Cu2+脅迫對大豆生長和抗氧化酶活性的影響

1、Cu2+脅迫對大豆生長和抗氧化酶活性的影響摘要：植物體攝入過量的重金屬Cu2+會對植物產(chǎn)生毒害作用，為探討外施Cu2+對大豆幼苗的毒害機(jī)理，以齊黃35為試驗材料，采用盆栽法，以不同濃度0、20、200、400g/gCu2+處理液進(jìn)行脅迫，研究外源Cu2+脅迫對大豆丙二醛MDA含量、抗氧化酶活性超氧化物歧化酶SOD、過氧化氫酶POD和根莖干鮮質(zhì)量地上干鮮質(zhì)量和地下干鮮質(zhì)量的影響。結(jié)果說明，隨著Cu2+脅迫濃度的增加，MDA含量呈現(xiàn)上升趨勢;對2種抗氧化酶的活性影響顯著，但活性影響方向不一致，顯著降低SOD活性，增強(qiáng)POD活性，各Cu2+處理下SOD活性與同期對照組15d相比降低1.90%19.5

2、5%，POD活性與同期對照組15d相比增強(qiáng)31.36%49.45%;Cu2+脅迫顯著降低大豆幼苗地上干質(zhì)量、地上鮮質(zhì)量、地下干質(zhì)量、地下鮮質(zhì)量、總鮮質(zhì)量、總干質(zhì)量，與對照組相比，400g/g濃度的Cu2+脅迫分別下降了55.58%、64.79%、60.31%、85.42%、57.46%、74.79%。Cu2+脅迫引起丙二醛、抗氧化酶和根莖干鮮質(zhì)量的顯著變化，抑制大豆幼苗的正常生長，丙二醛是Cu2+脅迫的重要表征指標(biāo)，研究為大豆幼苗的Cu2+毒害機(jī)理提供依據(jù)。關(guān)鍵詞：Cu2+脅迫;活性氧;抗氧化酶;生物量;大豆中圖分類號：S565.101文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1002-1302202112-0

3、089-04Cu2+是植物體生長必需的微量元素，參與植物體電子傳遞和光合作用，在植物的正常生長發(fā)育過程中起著重要的作用，但植物組織中過量的Cu2+會對植物產(chǎn)生毒害作用。有研究報道，受到Cu2+毒害的植物植株增長減少、光合作用減弱、礦物質(zhì)元素攝入量下降1-3。植物體攝入過量的重金屬Cu2+會使植物活性氧reactiveoxygenspecies，簡稱ROS的產(chǎn)生與去除失衡，導(dǎo)致植物體活性氧的積累進(jìn)而抑制植物生長并對植物產(chǎn)生毒害作用?；钚匝醍a(chǎn)生后，會使植物器官中的膜脂發(fā)生過氧化，產(chǎn)生過氧化產(chǎn)物丙二醛malondialdehyde，簡稱MDA【4】。Liu等在玉米和水稻中研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的Cu2+能

4、夠增加植物不同組織的丙二醛含量5-6。植物可通過增加抗氧化酶、在根中對重金屬進(jìn)行螯合等協(xié)調(diào)機(jī)制承受一定程度的Cu2+脅迫7-8。這些協(xié)調(diào)機(jī)制中，抗氧化防御系統(tǒng)在降低植物Cu2+毒害方面起著重要的作用9-10。抗氧化防御系統(tǒng)通過相關(guān)酶促和非酶促去除系統(tǒng)的啟動，以減輕或消除活性氧積累對植物的傷害，酶促系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶superoxidedismutase，簡稱SOD、過氧化氫酶catalase，簡稱CAT、過氧化物酶peroxidase，簡稱POD、抗壞血酸過氧化物酶ascorbataperoxidase，簡稱APX和谷胱甘肽復(fù)原酶glutathionereductase，簡稱GR，非酶

5、促反應(yīng)主要包括抗壞血酸ascorbicacid，簡稱AsA、類胡蘿卜素carotenoid，簡稱Car以及一些含巰基的低分子化合物等11-12。Shashi等在鷹嘴豆和甘藍(lán)型油菜中研究發(fā)現(xiàn)，Cu2+脅迫能夠增加抗氧化酶活性13-14。Liu等在玉米中研究發(fā)現(xiàn)低濃度的Cu2+脅迫增加過氧化物酶活性，高濃度的Cu2+脅迫降低過氧化物酶活性【5】。近年來，隨著工業(yè)生產(chǎn)、礦井開采和城市活動使得農(nóng)業(yè)水源和土壤中富集大量金屬Cu2+，Cu2+脅迫已成為導(dǎo)致作物減產(chǎn)和品質(zhì)下降的主要因素之一15。本研究通過測定不同濃度Cu2+處理下大豆幼苗丙二醛含量、酶活性和生物量的變化，探討Cu2+對大豆幼苗生長和抗氧化酶

6、的影響，以期為深入說明植物耐Cu2+機(jī)理提供一定的理論依據(jù)。1材料與方法1.1試驗材料與生長環(huán)境試驗品種為齊黃35審定編號：國審豆No.2021005，于2021年1012月在國家農(nóng)業(yè)智能裝備工程技術(shù)研究中心小湯山國家精準(zhǔn)農(nóng)業(yè)示范基地116.44°E，40.18°N中進(jìn)行盆栽培養(yǎng)。挑選顆粒飽滿、大小均一的大豆種子，用1%NaClO溶液消毒15min，之后用去離子水沖洗3次，用吸水濾紙吸干水分，挑選完好無損的大豆種子種于盆中，盆中預(yù)先用水澆透，每盆種植10粒種子，種子上覆蓋3cm厚的干土基質(zhì)?；ㄅ柚睆?5cm，高20cm，每個花盆裝入6kg的土基質(zhì)土與育苗基質(zhì)按比例混合。盆土

7、基質(zhì)根底肥力為有機(jī)質(zhì)含量為52.6%，全氮含量為1.47%，速效鉀含量為143mg/kg，有效磷含量為13.1mg/kg，pH值為5.5。20d后挑選長勢一致的幼苗，每盆留苗4株，共24盆96株。試驗期間，溫室內(nèi)溫度保持在1525，相對濕度RH為60%75%，日間光合有效輻射PAR為400800mol/m2·s。1.2Cu2+脅迫處理Cu2+脅迫參照GB156181995?土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)?中3個等級標(biāo)準(zhǔn)值設(shè)置16。采用分析純CuSO4·5H2O制備濃度為0、20、200、400g/g的Cu2+處理液備用。試驗中設(shè)置4個Cu2+梯度表1，每個梯度均設(shè)置6個平行試驗，即4個處

8、理6個重復(fù)24盆盆栽大豆幼苗。以上處理分別在Cu2+脅迫后5、10、15d，摘取大豆幼苗頂部第35葉位完全成熟的葉片，立即帶回實驗室進(jìn)行MDA含量和抗氧化酶SOD、POD活性測定。在Cu2+脅迫處理15d進(jìn)行生物量的測定。1.3測定指標(biāo)和數(shù)據(jù)分析1.3.1MDA含量和抗氧化酶活性測定MDA含量測定采用趙世杰等改進(jìn)方法17。SOD活性測定采用NBT法nitrotetrazoliumbluechloride，氯化硝基四氮唑藍(lán)法18，POD活性采用愈創(chuàng)木酚法19測定。指標(biāo)測定時，每個處理6次重復(fù)，取平均值。1.3.2生物量測定處理15d后，不同處理下的大豆幼苗通過去離子水沖洗干凈，并用吸水紙吸干附著

9、于樣品上的水分，用剪刀將大豆樣品分為地上和地下局部。用分析天平分別稱取大豆樣品地上局部和根系的鮮質(zhì)量g/株，然后于105下殺青0.5h，再在80烘干至恒質(zhì)量，分別稱取大豆樣品地上局部和根系的干質(zhì)量g/株。1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用Origin軟件制作圖形，SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析ANOVA，數(shù)據(jù)顯著性差異運(yùn)用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較=0.05。2結(jié)果與分析2.1Cu2+脅迫對大豆幼苗MDA含量的影響MDA含量隨時間的延長呈先升高后下降趨勢。不同Cu2+脅迫處理下大豆幼苗葉片MDA含量差異顯著，Cu2+脅迫能夠顯著增加大豆幼苗葉片MDA含量。由圖1可知，處理5d，Cu2+脅迫濃

10、度在200g/g下，大豆幼苗MDA含量與CK相比增幅較小，差異不顯著P>0.05;Cu2+脅迫濃度在400g/g下，大豆幼苗MDA含量顯著升高，與CK相比增加了62.76%。處理10d，各Cu2+脅迫處理下大豆幼苗MDA含量與CK相比差異均到達(dá)顯著水平P>0.05，20、200、400g/g下MDA含量與CK相比分別增加了20.6%、54.85%、62.76%，其中Cu2+脅迫濃度在400g/g下MDA含量到達(dá)最大值7.2mmol/g。處理15d，各Cu2+脅迫處理下大豆幼苗MDA含量與處理10d相比有所下降，但與CK相比，各處理均到達(dá)顯著水平P>0.05，20、200、40

11、0g/g下MDA含量與CK相比分別增加了23.36%、56.53%、61.43%。MDA含量隨Cu2+脅迫濃度的增加而顯著增加，說明外施Cu2+能誘導(dǎo)大豆幼苗MDA含量的升高，MDA含量高說明細(xì)胞膜脂過氧化程度增加，植物細(xì)胞膜受到的傷害增大。2.2Cu2+脅迫對大豆幼苗抗氧化酶活性的影響2.2.1對大豆幼苗SOD活性的影響隨著Cu2+脅迫濃度和時間的延長，Cu2+脅迫處理能夠顯著降低大豆葉片SOD活性圖2-A。處理5d后，Cu2+脅迫濃度在400g/g下SOD活性與CK相比差異到達(dá)顯著水平P>0.05，大豆幼苗SOD活性降低了19.07%，其他Cu2+脅迫濃度下SOD活性與CK相比差異不

12、顯著。處理10d，Cu2+脅迫濃度在20g/g下SOD活性與CK相比差異不顯著P>0.05;Cu2+脅迫濃度在200g/g和400g/g下SOD活性與CK相比差異到達(dá)顯著水平，與CK相比SOD活性分別降低了20.05%和24.86%，其中Cu2+脅迫濃度400g/g下SOD活性最小，為116.96U/g。處理15d，各Cu2+脅迫濃度對大豆幼苗SOD活性的影響與處理10d類似，Cu2+脅迫濃度在20g/g下SOD活性與CK相比降低了1.90%，但差異未到達(dá)顯著水平P>0.05;在200g/g和400g/g下SOD活性與CK相比分別降低了19.78%和19.55%。2.2.2對大豆幼

13、苗POD活性的影響隨著Cu2+脅迫處理時間的延長，Cu2+脅迫處理能夠顯著增加大豆葉片POD活性圖2-B。處理5d，各Cu2+脅迫下大豆幼苗POD活性與CK相比差異不顯著P>0.05。處理10d，各Cu2+脅迫下大豆幼苗POD活性與CK相比差異均到達(dá)顯著水平P>0.05，Cu2+脅迫濃度在20、200、400g/g下SOD活性與CK相比分別增加了25.61%、34.49%、42.4%。處理15d，各Cu2+脅迫濃度對大豆幼苗POD活性的影響與CK相比差異均到達(dá)顯著水平P>0.05，分別增加了31.36%、33.94%和49.45%，其中Cu2+脅迫濃度在400g/g下POD活

14、性到達(dá)最大，為266.81U/g。2.3Cu2+脅迫對大豆幼苗生長和生物量的影響2.3.1對大豆幼苗生長的影響Cu2+處理對大豆幼苗造成的毒害病癥較明顯，主要表現(xiàn)在莖稈和葉脈會呈現(xiàn)黃褐色毒害病癥圖3。隨著Cu2+處理時間的延長毒害病癥從植物形態(tài)學(xué)下端向上端蔓延，對葉片的毒害是從葉片與葉柄連接處開始向整個葉的主脈和側(cè)脈延伸擴(kuò)展。Cu2+處理后10d，CK與20g/gCu2+脅迫濃度下大豆幼苗生長狀況類似;200g/gCu2+脅迫濃度下大豆幼苗基部莖稈呈現(xiàn)黃褐色病斑，局部植株中部葉片由葉柄向主葉脈蔓延黃褐色病斑;400g/gCu2+脅迫濃度下嚴(yán)重影響大豆生長，與對照組相比，莖稈纖細(xì)、植株矮小，Cu

15、2+毒害蔓延至新生葉片，黃褐色病斑從主葉脈蔓延到側(cè)脈，嚴(yán)重的會覆蓋整個大豆葉片，大豆植株基部葉片嚴(yán)重畸形、萎蔫。2.3.2對大豆幼苗生物量的影響由表2可知，Cu2+脅迫處理顯著抑制大豆幼苗的生長。Cu2+脅迫濃度在20g/g時，主要抑制大豆幼苗地上局部的生長，對幼苗地下鮮質(zhì)量和總鮮質(zhì)量的影響不顯著P>0.05，與CK相比，對地上鮮質(zhì)量、地上干質(zhì)量、根干質(zhì)量和總干質(zhì)量影響顯著，分別減少了21.49%、32.39%、33.33%、33.61%。而Cu2+脅迫濃度在200g/g時，對大豆幼苗地上局部和地下局部生長均有抑制作用，且差異到達(dá)顯著水平，與CK相比地上鮮質(zhì)量、地上干質(zhì)量、地下鮮質(zhì)量、地

16、下干質(zhì)量、總鮮質(zhì)量、總干質(zhì)量分別減少了38.43%、54.93%、38.13%、70.83%、38.18%、62.18%。隨著脅迫濃度的增加，Cu2+脅迫對大豆幼苗地上和地下局部生長的抑制效果越明顯，Cu2+脅迫濃度在400g/g下，地上鮮質(zhì)量、地上干質(zhì)量、地下鮮質(zhì)量、地下干質(zhì)量、總鮮質(zhì)量、總干質(zhì)量最小，與CK相比分別減少了55.58%、64.79%、60.31%、85.42%、57.46%、74.79%。3討論與結(jié)論銅作為植物正常生命活動所必需的微量營養(yǎng)元素，廣泛參與各種生命活動20。然而過量的銅含量將影響植物細(xì)胞代謝和離子平衡，對植物產(chǎn)生毒害作用，進(jìn)而影響植物的正常生長10，21。正常情況

17、下，植物體內(nèi)存在活性氧去除系統(tǒng)，使植物在生命活動中產(chǎn)生的活性氧處于產(chǎn)生和消除的動態(tài)平衡，從而使植物免受活性氧傷害。當(dāng)植物處理脅迫逆境時，活性氧動態(tài)平衡被打破，產(chǎn)生大量活性氧，促使植物脂膜和細(xì)胞器膜的嚴(yán)重過氧化，MAD含量升高，進(jìn)而導(dǎo)致光合色素含量下降，影響植物的光合作用，因此MDA含量一定程度上能反映植物體活性氧的含量22。短時5d低濃度的Cu2+脅迫20200g/g與同期對照組相比，MDA含量變化不顯著，但隨著時間的延長1015d，低濃度的Cu2+脅迫20200g/g將會引起MDA含量的顯著變化;而短時5d高濃度的Cu2+脅迫400g/g與同期對照組相比，MDA含量差異到達(dá)顯著水平。這可能是

18、因為短時低濃度Cu2+脅迫并未破壞植物體內(nèi)活性氧動態(tài)平衡，但隨著脅迫時間的延長，Cu2+離子脅迫打破植物體內(nèi)活性氧動態(tài)平衡，導(dǎo)致活性氧大量產(chǎn)生，MAD含量升高;而高濃度的Cu2+脅迫迅速破壞植物體內(nèi)活性氧動態(tài)平衡，引起MDA含量的顯著升高。本研究中發(fā)現(xiàn)，隨著Cu2+脅迫處理時間的延長，MDA含量逐漸升高圖1，類似的研究結(jié)論也在玉米【5】、水稻【6】、小麥23、棉花24、竹子25和油菜14中發(fā)現(xiàn)，因而膜脂過氧化可能是Cu2+毒害植物的重要途徑，而MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物，因此MDA是表征Cu2+毒害的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果說明，Cu2+脅迫能夠顯著增強(qiáng)POD的活性，這與一些學(xué)者在玉米26、穿心蓮2

19、7的研究結(jié)果一致;低濃度的Cu2+脅迫對SOD活性的影響不顯著，高濃度的Cu2+脅迫顯著降低SOD活性，這與一些學(xué)者在水稻和空心連中關(guān)于Cu2+脅迫對SOD活性低促高抑的結(jié)論不一致6，28，這可能與植物生長環(huán)境、脅迫處理時間和研究作物品種有關(guān)。Cu2+脅迫處理下，2種抗氧化酶SOD和POD活性表現(xiàn)不一，原因是銅對抗氧化酶活性的影響可能同時表現(xiàn)為促進(jìn)和抑制2個方面。一方面，過量Cu2+明顯提高POD在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，誘導(dǎo)同工酶的表達(dá)，以及對酶蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行加工與修飾，提高POD的總活性29;另一方面，Cu2+脅迫下產(chǎn)生的活性氧可以破壞SOD合成的DNA、RNA和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而破壞SOD的表達(dá)系

20、統(tǒng)和結(jié)構(gòu)，降低酶的活性30。關(guān)于20400g/gCu2+脅迫是否促進(jìn)POD同工酶表達(dá)破壞合成SOD的相關(guān)DNA、RNA和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是進(jìn)一步研究的方向。本研究以不同濃度0、20、200、400g/gCu2+對大豆幼苗進(jìn)行脅迫處理，研究外源Cu2+對大豆幼苗的毒害機(jī)理，分別測定脅迫處理后5、10、15d大豆幼苗MDA含量、SOD活性、POD活性和根莖干鮮質(zhì)量等指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)隨著Cu2+脅迫濃度的增加及脅迫時間的延長，MDA含量升高、SOD活性下降、POD活性升高、根莖干鮮質(zhì)量減少。說明Cu2+脅迫抑制大豆幼苗的正常生長，MDA是表征Cu2+毒害的重要指標(biāo)，為大豆幼苗的Cu2+毒害機(jī)理提供依據(jù)。參考文獻(xiàn)

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