大腸菌群的檢測(cè)

1、大腸菌群的檢測(cè)大腸菌群的檢測(cè)大腸菌群的定義大腸菌群的定義: 大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。 大腸菌群不是細(xì)菌學(xué)上的分類命名，而是根據(jù)衛(wèi)生學(xué)方面的要求，提出的與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，即作為食品、水體等是否受過(guò)人畜糞便污染的指示菌，這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致。根據(jù)進(jìn)一步的生化試驗(yàn)，可將這群細(xì)菌再分為大腸艾希氏菌（俗稱大腸桿菌）、弗氏檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌等。大腸菌群基本形態(tài)：大腸菌群基本形態(tài)： 此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，一般約0.5-0.8m*1.0-3.0 m，多單獨(dú)存在或成雙，但不呈長(zhǎng)鏈排列。約50%的菌株有周生鞭毛，但多

2、數(shù)只有1-4根，一般不超過(guò)10根，故菌體動(dòng)力弱。多數(shù)菌株有菌毛，有的有莢膜或微莢膜，不形成芽孢，對(duì)普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 大腸菌群指一群能大腸菌群指一群能發(fā)酵乳糖發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需需氧和兼性厭氧氧和兼性厭氧的的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。該菌主要來(lái)源于人畜糞便，以此作為糞便該菌主要來(lái)源于人畜糞便，以此作為糞便污染指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食污染指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食品有否被腸道致病菌污染。品有否被腸道致病菌污染。 食品中大腸菌群以食品中大腸菌群以100ml 檢樣內(nèi)大腸菌檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)（群最可能數(shù)（MPN）表示。表示

3、。實(shí)驗(yàn)器材實(shí)驗(yàn)器材 蒸汽滅菌物品：蒸汽滅菌物品： 1.乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基試管10支 2.9mL蒸餾水試管5支 干熱滅菌物體：干熱滅菌物體： 10mL移液管1支 1mL移液管5支實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)試劑乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨 20.0g 0.04%溴甲酚指示液25mL乳糖 10.0g 牛膽鹽5.0g 水1000mL除0.04%溴甲酚指示液外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)PH值為7.2-7.6，加入0.04%溴甲酚指示液，根據(jù)要求的用量分裝于含倒管的試管中，滅菌。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基麥康凱瓊脂培養(yǎng)基大腸菌群及大腸桿菌測(cè)定 MPN法檢驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟1）檢樣稀釋）檢樣稀

4、釋（無(wú)菌操作）無(wú)菌操作）將將25mL（或或g）檢樣置于含檢樣置于含225mL滅菌生理鹽水的滅菌生理鹽水的滅菌玻璃瓶，充分振搖（固體檢樣用勻漿器，用滅菌玻璃瓶，充分振搖（固體檢樣用勻漿器，用800010000r/min的速度處理的速度處理1 min）制成制成1：10的均的均勻稀釋液。勻稀釋液。用用1mL滅菌吸管吸取滅菌吸管吸取1：10稀釋液稀釋液1mL，注入含有注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內(nèi)，混勻，制成滅菌生理鹽水的試管內(nèi)，混勻，制成1 ：100的的稀釋液。稀釋液。另取另取1mL滅菌試管，按操作依次做滅菌試管，按操作依次做10倍遞增稀釋倍遞增稀釋液，每稀釋一次，換用一支液，每稀釋一次，換用一

5、支1 mL滅菌試管。滅菌試管。 2）乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)）乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 接種接種1mL待檢樣品于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)。待檢樣品于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)。接種接種3個(gè)稀釋度，每一稀釋度接種個(gè)稀釋度，每一稀釋度接種3管，置管，置（36土土1)溫箱內(nèi)培養(yǎng)（溫箱內(nèi)培養(yǎng)（24士士2) h。如所有乳如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸桿糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸桿菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行。菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行。3）分離培養(yǎng)分離培養(yǎng) 將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)接在伊紅美藍(lán)將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)接在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置（瓊脂平板上，置（36士士1)恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)18一一24

6、 h。取出，觀察菌落形態(tài)，并做革蘭取出，觀察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和證實(shí)試驗(yàn)。氏染色和證實(shí)試驗(yàn)。4）證實(shí)試驗(yàn)證實(shí)試驗(yàn) 在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1一一2個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置（管，置（36士士1)恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)（恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)（24士士2) h，觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、革蘭氏觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無(wú)芽袍桿菌，即可報(bào)告為大染色為陰性的無(wú)芽袍桿菌，即可報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性。腸菌群陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)報(bào)告 根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的管數(shù)，查根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的管數(shù)，查MPN檢索表

7、，報(bào)告每檢索表，報(bào)告每100mL（或或g）大腸大腸菌群的菌群的MPN。革蘭氏染色革蘭氏染色 基本原理：基本原理： 革蘭氏染色的機(jī)理主要是利用兩類細(xì)菌的細(xì)胞壁成分和結(jié)構(gòu)的不同。革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁中含有較多的類脂質(zhì)，而肽聚糖的含量較少。當(dāng)用酒精或丙酮酸脫色時(shí)，類脂質(zhì)被溶解，增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染后的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)胞被脫色，經(jīng)復(fù)染后，又染上復(fù)染液的顏色。而革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁中肽聚糖的含量多而且交聯(lián)度大，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)乙醇或丙酮洗脫后，肽聚糖層的孔徑變小，通透性降低，因此細(xì)胞仍保留初染時(shí)的顏色。步驟：結(jié)果: 陽(yáng)性菌陽(yáng)性菌紫色紫色 陰性菌陰性菌紅色紅色結(jié)晶紫初染碘液媒染乙醇

8、脫色蕃紅復(fù)染涂片固定革蘭氏染色法（革蘭氏染色法（Gram Stain）革蘭氏染色革蘭氏染色法操作步驟法操作步驟1、涂片涂片：取大腸桿菌制成涂片，干燥，固定。：取大腸桿菌制成涂片，干燥，固定。2、染色染色：用草酸銨結(jié)晶紫染色：用草酸銨結(jié)晶紫染色1min , ,用水沖洗。用水沖洗。3、媒染媒染：滴加革蘭氏碘液沖去殘水，并用碘液覆：滴加革蘭氏碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋蓋1min，用水沖去碘液。用水沖去碘液。4、乙醇脫色乙醇脫色：斜置載玻片于一燒杯上，滴加：斜置載玻片于一燒杯上，滴加95%乙乙醇，并輕輕搖動(dòng)載片，至乙醇液不呈現(xiàn)紫色時(shí)停醇，并輕輕搖動(dòng)載片，至乙醇液不呈現(xiàn)紫色時(shí)停止（約止（約0.5min）

9、。）。立即用水沖凈乙醇并用濾紙輕立即用水沖凈乙醇并用濾紙輕輕吸干。脫色是革蘭氏染色的關(guān)鍵，必須嚴(yán)格掌輕吸干。脫色是革蘭氏染色的關(guān)鍵，必須嚴(yán)格掌握乙醇的脫色程度。若脫色過(guò)度則陽(yáng)性菌被誤染握乙醇的脫色程度。若脫色過(guò)度則陽(yáng)性菌被誤染為陰性菌；而脫色不夠時(shí)陰性菌被誤染為陽(yáng)性菌。為陰性菌；而脫色不夠時(shí)陰性菌被誤染為陽(yáng)性菌。5、復(fù)染復(fù)染：蕃紅染液復(fù)染：蕃紅染液復(fù)染1min ,水洗。水洗。6、吸干并鏡檢吸干并鏡檢：若研究工作中要確證未知：若研究工作中要確證未知菌的革蘭氏反應(yīng)時(shí)，則需同時(shí)用已知菌進(jìn)菌的革蘭氏反應(yīng)時(shí)，則需同時(shí)用已知菌進(jìn)行染色作對(duì)照。行染色作對(duì)照。 細(xì)菌經(jīng)細(xì)菌經(jīng)結(jié)晶紫結(jié)晶紫初染染成初染染成紫色紫色。 革蘭氏染色陽(yáng)性菌革蘭氏染色陽(yáng)性菌（G+）細(xì)胞壁肽聚糖層數(shù)多，細(xì)胞壁肽聚糖層數(shù)多，為空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，再經(jīng)乙醇脫水，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更為致為空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，再經(jīng)乙醇脫水，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更為致密，染料復(fù)合物不易從細(xì)胞內(nèi)漏出，仍為密，染料復(fù)合物不易從細(xì)胞內(nèi)漏出，仍為紫色紫色。 革蘭氏染色陰性菌革蘭氏染色陰性菌