發(fā)光分析1和2

1、郭良洽郭良洽食品安全分析與檢測技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室食品安全分析與檢測技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室( (福州大學(xué)福州大學(xué)) )福州大學(xué)碩士研究生課程發(fā)光分析發(fā)光分析教學(xué)參考書：教學(xué)參考書：n熒光分析法（第二版或第三版）；陳國珍主編；科學(xué)出版社；1990n化學(xué)發(fā)光與生物發(fā)光理論與應(yīng)用；陳國南，張帆著；福建科學(xué)技術(shù)出版社；1997n化學(xué)發(fā)光基礎(chǔ)理論與應(yīng)用；林金明編著；化學(xué)工業(yè)出版社；2004nElectrogenerated Chemiluminescence；Allen J Bard；Marcel Dekker，Inc；2004nACS(/)，Elsevier(http

2、:/ 引言引言Luminescence is the emission of light by a substance. It occurs when an electron returns to the electronic ground state from an excited state and loses its excess energy as a photon. 1cm excitation mode luminescence type thermally activated ion recombination thermoluminescence high energy par

3、ticles or radiation radioluminescence friction triboluminescence sound waves sonoluminescence absorption of radiation (UV/VIS) photoluminescence chemical reaction chemiluminescence, bioluminescenceinjection of charge electroluminescence 2.2.發(fā)光類型發(fā)光類型Thermoluminescence熱致發(fā)光熱致發(fā)光nThermoluminescence is a

4、form of luminescence when absorbed light is re-emitted on heating.nSome mineral substances such as fluorite store energy when exposed to ultraviolet or other ionising radiation. This energy is released in the form of light when the mineral is heated; the phenomenon is distinct from that of black bod

5、y radiation.Radioluminescence放射發(fā)光放射發(fā)光n是指因受高能粒子或輻照的激發(fā)而發(fā)光的現(xiàn)象。一些老式的鐘表晚上可以發(fā)光可見表針，就是在其表面涂了一層放射發(fā)光的材料。radioluminescence：Luminescence arising from excitation by high-energy particles or radiationTriboluminescence摩擦發(fā)光摩擦發(fā)光triboluminescence：Luminescence resulting from the rubbing together of the surface of cer

6、tain solids. It can be produced, for example, when solids are crushed. Sonoluminescence聲致發(fā)光sonoluminescence：the weak emission of light flashes by bubbles in a liquid excited by sound (a pressure wave). Sonoluminescence arises from cavitation, i.e. the formation, growth and collapse of microbubbles,

7、which produces excited state species.nFigure 1. Possible luminescent fates for an atom or molecule after electronic excitation.emission of lightIncandescencephosphorescencebioluminescencechemiluminescenceluminescencefluorescenceimmediately?YesYesYesYesYesNoNoNoNoNoTriboluminescencewith heating?from

8、mechanical forces?inanimate?with excitation by light?n本課程主要涉及:nPhotoluminescence（Fluorescence & Phosphorescence）n光致發(fā)光（熒光和磷光）nChemiluminescence & Biochemiluminescencen化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光nElectrogenerated chemiluminescence (electroluminescence)n電致化學(xué)發(fā)光第二章第二章 熒光熒光n2.1 熒光發(fā)展歷程Each electron has unique set of

9、 quantum numbers (Pauli Exclusion Principle)nn principal (1s, 3p. ) 主量子數(shù)nl angular momentum (l=0=s, l=1=p. ) 角量子數(shù)nm magnetic 磁量子數(shù)ns spin 自旋量子數(shù)2.2.1 Electronic States電子運(yùn)動狀態(tài)電子運(yùn)動狀態(tài)n2.2 熒光產(chǎn)生原理nAny two electrons in same orbital (n, l, m) must have different spinsns = + or - nS = si （對于多個電子，總自旋量子數(shù)是價電子自旋量子

10、數(shù)的矢量和）譜線多重性譜線多重性M M：總角量子數(shù)總角量子數(shù)L L與總自旋量子數(shù)與總自旋量子數(shù)S S之間的電磁相互作之間的電磁相互作用產(chǎn)生光譜多重線用產(chǎn)生光譜多重線M: 2S+1 (either 1, 2, 3. ) 式中式中S S為電子的總自旋量子數(shù)，為電子的總自旋量子數(shù)，M M則表示分子中電子的則表示分子中電子的總自旋角動量在總自旋角動量在Z Z軸方向的可能值。軸方向的可能值。M=1為為單重態(tài)單重態(tài)或單線態(tài)；或單線態(tài)； M=3為為三重態(tài)三重態(tài)或三線態(tài)?；蛉€態(tài)。單線態(tài)與三線態(tài)12 MgMg的基態(tài)與第一激發(fā)態(tài)的基態(tài)與第一激發(fā)態(tài)基態(tài)基態(tài)1st激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)3s3p12-1212-121221SJ

11、nL+2S+1=12S+1=12S+1=3內(nèi)量子數(shù)內(nèi)量子數(shù)J有有2S+1個取值個取值(L+S),(L+S-1),(|L-S|)L=l 0 (用用S表示表示) 1(用用P表示表示) 1J=LS 0 1 2, 1, 0 103S113 P313 P303 P323 P光光 譜譜 項(xiàng)項(xiàng) 21SJnL+單重態(tài)單重態(tài)(singlet state) 如果分子中一對電子為自旋反平行，則如果分子中一對電子為自旋反平行，則S=0，M=1，這這種態(tài)被稱為單重態(tài)或單線態(tài)，用種態(tài)被稱為單重態(tài)或單線態(tài)，用S表示。表示。 大多數(shù)化合物分子處于基態(tài)時大多數(shù)化合物分子處于基態(tài)時電子自旋總是成對的，所以是單線態(tài)，電子自旋總是成

12、對的，所以是單線態(tài)，用用S S0 0表示。表示。 在吸收光子后，被激發(fā)到空軌道在吸收光子后，被激發(fā)到空軌道上的電子，如果仍保持自旋反平行狀上的電子，如果仍保持自旋反平行狀態(tài)，則重度未變，按其能量高低可相態(tài)，則重度未變，按其能量高低可相應(yīng)表示為應(yīng)表示為S S1 1態(tài)態(tài)S S2 2態(tài)態(tài)。三重態(tài)三重態(tài)(triplet state) 當(dāng)處于當(dāng)處于S S0 0態(tài)的一對電子吸收光子受激后，產(chǎn)生了在兩個態(tài)的一對電子吸收光子受激后，產(chǎn)生了在兩個軌道中自旋方向平行的電子，這時軌道中自旋方向平行的電子，這時S=S=1 1，M M=3=3，這種狀態(tài)稱為這種狀態(tài)稱為三重態(tài)或三線態(tài)三重態(tài)或三線態(tài)。 因?yàn)樵诖艌鲋校娮右?/p>

13、為在磁場中，電子的總自旋角動量在磁場方向的總自旋角動量在磁場方向可以有三個不同值的分量，可以有三個不同值的分量，是三度簡并的狀態(tài)，用是三度簡并的狀態(tài)，用T T表表示。按能量高低可表示為示。按能量高低可表示為T T1 1, ,T T2 2激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)。Multiplicities:S0 - common, diamagnetic (not affected by B fields)D0 - unpaired electron, many radicals, two equal energy statesT1 - rare, paramagnetic (affected by B fields)

14、 (T0 - doesnt exist, not ground state)Energy(S1)Energy(T1) (difference is energy required to flip electron spin)單重態(tài)與三重態(tài)的能級比較單重態(tài)與三重態(tài)的能級比較 在三重態(tài)中，處于不同軌道的兩個電子自旋平行，兩個電子在三重態(tài)中，處于不同軌道的兩個電子自旋平行，兩個電子軌道在空間的交蓋較少，電子的平均間距變長，因而相互排斥軌道在空間的交蓋較少，電子的平均間距變長，因而相互排斥的作用減低，所以的作用減低，所以T T態(tài)的能量總是態(tài)的能量總是低于低于相同激發(fā)態(tài)的相同激發(fā)態(tài)的S S態(tài)能量。態(tài)能量

15、。T3T2T1S3S2S1S0S0激發(fā)到激發(fā)到S S1 1和和T T1 1態(tài)的概率態(tài)的概率 電子由電子由S S0 0態(tài)激發(fā)到態(tài)激發(fā)到S S1 1態(tài)或態(tài)或T T1 1態(tài)的概率是很不相同的。態(tài)的概率是很不相同的。 從光譜帶的強(qiáng)弱看，從從光譜帶的強(qiáng)弱看，從S0態(tài)激發(fā)到態(tài)激發(fā)到S1態(tài)是自旋允許的，態(tài)是自旋允許的，因而譜帶很寬；而從因而譜帶很寬；而從S0態(tài)激發(fā)態(tài)激發(fā)到到T1態(tài)是自旋禁阻的，一般很態(tài)是自旋禁阻的，一般很難發(fā)生，它的概率是難發(fā)生，它的概率是10-5數(shù)量級。數(shù)量級。 但對于順磁物質(zhì)，激發(fā)到但對于順磁物質(zhì)，激發(fā)到T T1 1態(tài)的概率將明顯增加。態(tài)的概率將明顯增加。 分子吸收光子后各種光物理過程可

16、用分子吸收光子后各種光物理過程可用Jablonski雅布倫斯基雅布倫斯基圖表示。當(dāng)分子得到能量后，可能激發(fā)圖表示。當(dāng)分子得到能量后，可能激發(fā)到各種到各種S和和T態(tài)，到態(tài)，到S態(tài)的電子多于到態(tài)的電子多于到T態(tài)的電子。態(tài)的電子。2.2.2分子的活化與去活化去活化過程去活化過程注意點(diǎn)注意點(diǎn) (1)(1)氣相分子中易觀察到以發(fā)射光子方式失去振動能氣相分子中易觀察到以發(fā)射光子方式失去振動能(2)(2)實(shí)現(xiàn)內(nèi)部轉(zhuǎn)換實(shí)現(xiàn)內(nèi)部轉(zhuǎn)換 a.S a.S1 1，S S2 2 電子能級差小電子能級差小 、易實(shí)現(xiàn)。、易實(shí)現(xiàn)。 b.S b.S1 1，S S2 2 振動能級的位能面有交叉振動能級的位能面有交叉(3)(3)體系

17、間跨越的必要條件體系間跨越的必要條件 a. S a. S1 1、T T1 1位能面在某處有容易達(dá)到的能量相交位能面在某處有容易達(dá)到的能量相交 b. b. 微觀磁場的微觀磁場的微擾微擾存在存在 帶電粒子的極性分子或可極化分子易產(chǎn)生磁效應(yīng)帶電粒子的極性分子或可極化分子易產(chǎn)生磁效應(yīng)或離子外層電子云疏松或離子外層電子云疏松 順磁性分子順磁性分子 O O22外層外層3d3d5 5五個電子不成對五個電子不成對 (4)(4)外部轉(zhuǎn)換使發(fā)光熄滅現(xiàn)象外部轉(zhuǎn)換使發(fā)光熄滅現(xiàn)象 T T1 1 S S0 0 比比 S S1 1 S S0 0 可能性更大可能性更大 (5)(5)去活化眾多過程中，以速度最快、激發(fā)壽命最短的

18、途徑占優(yōu)勢，去活化眾多過程中，以速度最快、激發(fā)壽命最短的途徑占優(yōu)勢，相互競爭。相互競爭。 傳遞途徑傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動弛預(yù)無輻射躍遷分子的活化與去活化Ground StateElectronsS1 excited stateS2 excited stateAbsorbance energyFluorescencenanosecondsAbsorptionfemtosecondsNonradiative dissipationBlue ExcitationInternal Conversionn（1）振動弛豫(Vibration relaxation，簡寫為V

19、R）：當(dāng)分子吸收光輻射后可能從基態(tài)的最低振動能級(v=0)躍遷到激發(fā)單重態(tài)Sn的較高振動能級上。然后，在液相或壓力足夠高的氣相中，分子間的碰撞幾率很大，分子可能將過剩的振動能量傳遞給周圍環(huán)境，自身從激發(fā)態(tài)的高振動能級躍遷至能級的最低振動能級上。n（2）內(nèi)部轉(zhuǎn)移(Internal conversion，簡寫為IC)：當(dāng)高電子能級中的低振動能級與低電子能級中的高振動能級發(fā)生重疊時，常發(fā)生電子從高電子能級以無輻射躍遷形式轉(zhuǎn)移至低電子能級。如圖中，S2和T2中的低振動能級與S1和T1中的高振動能級重疊，電子可的通過振動能級的重疊從S2躍遷至S1，或從T2躍遷至T1。分子吸收輻射能后不管激發(fā)到哪一個激發(fā)

20、單重態(tài)，都能通過振動弛豫及內(nèi)部轉(zhuǎn)移而躍遷到最低(第一)激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。n（3）熒光發(fā)射(Fluorescence emission,FE)：處于激發(fā)單重態(tài)的電子經(jīng)振動弛豫及內(nèi)部轉(zhuǎn)移后到達(dá)第一激發(fā)單重態(tài)(S1)的最低振動能級(v=0)后，以輻射的形式躍遷回基態(tài)(S0)的各振動能級。經(jīng)過振動弛豫和內(nèi)部轉(zhuǎn)移的能量損失，熒光發(fā)射的能量比分子吸收的能量要小，熒光發(fā)射的波長比分子吸收的波長要長。第一發(fā)單重態(tài)最低振動能級的平均壽命得為109104S，因此熒光壽命也在這一數(shù)量級。n（4）系間跨躍(Intersysitem Crossing, ISC)：不同多重態(tài)之間的無輻射躍遷過程，它涉及到受激發(fā)電

21、子自旋狀態(tài)的改變。圖中S1的最低振動能級與T1的較高振動能級重疊，就有可能通過自旋一軌道偶合等作用實(shí)現(xiàn)這一躍遷。系間跨躍的速度很小，經(jīng)歷的時間較長。n（5）磷光發(fā)射(Phosphorescence emission,PE)：激發(fā)態(tài)的電子經(jīng)系間跨躍后到達(dá)激發(fā)三重態(tài)，經(jīng)過迅速完成的振動弛豫而躍遷至第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級，然后以輻射形式躍遷回基態(tài)的各振動能級。磷光波長比熒光波長要長。T1還可能通過熱激發(fā)而重新躍回S1即T1S1，然后再由S1經(jīng)輻射躍遷回S0，發(fā)出熒光，這種熒光稱為延遲熒光。n（6）外部轉(zhuǎn)移(External convertion,EC)：激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子溶質(zhì)分子相互碰撞，并

22、發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的過程。外部轉(zhuǎn)移能使熒光或磷光的強(qiáng)度減弱甚至消失，這種現(xiàn)象稱為猝滅或熄滅。 .3. . 熒光類型熒光類型 從壽命從壽命 瞬時熒光瞬時熒光 1010-8-8s s 內(nèi)發(fā)射內(nèi)發(fā)射 分析中有意義分析中有意義! S S1 1SS0 0+ + h S S1 1+S+S0 0 (S (S1 1 S S0 0) ) 2S2S0 0+ + h 受激準(zhǔn)分子（受激準(zhǔn)分子（excimer） 遲滯熒光遲滯熒光 波長同瞬時熒光，壽命與磷光相似剛性、粘稠介質(zhì)中波長同瞬時熒光，壽命與磷光相似剛性、粘稠介質(zhì)中 E型型 T T1+ 活化能活化能 SS1 1SS0 0+ + h P 型型 T T1 +

23、 T T1 S S1 1 + S+ S0 0 三重態(tài)三重態(tài)三重態(tài)粒子湮沒三重態(tài)粒子湮沒 S S0 0+ + h 壽命為相隨磷光壽命的壽命為相隨磷光壽命的 1/2 復(fù)合復(fù)合(重組）重組）A()+ h 1 AA( () ) + h 2 AA. .+ +( ( ) +e) +e 重組重組+e A()+ h 3 AA( ( ) )Three types of delayed fluorescence are known:E-type delayed fluorescence: The first excited singlet state becomes populated by a thermall

24、y activated radiationless transition from the first excited triplet state. Since in this case the population of the singlet and triplet states are in thermal equilibrium, the lifetimes of delayed fluorescence and the concomitant phosphorescence are equal. T1 S1 S0 h(ii) P-type delayed fluorescence:

25、The first excited singlet state is populated by interaction of two molecules in the triplet state (triplet-triplet annihilation) thus producing one molecule in the excited singlet state. In this biphotonic process the lifetime of delayed fluorescence is half the value of the concommitant phosphoresc

26、ence. T1 T1 S1 S0 S1 S0 h(iii) Recombination fluorescence: The first excited singlet state becomes populated by recombination of radical ions with electrons or by recombination of radical ions of opposite charge.2.3 熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜*MXMX+ + = =n1iihv = =+ +n1jjhvMXMX*2004020010/30/2021XMUPFS01-ITF02Exci

27、tation and emission spectraExcitation and emission spectra 1 2 3 4Excitation spectrumEmission spectraF F em200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 90004008001200160020002400280032003600400044004800 IF 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900040080012001600200024002

28、80032003600400044004800 IF s0s1ExcitationFluorescenceT1kiscPhosphorescence 溶液熒光光譜的特征（1 1）斯托克斯位移）斯托克斯位移( (Stokes shift)n在溶液熒光光譜中，觀察到的熒光發(fā)射波長總是大于激發(fā)波長，這種波長位移現(xiàn)象稱為斯托克斯位移。Emission is at longer wavelength (lower energy) than excitation due to energy losses.em ex = Stokes shift495 nm520 nmStokes Shift is 25

29、nmFluoresceinmoleculeFluorescnece IntensityWavelength 產(chǎn)生Stokes位移的主要原因：首先，由于振動弛豫及內(nèi)都轉(zhuǎn)移的無輻射躍遷激發(fā)態(tài)分子而迅速衰變到S1電子態(tài)的最低振動能級；其次，不同振動能級也發(fā)生振動弛豫至最低振動能級，也造成能量的損失；第三，溶劑效應(yīng)和激發(fā)態(tài)分子可能發(fā)生了某些反應(yīng)，也會加大斯托克斯位移。n（2 2）熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)）熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)n 熒光發(fā)射的產(chǎn)生原理，所以不管激發(fā)光的能量多大，能把電子激發(fā)到何種激發(fā)態(tài)，都將經(jīng)過迅速的振動弛豫及內(nèi)部轉(zhuǎn)移躍遷至第一激發(fā)單重態(tài)的最低能級，然后發(fā)射熒光。熒光光

30、譜只有一個發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)的發(fā)射帶。（3 3）吸收光譜與熒光激發(fā)發(fā)光譜的形狀相近似，）吸收光譜與熒光激發(fā)發(fā)光譜的形狀相近似， 吸收光譜與熒吸收光譜與熒光激發(fā)發(fā)光譜成鏡像關(guān)系光激發(fā)發(fā)光譜成鏡像關(guān)系 基態(tài)上的各振動能級分基態(tài)上的各振動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動能級分布類能級分布類似；基態(tài)上的零似；基態(tài)上的零振動能級與第一激發(fā)態(tài)的二振動能級與第一激發(fā)態(tài)的二振動能級之間的躍遷幾率最振動能級之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。大，相反躍遷也然。nOften, but not always presentnThought to be due to the fact t

31、hat if 0n vibration transition most likely on absorption, then the same most likely on emission.吸收光譜與發(fā)射光譜中0-0振動帶具有相同的能量，但兩者的峰波長并不重合，發(fā)射的0-0帶略向長波方向移動。這是由于激發(fā)態(tài)的電子分布不同于基態(tài)，偶極矩和極化率也有所不同。室溫下，溶液中的溶劑分子在吸光過程中來不及重新定向，分子在激發(fā)后的瞬間仍處于一種比平衡條件下具有稍高能量的溶劑化狀態(tài)。在熒光發(fā)射之前，分子將有時間松弛到能量較低的平衡構(gòu)型。熒光發(fā)射后的瞬間，返回基態(tài)的分子的溶劑化狀態(tài)還是處于處于能量稍高的非平

32、衡態(tài)，最后又松弛到基態(tài)的平衡構(gòu)型。吸光能量略高于光發(fā)射過程所釋放的能量。兩者的能量差在松弛過程中以熱的形式傳遞給溶劑。吸收 h 熒光 h0-0 0-0激發(fā)和發(fā)射后溶劑化的變化2004020010/30/2021XMUPFS01-ITF020 02020404060608080100100120120-5-55 515152525353545455555t/nst/nsN N/0)()(tetNtN-=lDefinitionLifetime for Single molecule: the time the molecule spends in the excited state prior t

33、o return to the ground state. Average lifetime: the average time the molecule spends in the excited state prior to return to the ground state. Average fluorescence lifetime etNNt1)()(,0=2.2.4 4 熒光壽命和量子產(chǎn)率熒光壽命和量子產(chǎn)率熒光的衰變通常是屬于單指數(shù)衰變過熒光的衰變通常是屬于單指數(shù)衰變過程，在程，在t= t= 之前有之前有6363的激發(fā)分子已的激發(fā)分子已經(jīng)衰變了，經(jīng)衰變了，3737的激發(fā)分子則在的

34、激發(fā)分子則在 t t 的時刻衰變的。的時刻衰變的。2004020010/30/2021XMUPFS01-ITF02lExpressionExpression nrk +=1relaxation (10-12 s)S0S1S1hvAhvF knrSimplified Jablonski diagram : Emission rate Knr: nonradiative decay rateLifetimeIntrinsic or natural lifetime(本征壽命本征壽命)10=The lifetime of the fluorophore in the absence of nonra

35、diative processes is called the intrinsic lifetime.n熒光分子的平均壽命與躍遷的許可性兩者之間的關(guān)系大致表熒光分子的平均壽命與躍遷的許可性兩者之間的關(guān)系大致表示如下：示如下：n 10-5/ max nS0 S1， 值約值約103 m2 mol-1，熒光壽命大致為熒光壽命大致為10-8snS0 T1， 值約值約10-3 m2 mol-1 ，磷光壽命大致為磷光壽命大致為10-2sn熒光強(qiáng)度的衰變，通常將遵從如下速率方程式：熒光強(qiáng)度的衰變，通常將遵從如下速率方程式：nlnI0-lnIt = -t/ n式中式中I0和和It分別表示分別表示t0和和tt時

36、刻的熒光強(qiáng)度。通過實(shí)驗(yàn)測量不同時刻時刻的熒光強(qiáng)度。通過實(shí)驗(yàn)測量不同時刻t t所相應(yīng)的所相應(yīng)的I It t值，并作出值，并作出lnItt的關(guān)系曲線，其結(jié)果將得到一條直線，由的關(guān)系曲線，其結(jié)果將得到一條直線，由該直線的斜率便可求得熒光壽命的數(shù)值。該直線的斜率便可求得熒光壽命的數(shù)值。n熒光壽命測定的現(xiàn)代方法熒光壽命測定的現(xiàn)代方法: :n時間相關(guān)單光子記數(shù)法時間相關(guān)單光子記數(shù)法（Time-Correlated Single-Photon counting,TCSPC）; ;n相調(diào)制法相調(diào)制法（Phase modulation methods）; ;n頻閃技術(shù)頻閃技術(shù)（Strobe Techniques

37、）。 nTCSPCTCSPC是目前主要應(yīng)用的熒光壽命測定技術(shù)。是目前主要應(yīng)用的熒光壽命測定技術(shù)。nRefRef：房喻，王輝；熒光壽命測定的現(xiàn)代方法與應(yīng)用；熒光壽命測定的現(xiàn)代方法與應(yīng)用；化學(xué)通報；2001，10，631-6362004020010/30/2021XMUPFS01-ITF022.5 fluorescence quantum yieldnrk+=lDefinition The fluorescence quantum yield is the ratio of the number of photons emitted to the number absorbed lExpressi

38、on lRelationship with lifetimenrk +=110=0=2004020010/30/2021XMUPFS01-ITF02lDeterminationComparison with a standard1. Chose a Standard with a quantum yield s2. At I determine the absorption (As) of the standard3. At ex = I excited the standard, and integrate the emission spectrum of standard, get F4.

39、 Repeat 3th step with the blank solvent. Minus the emission from blank, get FsF 5. Repeat 2-4th steps with the sample, and get Ax and FxsxxSsxFFAA=Quantum Yield Standards Estimate quantum yield of fluorophore comparison of fluorophore with known quantum yield Q = QR (I/IR) (ODR/OD)(n2/n2R) Refractiv

40、e index intensity observed from a point source is modified by (n/n0)22004020010/30/2021XMUPFS01-ITF02lChoose StandardsEnough absorbance both standard and sample at chosen excited wavelength.Moderate quantum yield.1. 0.05 mol / L sulfate of quinine, = 0.55 Examples 2. RuPy3Cl2, deoxygenated solution,

41、 20 C, = 0.042NNNNNNRu2+2Cl-2004020010/30/2021XMUPFS01-ITF022.6 Fluorescence Anisotropyand Fluorescence Polarization光是一種電磁波，具有相位相同的兩個互相垂直的振動矢量，光是一種電磁波，具有相位相同的兩個互相垂直的振動矢量，電矢量和磁矢量電矢量和磁矢量l光的性質(zhì)光的性質(zhì)EHl偏振光偏振光l非偏振光非偏振光2004020010/30/2021XMUPFS01-ITF02Principle of photoselective excitation Information about

42、the size and shape of proteins or rigidity of various molecular environments.Fluorophores preferentially absorb photons whose electric vectors are aligned parallel with transition moment of the fluorophore. In an isotropic solution, fluorophores are oriented randomly. Upon excitation with polarized

43、light, one selectively excites those fluorophore molecules whose absorption transition dipole is parallel to the electric vector of the excitation. This selective excitation results in partially oriented population of fluorophores and in partially polarized fluorescence emission. 2004020010/30/2021X

44、MUPFS01-ITF022004020010/30/2021XMUPFS01-ITF02z激發(fā)偏振器激發(fā)偏振器發(fā)射偏振器發(fā)射偏振器xy檢測器檢測器IIlDefinition 0 . 1, 0=PrI0,11=PrII+-=IIIIPIIII+-=IIIIr2IIIIpolarization熒光偏振熒光偏振anisotropy各項(xiàng)異性各項(xiàng)異性5 . 0, 4 . 0PrFor fluorophore完全偏振光，散射光才能達(dá)到完全偏振光，散射光才能達(dá)到自然光或非偏振光Where I| and I are the fluorescence intensities of the vertically

45、 (|) and horizontally( ) polarized emission, when the sample is excited with vertically polarized light. 2004020010/30/2021XMUPFS01-ITF02Polarization and anisotropyrrP+=23PPr-=32熒光偏振與熒光各向異性可通過以下公式相互轉(zhuǎn)換：熒光偏振與熒光各向異性可通過以下公式相互轉(zhuǎn)換：當(dāng)體系中存在多種熒光體時，所測得的熒光各向異性是各當(dāng)體系中存在多種熒光體時，所測得的熒光各向異性是各種熒光體熒光各向異性的平均值：種熒光體熒光各向異性的

46、平均值： =iiirfr2.2.7 7 熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系shiftstokesPremex,Principle of quantitative and qualitative analysis by fluorometrylQualitative probing parameters: lQuantitative determination bcIF303.20=紫外-可見分光光度計(jì)測量池(吸收池)I0ItI0ItIF,pbC303. 20teT,bCIIlgTlgA - -= = =- -= =- -= =bC303.20te1T1II1- - -= =- -

47、= =- -)e1(IIIbC303.20t0- - -= =- -)e1(I)II(IbC303.20t0F- - -= =- -= = !nx!4x!3x!2x!1x1en432x+ + + + + + + += =)!4)bC30. 2(!3)bC30. 2(!2)bC30. 2(bC30. 2(II4320F + +- - - -+ +- - -= = CbIk30. 2I0FF = =CbIk30. 2I0PP = =CKIF= =KCIP= =一般當(dāng)一般當(dāng)b c 0.05 時時, F 與與c呈線性關(guān)系呈線性關(guān)系Fc*hvhvDDDD+ + +D)(DDD11*+ +2.2.7 7

48、熒光分析法的特點(diǎn)和應(yīng)用熒光分析法的特點(diǎn)和應(yīng)用靈敏度高靈敏度高：測定下限：測定下限01 0.001 g/mL,g/mL, 比分光光度法高比分光光度法高2 24 4個數(shù)量級。個數(shù)量級。（在黑背景下檢測；光源的強(qiáng)度大）（在黑背景下檢測；光源的強(qiáng)度大）選擇性高選擇性高：適當(dāng)選擇激發(fā)光的波長和熒光測定的波長；應(yīng)用適當(dāng)選擇激發(fā)光的波長和熒光測定的波長；應(yīng)用熒光壽命的差別熒光壽命的差別時間分辨技術(shù)。時間分辨技術(shù)。 熒光測定的選擇性熒光測定的選擇性蒽的激發(fā)和發(fā)射光譜蒽的激發(fā)和發(fā)射光譜菲菲和和蒽蒽的熒光光譜的熒光光譜（激發(fā)波長（激發(fā)波長 265 nm) 蒽蒽菲菲 菲在菲在360 nm以上無吸收

49、，用以上無吸收，用365 nm激發(fā)光時，菲無熒光，激發(fā)光時，菲無熒光，可以在可以在400 nm測定蒽的熒光。測定蒽的熒光。 在在265 nm, 蒽和菲均有吸收，蒽和菲均有吸收，以此波長的光激發(fā)，在以此波長的光激發(fā)，在350 nm只有菲有熒光，故可測定菲。只有菲有熒光，故可測定菲。MFS與與UV/Vis 法比較：法比較： 原理原理UV/Vis 吸收吸收MFS 發(fā)射發(fā)射測定方法測定方法I0ItF靈敏度靈敏度, 選擇性選擇性10-510-6molL-110-710-9 molL-1I0F 熒光光度法的應(yīng)用熒光光度法的應(yīng)用生物化學(xué)分析，生理醫(yī)學(xué)研究，臨床檢測生物化學(xué)分析，生理醫(yī)學(xué)研究，臨床檢測. .n

50、直接測定能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)直接測定能產(chǎn)生熒光的物質(zhì). .nIntrinsic fluorophores are those which occur naturally 帶苯環(huán)的氨基酸：色氨酸帶苯環(huán)的氨基酸：色氨酸( (Tryptophan) )、酪氨酸、酪氨酸( (Tyrosine) )、苯基丙氨酸、苯基丙氨酸( (Phenylalanine) ). .2004020010/30/2021XMUPFS01-ITF02Protein fluorescenceProtein fluorescenceH2NCH CCH2OHOIndole group of tryptophan 色氨酸中的吲哚基團(tuán)色氨

51、酸中的吲哚基團(tuán)H2NCH CCH2OHOHN ex = 280, em = 340, highly sensitive to solvent polarityH2NCH CCH2OHOOHtyrosinePhenylalanine TyrosinePhenylalanineTryptophanIntrinsic FluorescenceFluorescence spectra lie in the UV region The spectra for both Tyr and Trp are extremely sensitive to local environment2004020010/30/2021XMUP