二代測序(NGS)實驗方案設(shè)計和應(yīng)用

1、這里為您介紹二代測序的相關(guān)流程和應(yīng)用。隨著人類基因組工程的完成，對于低花費的測序技術(shù)的需求促進了高通量二代測序技術(shù)的發(fā)展。這些新的測序平臺允許進行高通量測序， 具有廣泛的應(yīng)用：全基因組從頭測序或者重測序目標序列重測序轉(zhuǎn)錄組分析微生物組研究基因調(diào)控研究NGS序歹y二代測序儀器有很多種組合，在通量、片段長度、準確度、每一輪測序成本、每百萬堿基對測序成本、初始成本、規(guī)格和技術(shù)方面存在存在差異。從規(guī)格和初始成本的角度而言，二代測序儀器可輕松地分類為更窄的范圍，也就是所謂的“臺式測序儀”和高通量儀器。臺式測序儀使得任何實驗室都可以像使用real-time PCR 樣，自己進行測序。這些儀器可以和一些靶標

2、序列富集技術(shù)相結(jié)合，用在一些臨床的應(yīng)用中，其中：選定的靶標基因用于深度分析，以檢測稀有的突變，或者檢測多樣樣本中（比如癌癥樣本）中的突變。目前，這些儀器的通量在10 Mb到7.5 Gb之間，但是隨著硬件，軟件和試劑的持續(xù)改善，通量也在穩(wěn)步增加。高通量測序儀非常適合于大量的，基因組范圍的研究，每次測序能測定600 Gb的序列。一些這樣的高通量和高精度的平臺，能測定的片段長度相對較短，這對于高重復性的序列和未知基因組的從頭測序就可能成為問題。與此相反，也有一些儀器能測序的片段較長（達到2500 bp ），但是其精度和測序能力（90 Mb）要低很多。還有一些測序能力位于兩者之間的儀器（800 bp，

3、700 Mb）。因此，應(yīng)用決定了哪一種儀器是最合適的。有一種新的方法被稱作“納米孔測序”。這種技術(shù)中，根據(jù)一個DNA鏈通過一個合成的或者蛋白納米孔道所引起的電流的改變，可以確定通過這個孔道的堿基。這理論上可以僅用一步就測序一個完整的染色體，而不需要生成新的DNA鏈。DNA測序二代DNA測序的工作流程如下：DNA樣本制備文庫構(gòu)建和驗證文庫分子大規(guī)模平行克隆擴增測序二代測序DNA羊本的質(zhì)量控制首先，評價基因組 DNA勺質(zhì)量是非常必要的（完整性和純度）。凝膠電泳法基因組DNA勺完整性和大小，可以用常規(guī)或者脈沖場瓊脂糖凝膠電泳（PFGE）來檢測。常規(guī)的凝膠電泳的精確度不高，這是因為大的DNA分子在凝膠

4、中移動的時候，本質(zhì)上是用一種與尺寸無關(guān)的方式一起移動的。但是，它仍然能夠提供完整性（大小范圍）和純度（RNA污染物在凝膠底部形成脫尾條帶）方面的有效信息。因此，它仍然是評價基因組DNA質(zhì)量的有效方法之一。注：RNA污染會導致DNA濃度高估，并且抑制一些下游步驟。如果能肯定有RNA虧染，則可使用去 DNase的RNase I處理樣本。分光光度測定法分光光度儀在260 nm和280 nm處讀數(shù)的比例（Ac/As。）可以用來估計 DNA相對于一些吸收紫外光的雜質(zhì)（比如蛋白）的純度。純凈的DNA的 A26c/ A28c 比例大約為 1.7 - 1.9。注：想要獲得精確的 A260/A280 值，需要在

5、弱堿性的緩沖溶液中測定吸光度 （比如, 10 mM Tris ? Cl, pH 7.5）。第二個步驟是測定基因組 DNA的濃度。分光光度法DNA的濃度可以通過使用分光光度儀測定其在260 nm波長的吸光度來確定。Nanodrop目前被廣泛使用，因為它需要的樣本量少（1 g l），并且使用方便（不需要比色皿）。為了確保結(jié)果的可靠性，讀數(shù)應(yīng)該在0.1 到 1.0 之間。注：吸光度測定不能區(qū)別 DNA和RNA RNA污染物會導致DNA濃度高估。但是，純凈 RNA的比值在2.0左右，而純凈的DNA大約 為1.8。因此，如果這個值為1.95，那么說明樣本里面有RNA雜質(zhì)。注：苯酚在270 - 275 n

6、m的波長范圍內(nèi)有最大的吸光度，非常接近于DNA因此苯酚能提高樣本在 260 nm附近的吸光度，從而導致高估DNA的產(chǎn)量和純度。熒光法熒光法使用熒光染料測定 DNA的濃度，具有特異性和靈敏性。Hoechst 33258結(jié)合到DNA上后，能增大458 nm波長附近的發(fā)光強度，除此之外，也可以使用一些更加靈敏的熒光染料，比如 PicoGreen 染料?；?PicoGreen 染料的實驗，比紫外吸光光度法靈敏 10， 000 倍， 而比使用Hoechst 33258染料的方法至少靈敏 400倍。和紫外吸光光度法不同，PicoGreen實驗對雙鏈DNA的選擇性要遠高于 RNA和單鏈DNA。DNA標準品

7、和樣本與熒光染料混合，并且使用熒光計檢測。將樣本的測定結(jié)果與標準品的測定結(jié)果相比較，以確定DNA的濃度。Real-time PCR可以使用real-time PCR 技術(shù)來測定DNA羊本的數(shù)量和質(zhì)量。多重PCR技術(shù)使用引物集在多個位點擴增不同大小的片段，是檢測DNA損傷和片段化的有效質(zhì)控手段。此類技術(shù)試驗專門測定可經(jīng)PCF擴增，適于二代測序的DNA分子。上述提到的這些常規(guī)方法，通常不能測定的樣本中擴增得到的 DNA的量，或者會高估了 DNA的量。與它們相比，real-time PCR更加適用于預(yù)測DNA羊本是否適合于二代測序。文庫制備對于大多數(shù)商業(yè)化的二代測序平臺，使用諸如橋式擴增或者乳液PC

8、R方法，對文庫中的 DNA片段進行克隆擴增，以產(chǎn)生足夠拷貝數(shù)量的測序模板非常必要。通過將平臺特異性的適配子與感興趣的DNA源（比如基因組 DNA雙鏈cDNA或者PCR擴增子等所產(chǎn)生的 DNA片段）退火，得到片段文庫。適配子序列的存在，使得我們可以對文庫分子進行選擇性的克隆擴增。因此，這種方法不需要像傳統(tǒng)的方法那樣， 在微生物中間體中，對基因組片段進行微生物克隆。另外，適配子序列中，還含有平臺特異性的測序引物的結(jié)合位點。通常情況下，一個常規(guī)的 DNA文庫構(gòu)建方案包含四步：片段化DNA對DNA片段進行末端修復連接適配子序列（不適用于單分子測序）對可選的文庫進行擴增目前有四種方法用于產(chǎn)生基因組DNA

9、碎片：酶消化法、超聲波法、噴霧法和水動力剪切法。這四種方法都可以用于文庫構(gòu)建，但是每一種方法都有其優(yōu)點和局限性。核酸內(nèi)切酶消化的方法快速并且容易，但是難以精確的控制片段長度的分布。另外這種方法可能會對基因 組DNA的呈遞引入偏倚。另外三種技術(shù)使用物理的方法將DNA勺雙鏈打斷，這種斷裂是隨機的，因此能在文庫中對DNA進行無偏的呈遞?？梢允褂铆傊悄z電泳或者自動化的DNA分析方法，對DNA片段的尺寸分布進行控制。片段化DNA之后，需要將DNA修復，產(chǎn)生5'磷酸化的平末端 DNA以便能夠和測序平臺特異性的適配子相連接。文庫構(gòu)建的效率直接依 賴于DNA末端修復的效率和準確性。末端修復混合溶液

10、將 5'或者3'的粘性末端轉(zhuǎn)變成 5'磷酸化的平末端 DNA在大多數(shù)情況下，末端修復通過T4 DNA聚合酶的5' 3'聚合酶活性和3' 5'的核酸外切酶活性完成。而 T4多聚核苷酸激酶確保平末端的DNA片段5'端的磷酸化，以便進行后續(xù)的適配子連接。根據(jù)所使用的測序平臺，平末端 DNA片段可以直接與適配子連接，或者需要在其片段的3 '端增加一個單獨的突出的腺苷酸A,以便與平臺特異性適配子上突出的胸苷酸T相互配對。通常情況下，使用Klenow片段（具有最低的 3'到5'端的核酸外切酶活性），或者使用其它具有末端

11、轉(zhuǎn)移酶活性的聚合酶催化這一步驟。T4 DNA連接酶將雙鏈的適配子與文庫片段修復過的末端相連，然后使用回收反應(yīng)或者根據(jù)DNA的尺寸，選擇性去除文庫中未連接的適配子和適配子二聚體。大小篩選方法包括使用瓊脂糖凝膠電泳分離，使用磁珠或者使用高等的基于柱的純化方法。在連接過程中可能出現(xiàn) 適配子的二聚體，它們會和與適配子連接的文庫片段共同擴增，從而降低測序平臺對真正文庫片段測序的能力并且降低測序的質(zhì)量，因 此在測序之前，必須將它們從文庫中除去。一些測序平臺要求文庫片段的長度分布在比較窄的范圍內(nèi)，以得到最佳的結(jié)果，很多時候， 這只能通過去除凝膠電泳上的相應(yīng)的片段條帶實現(xiàn)。這種方法也可以用來去除適配子二聚體。

12、完成這一步驟之后，應(yīng)該對 DNA片段文庫的質(zhì)量進行檢測，并進行定量檢測。根據(jù)濃度和測序文庫的適配子設(shè)計，既可以直接稀釋溶液并用于測序，也可以對文庫進行選擇性擴增。在文庫擴增階段，使用高保真的DNA聚合酶，合成完整的適配子序列，通過與PCR引物的重疊，用于后續(xù)的克隆擴增和與測序引物結(jié)合，或者提高DNA文庫的產(chǎn)量。為了得到最佳的文庫擴增結(jié)果，要求DNA聚合酶具有高保真性和最小的序列偏倚。文庫質(zhì)量評估方法，參見 NGS文庫質(zhì)控。為了充分利用測序能力，不同樣本得到的測序文庫可以放在一起，在同一輪實驗中一同測序。通過將DNA片段與具有不同特征的適配子相連接，可以實現(xiàn)這一過程，即對于每一個樣本使用不同的短

13、核苷酸序列作為適配子。有一些其它的方法可以用于簡化文庫構(gòu)建。有一種新方法使用轉(zhuǎn)位酶/DNA的復合物進行體外轉(zhuǎn)座，以便在同一個試管中同時將DNA片段化并標記。通過對所標記的 DNA片段進行有限次數(shù)的 PCF擴增，可以構(gòu)建完整的測序文庫，這節(jié)省了操作步驟和時間。但是，使用體外 轉(zhuǎn)座構(gòu)建的文庫，與傳統(tǒng)方法構(gòu)建的文庫相比，具有更高的序列偏倚。NGS文庫質(zhì)控高質(zhì)量的文庫是成功進行第二代測序的關(guān)鍵。文庫構(gòu)建包含復雜的步驟，比如片段化樣本、修復末端、將末端腺苷?；⑦B接適配子和 擴增文庫。根據(jù)使用的平臺和文庫類型，這些步驟也會發(fā)生變化。監(jiān)控每一個步驟非常必要，包括在片段化樣本之后檢查片段的尺寸， 以及連接適

14、配子之后檢查片段的大小和濃度。文庫驗證過程中，需要分析文庫中片段的大小和數(shù)量，這是質(zhì)控的最后步驟。評估文庫中片段的大小瓊脂糖和PAGE凝膠電泳是傳統(tǒng)的檢測片段大小的方法，它們比較耗時。最近，基于微流技術(shù)的電泳或者毛細管電泳越來越廣泛的用于檢測片段的大小和濃度。即買即用的芯片和膠盒省去了配置凝膠的步驟， 使用方便。它們具有更高的通量，并且省去了很多的手動操作時間。除此之外，它們的靈敏度更高（對于檢測的限制更少），并且能完 全自動化的獲取數(shù)據(jù)和輸出電子化的數(shù)據(jù)資料。這些儀器能同時檢測片段的大小和濃度。測定文庫中的片段數(shù)量分光光度法和熒光法參見分光光度法和熒光法電泳設(shè)備如前所述，基于微流技術(shù)的電泳和

15、毛細管電泳除了提供片段大小的信息之外，還提供了定量檢測數(shù)據(jù)。但是，電泳、分光光度法和熒光 法的一個共同的局限性是，都只檢測總的核苷酸的濃度，而非與適配子連接的分子的濃度。Real-time PCR將適配子連接到文庫分子的兩端，使得可以在平行的PCF擴增步驟中擴增上百萬個獨立的 DNA分子（乳液PCR或者橋式PCR。在有些儀器中，乳液PCR可以將一個DNA分子擴增到數(shù)百萬個相同序列的拷貝，并全都結(jié)合在同一個珠子上。在另一種平臺上，橋式PCR能夠?qū)⒁粋€DNA分子轉(zhuǎn)變成一個包含相同序列的多個拷貝的 DNA簇。因此，兩端連接了適配子的擴增之后的分子，決定了乳液PCR中模板和珠子的比例以及橋式 PCR中

16、產(chǎn)生的最佳DNA簇。對擴增后的文庫中的分子進行精確的定量檢測，對于確保片段的質(zhì)量和高效的獲得數(shù)據(jù)是非常重要的。低估擴增文庫中的分子數(shù)量，會導致混雜的信號以及難以解析的數(shù)據(jù)；相反地，高估分子的數(shù)量會降低結(jié)合模板的珠子或者DNA簇的產(chǎn)量，并且沒有充分利用測序能力。Real-time PCR能夠特異性的定量檢測兩端結(jié)合有適配子的DNA分子，因此能夠?qū)U增文庫中的分子進行高度精確的定量檢測。Real-timePCR的靈敏性非常高，可以對濃度非常低的文庫分子進行定量檢測，即使其濃度低于傳統(tǒng)方法可以檢測的閾值。因此，這種方法能盡量減 少對文庫的擴增，降低可能的偏倚。用于決對定量檢測的數(shù)字 PCR數(shù)字PCR

17、能夠?qū)Χ鷾y序的文庫進行絕對定量檢測，而不需要標準品。這個技術(shù)對文庫進行有限的稀釋，并進行大量獨立的PCR反應(yīng)；因此，大多數(shù)反應(yīng)沒有模板，得到陰性的結(jié)果。一個單獨的陽性PCR反應(yīng)統(tǒng)計為一個單獨的模板分子。通過統(tǒng)計所有陽性PCR勺數(shù)量，能夠確定文庫分子的絕對數(shù)目。數(shù)字PCR的主要優(yōu)點在于：單分子的敏感性與PCR擴增的效率無關(guān)，因為成功的擴增被統(tǒng)計為一個分子，而與最終產(chǎn)物的數(shù)量無關(guān)但是，這種技術(shù)需要特殊的儀器，并且花費較高，因此尚未廣泛用于文庫定量檢測。宏基因組學MetagenomicsDNA 測序的應(yīng)用領(lǐng)域之一是宏基因組領(lǐng)域，即從環(huán)境樣本中直接回收的遺傳物質(zhì)的非培養(yǎng)研究。宏基因組學是指一個環(huán)境樣

18、本中所包含的所有微生物基因組的功能和序列分析。這個詞匯起源于“meta” （在這里指對于基因多樣性的系統(tǒng)性理解）和“ genomics ” （對一個物種的遺傳物質(zhì)的綜合分析）。宏基因組不是一個新的學科，但由于二代測序技術(shù)所帶了的諸多可能性，宏基因組的應(yīng)用經(jīng)歷了巨大的提升。據(jù)估計，微生物中僅有 1%左右是可培養(yǎng)的，因此宏基因組學的研究能極大的拓展我們對于環(huán)境的認識。很多年以來，“宏基因組”這個詞匯僅與環(huán)境樣本的分析有關(guān)，比如，分析從極端的生存環(huán)境下分離得到的DNA以便發(fā)現(xiàn)能用于工業(yè)的新的生物催化劑。但是，通量的極大提高，以及所花費的費用和時間的降低，將這個領(lǐng)域的應(yīng)用擴展到了很多其他方面。宏基因組

19、學可分成幾個領(lǐng)域，包括：病理基因組學/感染基因組學微生物組分析環(huán)境宏基因組學注：這并不是全面的分類，研究者可以選擇其他的分類標準。病理基因組學/感染基因組學和疾病的診斷相關(guān)，用于確定有疾病癥狀的患者體內(nèi)未知的病原體。這通常是極具挑戰(zhàn)性的過程，因為微生物的數(shù)量可能非常少（每毫升血液中大概有1-10個細胞）。與之相反，微生物組分析則涉及到數(shù)量巨大的微生物，比如口腔或者直腸拭子中的微生物。此時，我們的目標是分析這些菌群的組成。考慮到人體僅包含1%勺人類細胞而其它99%都是微生物細胞，微生物組分析在未來的診斷技術(shù)中有潛在的巨大應(yīng)用。更多細節(jié)，請見人類微生物組工程（）。環(huán)境宏基因組學的目標除了包括傳統(tǒng)的

20、尋找新的生物催化劑之外，還包括研究和鑒定棲息環(huán)境。從理論上來講，環(huán)境宏基因組學有兩種不同的研究方法：全基因組分析：對所有存在的DNA進行測序16S分析：僅對16S rRNA DNA進行測序第一種方法只是簡單的對樣本中存在的所有DNA進行測序。這可以完整地描繪所有出現(xiàn)過的微生物，并且可能發(fā)現(xiàn)新的酶或者酶家族，以及抗生素的抗性。另一方面，這種方法需要較高的測序能力，因而，相對于第二種方法，其通量較低并且花費較高。與此相關(guān)的進一 步的方法正在研發(fā)。在宏基因組的應(yīng)用中，通常需要能提供較高的片段長度的測序儀，這是因為通常沒有參考序列可供參照。對于16S rRNA分析而言，測序儀的讀長需要覆蓋整個區(qū)域（另

21、請參照二代測序儀）。RNA 測序RNA測序（RNA-seq）是使用深度測序技術(shù)來研究生物體轉(zhuǎn)錄組的方法。此方法在構(gòu)建合適的文庫之后，對樣本中的RNA直接測序，得到豐富的數(shù)據(jù)集以進行分析。這項技術(shù)的高靈敏度和高分辨率使得它成為研究整個轉(zhuǎn)錄情形的有價值的工具。數(shù)據(jù)的定量性以及測序技術(shù)的高動態(tài)范圍使得其對基因表達的分析具有高度的靈敏性。數(shù)據(jù)的單個堿基的分辨率提供了關(guān)于單核苷酸多態(tài)性（SNP）、選擇性剪接、外顯子/內(nèi)含子邊界、非翻譯區(qū)及其它元件的詳細信息。除此之外，RNA-seq不需要預(yù)先知道參考序列，這使得從頭的轉(zhuǎn)錄組分析和新的變異體和突變體的檢測成為可能。RNA-seq是研究轉(zhuǎn)錄組的強大、革命性方

22、法，但是使用這種技術(shù)需要非常仔細以獲得最高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。RNA-seq中需要考慮的因素第一個需要考慮的因素是樣本富集。總RNA通常只包含比例很少的編碼 RNA或者功能RNA樣本中大部分 RNA是核糖體RNA（ rRNA大約占到了總RNA的 80 - 90%和較少的轉(zhuǎn)運 RNA （tRNA）。為了避免將80 - 90%勺測序資源用在重復的rRNA序列上，通常在測序之前，需要從樣本中去除rRNA這通?？梢酝ㄟ^特定的消耗rRNA實現(xiàn)，也可以通過使用寡聚胸腺嘧啶富集技術(shù)選擇性富集Poly A實現(xiàn)。消耗rRNA的方法可以同時保留編碼 RNA和非編碼RNA（項非常重要的研究內(nèi)容）的信息，而 Poly A富集

23、則僅保留了編碼 mRNA Poly A富集可能 會丟掉特定的RNA和具有高轉(zhuǎn)換率的 RNA有一些其他的方法可以避免rRNA的影響，比如選擇性降解大量轉(zhuǎn)錄物，或者不擴增rRNA的擴增技術(shù)。但是這些方法不像rRNA消耗或者poly A 富集那么常見，并且可能扭曲轉(zhuǎn)錄物表征的正常水平。另外一個需要考慮的因素是要研究的 RNA的大小。RNA轉(zhuǎn)錄物跨越比較大的大小范圍；與常規(guī)的 RNA分析相比，關(guān)注小 RNA的實驗（比如 microRNA或者長度范圍在15 - 35bp的RNA，需要特別的純化和文庫構(gòu)建方案。大多數(shù)其他大小的RNA片段可以同時測序（RNA測序的常用步驟之一是將 RNA分割成普通長度，比如

24、 200 - 300 nt長度的片段）。RNA-seq測序操作步驟一旦確定了移除核糖體的方法和要研究的片段大小，就可以將RNA勾建成一個文庫。對于大多數(shù)測序儀器而言，這包括首先將RNA丁碎成片段，其次通過逆轉(zhuǎn)錄方法構(gòu)建雙鏈cDNA在后續(xù)的文庫構(gòu)建過程中，這些雙鏈的cDNA被當作普通的基因組DNA來對待。如果想要保留RNA的直接信息（鏈型），必須使用修改過的文庫構(gòu)建方案，比如將mRNA與連接適配子直接相連，或者標記cDNA的一條鏈以便在測序之前移除。在進行測序計劃過程中，需要考慮三個主要的因：測序深度、讀長和是否使用雙端測序數(shù)據(jù)。測序深度可以提供RNA轉(zhuǎn)錄物的豐度信息，并且較大的測序深度使得對于

25、稀有轉(zhuǎn)錄物的檢測更加靈敏。讀長也很重要，因為較長的讀段對于檢測剪接事件更加靈敏（內(nèi)含子-外顯 子邊界，外顯子-外顯子邊界）。雙端測序數(shù)據(jù)能提供更多關(guān)于轉(zhuǎn)錄物結(jié)構(gòu)的信息，特別是相互分隔的較遠的外顯子。一般而言，從頭分析以及尋找新的結(jié)構(gòu)變異要求較高的測序深度和讀長，并且會得益于雙端測序數(shù)據(jù)。典型的測序應(yīng)用包含 100 - 200 M片段，長度為2 x50-100 bp 。與之相反，表達分析得益于較高的測序深度，但是讀長和雙端測序數(shù)據(jù)則對結(jié)果的改善作用較小。這方面應(yīng)用的一個典型實驗包含10 - 30 M片段，讀長為1 x 35 - 100 bp?；蛘{(diào)控研究二代測序技術(shù)也是研究基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的強有力的

26、工具。比如ChlP-seq技術(shù)(染色質(zhì)免疫共沉淀測序)可以用于分析蛋白-DNA的相互作用。二代測序技術(shù)也能用于確定基因組的全局甲基化模式。ChlP-Seq染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù) (ChlP) 是用于研究轉(zhuǎn)錄因子和修飾組蛋白基因調(diào)控機制的強大、多功能方法。這種技術(shù)用于確定活細胞中染色質(zhì) 上那些與轉(zhuǎn)錄因子、共調(diào)節(jié)因子、修飾組氨酸、染色質(zhì)重塑蛋白或者其它的核因子相互結(jié)合的區(qū)域。整個操作過程非常耗時，包含了很多步驟和變量，每一個步驟都需要研究者根據(jù)自己的模型體系進行優(yōu)化。將細胞與甲醛交聯(lián)之后，將染色質(zhì)中共價相連的基因組DNA和核因子復合物分離出來，然后經(jīng)過超聲波處理，剪切成可以處理的大小。抗體與目標核蛋

27、白特異性免疫共沉淀時，也將與這些核蛋白特異性結(jié)合的基因組DNA也沉淀下來了。去除化學交聯(lián)并經(jīng)過核酸純化處理的這些DNA可用于測序、基于微陣列的基因組雜交或者PCRT增。ChIP與二代測序技術(shù)聯(lián)用(ChlP-Seq )可研究與感興趣蛋白相結(jié)合的位點在基因組的范圍內(nèi)的分布。與微陣列分析(ChlP-Chip)相比，ChlP-Seq技術(shù)提供了較高的空間分辨率，動態(tài)范圍和基因組覆蓋度，因而它對于DNA結(jié)合位點的檢測具有超級的靈敏度和準確度。另外， ChIP-Seq 技術(shù)通常只要很少的起始樣本輸入量，并且不需要雜交探針，具有較高的靈活性，任何 測序過基因組的物種都可以使用這種方法進行研究。高效的ChlP-

28、Seq過程需要優(yōu)化幾個關(guān)鍵的變量。首先，甲醛交聯(lián)的溫度和時間需要優(yōu)化。如果蛋白和DNA交聯(lián)的過于緊密，則在測序之前無法將染色質(zhì)有效地打碎成片段，并且去除交聯(lián)也會遇到困難。通常情況下，最好以在37 ° C下與1%勺甲醛共培育10分鐘起始，然后在此基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化。有幾種不同的方法可以將染色質(zhì)打成碎片，比如超聲波和酶消化(比如使用微球菌核酸酶)。如果使用二代測序技術(shù)來分析免疫共沉淀的DNA染色質(zhì)碎片的大小應(yīng)在大約100 - 300核苷酸長度范圍內(nèi)，并且每一個測試系統(tǒng)中(細胞的類型、組織的類型)，將染色質(zhì)打碎成片段的參數(shù)也需要嚴格優(yōu)化。ChlP實驗的成功與否取決于所使用的抗體的量和特異性。

29、最好選用能從多家抗體廠商處獲得的，經(jīng)過ChlP實驗驗證的抗體。為了確定抗體能特異性地沉淀目標蛋白，可以使用蛋白印跡技術(shù)檢測核提取物。如果在結(jié)果中，僅能觀察到一條特定大小的條帶，則可認為該抗體 是特異性的。使用選定的抗體進行免疫共沉淀，然后通過蛋白印跡分析技術(shù)確定抗體是否能特異性的沉淀目標蛋白。如果這樣的實驗失 敗了，那么還可以將選定的抗體與培養(yǎng)的細胞進行免疫熒光試驗。如果僅有細胞核顯色，則說明抗體至少能特異性的識別一種位于細胞 核內(nèi)并可結(jié)合到DNA上面的蛋白。根據(jù)目標蛋白的豐度，經(jīng)過驗證的抗體的量以及用于免疫共沉淀的染色質(zhì)的量必須經(jīng)過優(yōu)化，以便獲得足夠的DNA進行測序。對于識別組蛋白和組蛋白修

30、飾的抗體而言，每一次免疫共沉淀反應(yīng)大概需要100，000到1百萬個細胞中的染色質(zhì)。如果轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的動態(tài)性較高或者與組蛋白相比，僅在有限的基因組位點上結(jié)合，那么實驗就需要更多的染色質(zhì)。為避免多余的抗體與非目標蛋白和染色質(zhì)的非特異性結(jié)合，同時保證能沉淀足夠多的目標蛋白，每一次免疫共沉淀反應(yīng)使用的抗體的數(shù)量也非常重要。通常而言，1-10 gg的抗體即可得到合理的結(jié)果?？梢杂脤φ辗磻?yīng)來比對 ChlP 反應(yīng)的特異性。在平行的 ChlP 反應(yīng)中，使用同樣數(shù)量的染色質(zhì)，可以使用同型的對照抗體或者沒有抗體的 珠子用來比照抗體和珠子與蛋白和染色質(zhì)的非特異性的結(jié)合。通過比較陰性對照樣本和ChlP樣本中在

31、特定位點沉淀的DNA的量，能計算這個位點的富集因子。但是，在這種免疫共沉淀對照實驗中得到的沉淀物的量通常很少，不足以提供足夠的片段進行二代測序。因此，ChlP-Seq 實驗通常使用輸入對照樣本作比對。在這種情況下，每個 ChlP 反應(yīng)中通常有 1%交聯(lián)并且打碎的染色質(zhì)被用來去除交聯(lián)并且與 沉淀的樣本一同純化并進行后續(xù)的深度測序。這使得我們可以比對由于打碎染色質(zhì)所引起的偏移，這些偏移表現(xiàn)在染色質(zhì)的局部結(jié)構(gòu)，DNAT增，測序，拷貝數(shù)量的變化，以及測定基因組區(qū)域的能力。在沉淀的DNA碎片去除交聯(lián)和純化之后，建議使用real-time PCR 技術(shù)確認與目標蛋白結(jié)合的基因組位點的回收和富集效果。通過比較輸入對照組與 Chip樣本的qPCR結(jié)果，可以計