蛋白質(zhì)的相互作用研究方法ppt課件

1、1 兩個(gè)或兩個(gè)以上的蛋白質(zhì)結(jié)合在一起執(zhí)行生物學(xué)功能時(shí)，發(fā)生相互作用。使蛋白質(zhì)到發(fā)揮作用的位點(diǎn)。使蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，激活或抑制。2 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用和識別在諸如生物催化、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、和識別在諸如生物催化、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、信號傳導(dǎo)、免疫、細(xì)胞調(diào)控等多種信號傳導(dǎo)、免疫、細(xì)胞調(diào)控等多種生命過程起著重要的作用。生命過程起著重要的作用。3第三節(jié) 蛋白質(zhì)的相互作用的研究方法免疫共沉淀免疫共沉淀Co-immunoprecipitation (Co-IP)Co-immunoprecipitation (Co-IP)GST pull-down assayGST pull-down assay熒

2、光共振能量轉(zhuǎn)移熒光共振能量轉(zhuǎn)移Fluorescent Resonant Energy Fluorescent Resonant Energy Transfer Transfer （FRETFRET）雙分子熒光互補(bǔ)（雙分子熒光互補(bǔ)（Bimolecular Fluorescent Bimolecular Fluorescent ComplementComplement）BIFCBIFC酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)Yeast Two-Hybrid SystermYeast Two-Hybrid Systerm其它方法其它方法41. . 原理原理 當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞當(dāng)細(xì)胞在非變性條

3、件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用被保留內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)了下來。如果用蛋白質(zhì)X X的抗體免疫沉淀的抗體免疫沉淀X X，那么與，那么與X X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y Y也能沉淀下來。這種方法常用也能沉淀下來。這種方法常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合，也可用于于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合，也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的結(jié)合蛋白。確定一種特定蛋白質(zhì)的新的結(jié)合蛋白。優(yōu)點(diǎn)：生理?xiàng)l件下的結(jié)合優(yōu)點(diǎn)：生理?xiàng)l件下的結(jié)合缺點(diǎn)：可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互缺點(diǎn)：可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相

4、互作用作用一、免疫共沉淀一、免疫共沉淀52.方法方法1) 收獲培養(yǎng)的細(xì)胞（收獲培養(yǎng)的細(xì)胞（11071108）冷）冷PBS洗滌洗滌2次次2）細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，冰?。┘?xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，冰浴30min3) 12000rpm 離心離心 30min4）收集上清并加入適量抗體，）收集上清并加入適量抗體，4C搖動搖動1h過夜過夜5）加入）加入ProteinA/G-Sepharose(瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠)懸液，懸液， 4C搖動搖動1h6）細(xì)胞裂解液洗滌）細(xì)胞裂解液洗滌ProteinA/G-Sepharose混合液混合液7）離心棄上清）離心棄上清8）沉淀加）沉淀加2蛋白蛋白Loading Buffer煮沸

5、煮沸510min9）離心，上清液跑）離心，上清液跑SDS-PAGE 膠膠10）考馬氏亮蘭染色、銀染）考馬氏亮蘭染色、銀染 Western Blot 質(zhì)譜分析質(zhì)譜分析63.注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)1）細(xì)胞裂解）細(xì)胞裂解 采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子在的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（變性劑（NP40或或Triton X-100)。每種細(xì)胞的裂。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗(yàn)確定。解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗(yàn)確定。 不能用高濃度的變性劑（不能用高濃度的變性劑（0.2SDS)，細(xì)胞裂，細(xì)胞裂解液中要加各種蛋白酶

6、酶抑制劑，如商品化的解液中要加各種蛋白酶酶抑制劑，如商品化的cocktailer。2）使用明確的抗體，有的抗體不適宜做免疫共）使用明確的抗體，有的抗體不適宜做免疫共沉淀。沉淀。3) 對照實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)。對照實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)。7二、GSTGST融合蛋白進(jìn)行PulldowPulldow實(shí)驗(yàn) 1 1 原理原理 細(xì)菌表達(dá)的谷胱甘肽細(xì)菌表達(dá)的谷胱甘肽s s轉(zhuǎn)移酶（轉(zhuǎn)移酶（GSTGST）融）融合蛋白主要用于蛋白的親和純化，也可以將合蛋白主要用于蛋白的親和純化，也可以將GSTGST融合融合蛋白作為探針，與溶液中的特異性搭檔蛋白結(jié)合，然蛋白作為探針，與溶液中的特異性搭檔蛋白結(jié)合，然后根據(jù)谷胱甘肽瓊脂糖球珠能夠沉淀后根據(jù)

7、谷胱甘肽瓊脂糖球珠能夠沉淀GSTGST融合蛋白的融合蛋白的能力來確定相互作用的蛋白。一般在得到目標(biāo)蛋白的能力來確定相互作用的蛋白。一般在得到目標(biāo)蛋白的抗體前，或發(fā)現(xiàn)抗體干擾蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)之間的相互抗體前，或發(fā)現(xiàn)抗體干擾蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)之間的相互作用時(shí)，可以啟用作用時(shí)，可以啟用GSTGST沉降技術(shù)。該方法只是用于確沉降技術(shù)。該方法只是用于確定體外的相互作用。定體外的相互作用。 兩種應(yīng)用：兩種應(yīng)用： 1 1）確定融合（或探針）蛋白與未知（或靶）蛋白）確定融合（或探針）蛋白與未知（或靶）蛋白間的新的相互作用間的新的相互作用 2 2）證實(shí)探針蛋白與已知蛋白質(zhì)間可疑的相互作用）證實(shí)探針蛋白與已知蛋白質(zhì)間可疑的

8、相互作用 82 2 方法：方法： 1 1） GSTGST融合蛋白先與下列蛋白溶液之一孵育（融合蛋白先與下列蛋白溶液之一孵育（a, a, 單一明單一明確的重組蛋白；確的重組蛋白；b b，細(xì)胞裂解蛋白混合液；，細(xì)胞裂解蛋白混合液；c, c, 體外翻譯體外翻譯cDNAcDNA表達(dá)得到的未知蛋白）表達(dá)得到的未知蛋白） 2 2）混合液與谷胱甘肽瓊脂糖球珠反應(yīng)）混合液與谷胱甘肽瓊脂糖球珠反應(yīng) 4C 2h4C 2h 3 3）離心棄上清）離心棄上清 4 4）沉淀加入）沉淀加入2 2 蛋白蛋白Loading BufferLoading Buffer煮沸，離心煮沸，離心 5 5）取上清進(jìn)行）取上清進(jìn)行SDS-PA

9、GESDS-PAGE電泳，電泳， 6 6）考馬氏亮蘭染色觀察特異沉降的蛋白帶，進(jìn)一步做質(zhì)）考馬氏亮蘭染色觀察特異沉降的蛋白帶，進(jìn)一步做質(zhì)譜分析確譜分析確 定沉降的蛋白；電泳后的膠也可以做定沉降的蛋白；電泳后的膠也可以做Western Western BlotBlot來確定沉降的蛋白中是否有目的蛋白來確定沉降的蛋白中是否有目的蛋白注意：該實(shí)驗(yàn)設(shè)立注意：該實(shí)驗(yàn)設(shè)立GSTGST對照，反應(yīng)均在對照，反應(yīng)均在4C4C進(jìn)行進(jìn)行9GST-Pulldown Assay10三、三、Fluorescence resonance energy transfer1.1.熒光信號的產(chǎn)生熒光信號的產(chǎn)生 熒光基團(tuán)在某波長的

10、激發(fā)光刺激下，產(chǎn)熒光基團(tuán)在某波長的激發(fā)光刺激下，產(chǎn)生一個(gè)更長波長的發(fā)射光。生一個(gè)更長波長的發(fā)射光。11什么是什么是FRET? FRET? 當(dāng)某個(gè)熒光基團(tuán)的發(fā)射譜與另一熒光基團(tuán)的當(dāng)某個(gè)熒光基團(tuán)的發(fā)射譜與另一熒光基團(tuán)的吸收光譜發(fā)生重疊，且兩個(gè)基團(tuán)距離足夠近時(shí)，吸收光譜發(fā)生重疊，且兩個(gè)基團(tuán)距離足夠近時(shí)，能量可以從短波長（高能量）的熒光基團(tuán)傳遞到能量可以從短波長（高能量）的熒光基團(tuán)傳遞到長波長（低能量）的熒光基團(tuán)，這個(gè)過程稱為熒長波長（低能量）的熒光基團(tuán)，這個(gè)過程稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET),(FRET),實(shí)際相當(dāng)于將短波長熒實(shí)際相當(dāng)于將短波長熒光基團(tuán)釋放的熒光屏蔽。光基團(tuán)釋放的熒光

11、屏蔽。123. 綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白 60年代，年代，Shimomura等首先從水母等首先從水母（Aequoria Victoria ）中分離出一種中分離出一種水母發(fā)光水母發(fā)光蛋白蛋白(aequoren)，該蛋白與鈣和腸腔素結(jié)合后，該蛋白與鈣和腸腔素結(jié)合后可產(chǎn)生藍(lán)色熒光。然而水母中提取的顆粒都呈可產(chǎn)生藍(lán)色熒光。然而水母中提取的顆粒都呈綠色，后經(jīng)證實(shí)在水母體內(nèi)還存在另外一種發(fā)綠色，后經(jīng)證實(shí)在水母體內(nèi)還存在另外一種發(fā)光蛋白即光蛋白即綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白 GFP, 后經(jīng)研究表明，后經(jīng)研究表明，在水母體內(nèi)在水母體內(nèi)Ca2+和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結(jié)合和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結(jié)合后，水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生

12、藍(lán)色熒光，后，水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生藍(lán)色熒光，GFP在藍(lán)光在藍(lán)光的激發(fā)下，產(chǎn)生綠色熒光的激發(fā)下，產(chǎn)生綠色熒光 。13Osamu Shimomura Osamu Shimomura in the lab in the basement of his home. He is holding a sample of “real” GFP isolated from Aequorea victorea, not produced by bacteria. In order to do his research Shimomura estimates that he collected over a mill

13、ion Aequorea specimens。 （One Aequorea weigh about 50g）14William Ward (right) met Douglas Prasher on a jellyfish-hunting expedition in the 1980s Douglas Prasher was the first person to realize the potential of GFP as a tracer molecule.GFP could be used to report when a protein was being made in a cel

14、l.GFP could potentially be a very useful reporter molecule. 容易檢測分子量小 不需要其它底物Douglas Prasher 1992 克隆了克隆了GFP基基因因1516Chalfie 將GFP基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌中。17Sergey A. Lukyanov 在珊瑚中發(fā)現(xiàn)了類似GFP的蛋白。他還發(fā)現(xiàn)了紅色熒光蛋白。18 Roger Tsien 對對GFP的機(jī)理作的機(jī)理作出了貢獻(xiàn)。制造出了貢獻(xiàn)。制造了很多了很多GFP突變突變體。體。19GFPsequence MSKGEELFTGVVPVLVELDGDVNGQKFSVSGEGEGDATYGKL

15、TLNFICTTGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFYKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKMEYNYNSHNVYIMGDKPKNGIKVNFKIRHNIKDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMILLEFVTAARITHGMDELYK20212008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)22GFP主要應(yīng)用主要應(yīng)用: 對活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定位及動態(tài)觀察對活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定位及動態(tài)觀察 可實(shí)時(shí)原位跟蹤特定蛋白在細(xì)胞生長、分裂、分化過可實(shí)時(shí)原位跟蹤特定蛋

16、白在細(xì)胞生長、分裂、分化過程中或外界刺激因子的作用下的時(shí)空表達(dá)程中或外界刺激因子的作用下的時(shí)空表達(dá), 如某種轉(zhuǎn)錄因子如某種轉(zhuǎn)錄因子的核轉(zhuǎn)位、蛋白激酶的核轉(zhuǎn)位、蛋白激酶C的膜轉(zhuǎn)位等。的膜轉(zhuǎn)位等。 GFP基因與分泌蛋白基因連接后轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因與分泌蛋白基因連接后轉(zhuǎn)染細(xì)胞, 可動態(tài)觀察可動態(tài)觀察 該分泌蛋白分泌到細(xì)胞外的過程該分泌蛋白分泌到細(xì)胞外的過程 GFP基因與定位于某一細(xì)胞器特殊蛋白基因相連基因與定位于某一細(xì)胞器特殊蛋白基因相連,就能就能顯示活細(xì)胞中細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體等細(xì)胞顯示活細(xì)胞中細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體等細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)及病理過程。器的結(jié)構(gòu)及病理過程。 膜蛋白的移動膜蛋白

17、的移動 （Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP ） 蛋白之間的相互作用（蛋白之間的相互作用（FRET） 報(bào)告分子報(bào)告分子 將將GFP的基因連在特殊的啟動子的后面，可以檢的基因連在特殊的啟動子的后面，可以檢測基因表達(dá)的時(shí)間和部位。測基因表達(dá)的時(shí)間和部位。23 人們在人們在GFP基因的基礎(chǔ)上已經(jīng)制造出基因的基礎(chǔ)上已經(jīng)制造出藍(lán)色熒光蛋白，黃色熒光蛋白，青色熒光藍(lán)色熒光蛋白，黃色熒光蛋白，青色熒光蛋白，又發(fā)現(xiàn)了紅色熒光蛋白蛋白，又發(fā)現(xiàn)了紅色熒光蛋白。其中蘭色熒光蛋白和綠色熒光蛋白其中蘭色熒光蛋白和綠色熒光蛋白青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白之間可以發(fā)

18、青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白之間可以發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移生熒光共振能量轉(zhuǎn)移24Look at physical interactions between proteins25四、Bimolecular Fluorescent Complementation2627五、五、Yeast TwoHybrid Systerm281.原理原理 酵母雙雜交系統(tǒng)由酵母雙雜交系統(tǒng)由Fields和和Song等首先在研究真等首先在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中建立。核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中建立。 典型的真核生長轉(zhuǎn)錄因子，典型的真核生長轉(zhuǎn)錄因子， 如如GAL4、GCN4、等都含有二個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域等都含有二個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域: DNA結(jié)合

19、結(jié)構(gòu)域結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-binding domain)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcription-activating domain)。前者可識別。前者可識別DNA上的特異序上的特異序列，并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)的基因的上列，并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)的基因的上游，轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可同轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其他成分作游，轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可同轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其他成分作用，啟動它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。用，啟動它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。 29 根據(jù)這一特點(diǎn)，如果使可能存在相互作用的根據(jù)這一特點(diǎn)，如果使可能存在相互作用的兩種蛋白兩種蛋白X和和Y分別以和分別以和BD/AD形成雜合蛋白的形成雜合蛋白

20、的形式的酵母中表達(dá)分布于細(xì)胞核中，形式的酵母中表達(dá)分布于細(xì)胞核中，X與與Y之間的之間的相互作用就可以將相互作用就可以將BD和和AD在空間結(jié)構(gòu)上重新聯(lián)在空間結(jié)構(gòu)上重新聯(lián)結(jié)為一個(gè)整體而與報(bào)告基因的上游激活序列結(jié)為一個(gè)整體而與報(bào)告基因的上游激活序列（upstream activation sequence）結(jié)合，進(jìn)而）結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮激活轉(zhuǎn)錄的功能，使受調(diào)控的報(bào)告基因得到發(fā)揮激活轉(zhuǎn)錄的功能，使受調(diào)控的報(bào)告基因得到表達(dá)。根據(jù)這一原理，雙雜交系統(tǒng)通過簡便的酵表達(dá)。根據(jù)這一原理，雙雜交系統(tǒng)通過簡便的酵母遺傳分析對報(bào)告基因表型進(jìn)行檢測即可實(shí)現(xiàn)對母遺傳分析對報(bào)告基因表型進(jìn)行檢測即可實(shí)現(xiàn)對于蛋白質(zhì)間相互作用的研究

21、。于蛋白質(zhì)間相互作用的研究。 3031 酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報(bào)告酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報(bào)告基因的表達(dá)探測蛋白蛋白的相互作用。主要有基因的表達(dá)探測蛋白蛋白的相互作用。主要有二類載體二類載體: a 含含DNA -binding domain的載體的載體; b 含含Transcription-activating domain的載體。另的載體。另外還需要特殊的酵母菌株如外還需要特殊的酵母菌株如GAL4缺陷型。缺陷型。1 1）兩種蛋白之間是否有相互作用）兩種蛋白之間是否有相互作用2 2）尋找一種蛋白可能的相互作用蛋白）尋找一種蛋白可能的相互作用蛋白2. 應(yīng)用應(yīng)用 32（1）它

22、并非對所有蛋白質(zhì)適用。）它并非對所有蛋白質(zhì)適用。 融合蛋白的相互作用激活報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄是在細(xì)胞融合蛋白的相互作用激活報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄是在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生的，而表達(dá)的融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)能否正確折核內(nèi)發(fā)生的，而表達(dá)的融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)能否正確折疊并運(yùn)至核內(nèi)是檢測的前提條件。雖然目前已經(jīng)在表疊并運(yùn)至核內(nèi)是檢測的前提條件。雖然目前已經(jīng)在表達(dá)質(zhì)粒中插入了核定位序列，但仍不能排除不少必須達(dá)質(zhì)粒中插入了核定位序列，但仍不能排除不少必須經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器進(jìn)行翻譯后加工修飾的蛋白質(zhì)尤經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器進(jìn)行翻譯后加工修飾的蛋白質(zhì)尤其是胞外蛋白不能進(jìn)入核內(nèi)，或因產(chǎn)生錯(cuò)誤的構(gòu)象而其是胞外蛋白不能進(jìn)入核內(nèi)，或因產(chǎn)生錯(cuò)誤的構(gòu)象而影響篩查結(jié)果影響篩查結(jié)果.3. 雙雜交系統(tǒng)的缺陷雙雜交系統(tǒng)的缺陷 33 （2）假陽性的發(fā)生較為繁多。）假陽性的發(fā)生較為繁多。 在篩庫過程中遇到的假陽性可被簡單分成三型：在篩庫