(guān)系。配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)圍內(nèi)與吸光度成正比關(guān)系。配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液(濃度應(yīng)包含高、中、低濃度范圍),按標(biāo)品溶液(濃度應(yīng)包含高、中、低濃度范圍),按標(biāo)本處理方法作相同處理,在特定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,本處理方法作相同處理,在特定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫座標(biāo),以吸光度為縱座標(biāo)以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫座標(biāo),以吸光度為縱座標(biāo),按最,按最小二乘法的原理,將對(duì)應(yīng)各點(diǎn)連成一條通過(guò)原點(diǎn)的小二乘法的原理,將對(duì)應(yīng)各點(diǎn)連成一條通過(guò)原點(diǎn)的直線(xiàn),這條直線(xiàn)稱(chēng)為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。待測(cè)溶液測(cè)定吸光直線(xiàn),這

14、條直線(xiàn)稱(chēng)為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。待測(cè)溶液測(cè)定吸光度后,從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上可查出其相應(yīng)的濃度。度后,從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上可查出其相應(yīng)的濃度。u方法:方法:18u制作和應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)時(shí)應(yīng)注意下面幾點(diǎn):制作和應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)時(shí)應(yīng)注意下面幾點(diǎn):(1 1)測(cè)定條件發(fā)生變化時(shí)(如更換標(biāo)準(zhǔn)品和試劑等),應(yīng)重新)測(cè)定條件發(fā)生變化時(shí)(如更換標(biāo)準(zhǔn)品和試劑等),應(yīng)重新繪制。繪制。(2 2)標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)有高的純度,標(biāo)準(zhǔn)液的配制應(yīng)準(zhǔn)確。)標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)有高的純度,標(biāo)準(zhǔn)液的配制應(yīng)準(zhǔn)確。(3 3)當(dāng)待測(cè)液吸光度超過(guò)線(xiàn)性范圍時(shí),應(yīng)將標(biāo)本稀釋后再測(cè)定。)當(dāng)待測(cè)液吸光度超過(guò)線(xiàn)性范圍時(shí),應(yīng)將標(biāo)本稀釋后再測(cè)定。(4 4)標(biāo)本測(cè)定的條件應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作時(shí)的條件完全一致。)標(biāo)本

15、測(cè)定的條件應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作時(shí)的條件完全一致。192 2比較法比較法 c cu u=(a=(au uc cs s)/a)/as s 己知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本作同樣處理,使用相同的空白,己知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本作同樣處理,使用相同的空白,同時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)本的吸光度,根據(jù)測(cè)定的吸光度及標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)本的吸光度,根據(jù)測(cè)定的吸光度及標(biāo)準(zhǔn)品濃度,可直接計(jì)算出標(biāo)本的濃度,計(jì)算公式為:品濃度,可直接計(jì)算出標(biāo)本的濃度,計(jì)算公式為: 其中其中cucu和和auau為標(biāo)本管濃度和吸光度,為標(biāo)本管濃度和吸光度,cscs和和asas分別為標(biāo)準(zhǔn)分別為標(biāo)準(zhǔn)管濃度和吸光度。用標(biāo)準(zhǔn)品法定量時(shí),標(biāo)準(zhǔn)品的濃度應(yīng)盡量管濃度和吸光度。用標(biāo)準(zhǔn)品法定量時(shí),標(biāo)準(zhǔn)品的濃度應(yīng)盡量和標(biāo)本管濃度相近。和標(biāo)本管濃度相近。 203 3其它分析方法其它分析方法 包括差示法、多組份混合物分析和利用包括差示法、多組份混合物分析和利用摩爾吸光系數(shù)分析等方法。摩爾

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